지역 사회 기반의 설정에서 획득 샘플의 신속한 분별 및 전체 혈액 성분의 분리

이 절차의 전반적인 목표는 빠른 눈 처리량, 전혈 샘플의 동시 처리를 가능하게 하는 간소화된 프로토콜을 제공하는 것입니다. 비임상 환경에서 액포 처리는 D-N-A-R-N-A 말초 혈액 단핵 세포 또는 pbmc 혈청의 고품질 분획과 혈장 및 적혈구의 잔류 분획을 효율적으로 분리할 수 있도록 중첩 방식으로 수행됩니다. 공정은 혈청 액포의 원심분리, 피알 튜브의 DNA 분리 원심분리를 위해 액포테이너를 포함하는 하나의 피알에서 부분 표본을 제거하는 것으로 시작됩니다.

그런 다음 DNA 분리 후 DNA 분리가 완료되고 K2 EDTA vacutainer에서 RNA 유래 RNA 분리가 발생할 수 있습니다. 각 액포의 혈액은 해당 필터를 통과하고 PBS로 세척한 다음 액포자가 포함된 피알로 돌아가는 RNA 안정화제로 처리합니다. 잔류 플라즈마를 제거하고 단핵층을 PBS로 세척합니다.

관이 회전하는 동안 잔류 적혈구를 수집하고 분리된 혈청을 분취합니다. 마지막으로, pbmc는 세포 동결 매체에 보존됩니다. 궁극적으로, 채취 후 2시간 이내에 고품질의 신선한 혈액 분획을 생산할 수 있으며, 모든 분석 준비가 된 검체는 2일 이내에 사용할 수 있습니다.

기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 비임상 환경에서 절차를 동시에 수행할 수 있으므로 마이크로어레이 후성유전학적 실시간 R-T-P-C-R 및 유세포 분석을 포함한 다양한 다운스트림 응용 분야에서 2일 이내에 시작 물질을 생산할 수 있다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 전혈 샘플 처리를 시작하는 실험실 관리자인 Amy Weckl이 될 것입니다. 버퍼, 원심분리기 및 열 블록이 모두 준비되었는지 확인하십시오.

샘플 추적 시트에 진공 배송 시간을 문서화하십시오. 샘플을 받은 후 혈청 분리를 문서화합니다. 검체 로그의 시작 시간: 브레이크와 가속을 끈 상태에서 7ml 혈청 진공 청소기를 원심분리하여 즉시 처리를 시작합니다.

에어로졸 캡이 있는 스윙 버킷 로터를 사용하여 세럼 진공 청소기를 원심분리하는 동안 섭씨 1300GS 4도에서 20분 동안 사용합니다. BSL 2세포 배양 후드에서 DNA 분리 시작 시간을 문서화합니다. 피알 젤이 들어있는 진공 용기를 5 번 뒤집고 진공 용기 중 하나의 상단에서 200 마이크로 리터의 전혈을 20 마이크로 리터의 프로테아제 분취액 2 개 각각에 추가합니다.

프로테아제와 혈액 마이크로 원심분리기 튜브를 후드에 그대로 두고 진공 용기가 들어 있는 콜의 원심분리를 계속합니다. 원심분리 전. 채혈 후 2시간 이내여야 하는 PBMC 격리 시작 시간을 문서화합니다.

에어로졸 밀폐 용기에 이미 있는 진공 용기가 포함된 FI 호출을 8-10회 반전합니다. 그런 다음 섭씨 30Gs에서 1600분 동안 브레이크 및 가속을 끈 상태에서 진공 흡입기를 원심분리합니다. 후드의 DNA 분리 샘플로 돌아가서 각 프로테아제 및 혈액 마이크로 원심분리 튜브에 200마이크로리터의 완충액을 추가합니다.

튜브에 캡을 씌우고 후드에서 제거합니다. 그런 다음 15초 동안 소용돌이치게 합니다. 와류 후 즉시 플래시, 스핀 샘플.

DNA가 Ellucian의 열에서 암시될 때까지 동반된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 DNA 분리를 진행합니다. 참가자당 두 개의 열에서 DNA를 풀링하여 참가자당 총 800마이크로리터의 수율을 얻었습니다. 백혈구 RNA 분리 시작 시간을 문서화합니다.

K two EDTA 진공 청소기의 고무 격막에 전사 스파이크로 뚫습니다. K two EDTA 튜브 시스템을 조립한 후 나중에 사용할 수 있도록 피복과 나사 캡을 보관하십시오. 금속 주걱의 끝을 사용하여 바늘을 안전하게 풀고 바늘을 빈 10ml 배출 혈액 채취 튜브에 삽입합니다.

K two EDTA vacutainer 필터 수신기 튜브 어셈블리를 뒤집어 설정을 완료합니다 여과 및 A PBS 세척 후 새 10ml 주사기를 사용하여 RNA 안정화제 3ml를 회수합니다. RNA 안정화제가 부착된 상태로 유지되도록 필터를 세척합니다. 그런 다음 플런저를 후퇴시키지 않고 필터에서 주사기를 분리합니다.

전사 스파이크에서 유지된 덮개와 나사 캡으로 필터 입구와 출구를 밀봉하고 필터를 RNA 안정화제로 포화 상태로 둡니다. RA 분리가 완료될 때까지 필터를 섭씨 영하 80도에서 최소 2시간 동안 보관하십시오. 액포가 BSL 2 후드로 되돌아 오면 스토퍼를 제거하고 혈청 피펫을 사용하여 단핵층에 가까이 가지 않고 상단 플라즈마 층의 1.5 밀리리터를 빼냅니다.

