Name: 지역 사회 기반의 설정에서 획득 샘플의 신속한 분별 및 전체 혈액 성분의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: 학습하세요 전혈 샘플에서 DNA, RNA, 혈장, PBMC를 신속하게 분리하는 최적화된 프로토콜입니다. 원심분리와 RNA 안정화를 활용하여 비임상 환경에서 고품질 혈액 성분을 효율적으로 얻는 방법을 탐색하세요.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

우리는 세부 사항에 대한 귀중한 관심과 채혈 처리에 시간을 할애한 Henriette Mair-Meijers에게 감사드립니다. 나탈리 제임슨 키슬링(Natalie Jameson Kiesling)의 그래픽 디자인 전문 지식에 감