두 개의 진공 포장기에서 플라즈마를 5ml cryo 바이알로 옮깁니다. 그런 다음 수집된 볼륨을 기록합니다. 혈청학적 피펫을 사용하여 나머지 플라즈마와 단핵층을 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다.

그런 다음 이전에 준비된 XPBS 1개를 충분히 추가하여 원뿔형 튜브의 총 부피를 최대 15ml까지 가져옵니다. 튜브의 뚜껑을 닫고 5번 뒤집습니다. 그런 다음 섭씨 300GS 22도에서 15분 동안 브레이크 및 가속을 끈 상태에서 튜브를 원심분리합니다.

후드에 진공 용기가 들어 있는 파이브로 돌아가서 적혈구 또는 적혈구를 수집합니다. 5인치 및 3/4인치 페이스트리 피펫을 사용하여 주위를 빙빙 돌리고 파이알 젤 층의 바깥쪽을 풀고 제거합니다. 혈청학 피펫을 사용하여 적혈구를 수집하여 5ml cryo 바이알로 옮깁니다.

그런 다음 볼륨을 기록합니다. 다음으로, 플라즈마 및 RBC 극저온 바이알을 제어 속도 동결 용기로 옮기고 최소 24시간 동안 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. 24시간 후 샘플을 극저온 상자로 옮기고 장기 보관을 위해 섭씨 영하 80도로 되돌립니다.

원심분리가 완료되면 원뿔형 튜브를 후드로 되돌리고 액체를 흡인하여 펠릿을 방해하지 않고 500마이크로리터의 PBS를 남깁니다. XPBS 1개를 추가하여 부피를 10밀리리터로 늘리고 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 튜브를 부드럽게 덮고 다섯 번 뒤집습니다.

그런 다음 브레이크와 가속을 끈 상태에서 섭씨 300GS 22도에서 10분 동안 샘플을 원심분리합니다. 원심분리 후, 액포의 상단 혈청층을 2mL cryo 바이알로 분취하고 부피를 문서화합니다. 4개의 극저온 바이알과 200마이크로리터를 극저온 바이알에 분취합니다.

1000 마이크로 리터 1 개를 극저온 바이알 2 개. 그런 다음 남은 부피를 극저온 바이알 3과 4로 나눕니다. 극저온 바이알을 극저온 상자로 옮기고 장기 보관을 위해 섭씨 영하 80도로 보관하십시오.

그리고 냉동실 시작 시간을 문서화하십시오. PBMC 격리를 계속합니다. 원심분리 후 샘플을 후드로 되돌리고 펠릿을 방해하지 않고 가능한 한 많은 상층액을 흡입합니다.

우리는 펠릿을 2.5 밀리리터의 PBMC에 현탁시킵니다. 중간 정도. 2.5ml의 PBMC를 넣고 DMSO와 RPMI를 포함하는 배지 2를 동결합니다.

미리 준비된 세포 용액에 배지를 달고 샘플을 부드럽게 와류시킵니다. 그런 다음 10마이크로리터의 세포 용액을 마이크로 원심분리기 튜브에 분취합니다. 마이크로 원심분리기 튜브에 10마이크로리터의 0.4% 트립 팬 블루 스테인을 넣고 여러 번 피펫팅하여 용액을 혼합합니다.

다음으로, 혼합물 10마이크로리터를 세포 계수 챔버에 피펫팅합니다. 혼합 후 3분 이내에 슬라이드를 세포 카운터에 밀어 넣습니다. 셀을 확대하고 초점을 맞춥니다.

그런 다음 셀 수를 선택하여 A-P-B-M-C 수를 구합니다. 실행 가능한 PBMC 수가 밀리리터당 300만 개 세포 이상인 경우, 샘플을 밀리리터당 최소 300만 개 세포 농도의 최대 5개의 극저온 바이알로 분취합니다. 각각은 시료 로그에 cryo 바이알당 세포 수를 문서화합니다.

실행 가능한 PBMC 수가 밀리리터당 300만 셀 미만인 경우 진행 방법에 대해서는 함께 제공되는 텍스트 프로토콜을 참조하십시오. 마지막으로, 극저온 바이알을 제어된 속도 동결 용기로 옮기고 최소 24시간 동안 섭씨 영하 80도에 놓습니다. 24시간 후, 극저온 바이알을 극저온 상자로 옮기고 장기 보관을 위해 상자를 액체 질소 탱크의 증기상에 놓습니다.

표본 로그에 냉동고 시작 시간을 문서화하십시오. 백혈구 RNA 분리 및 필터 처리 방법은 모세관 전기영동으로 인한 이 겔 이미지를 생성했습니다. 두 개의 뚜렷한 띠가 ATT s 및 28 s 리보솜 RNA를 나타내는 최소한의 분해로 생성되었습니다.

이 절차를 시도하는 동안 정확한 기록을 유지하는 것이 중요하다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 처음부터 부피, 농도, 품질, 바코드 및 보관 위치를 포함한 모든 극저온 바이알 정보를 저장할 수 있는 데이터베이스를 개발하는 것이 좋습니다. 샘플 구성에 대한 추가 권장 사항은 텍스트 프로토콜에서 찾을 수 있습니다.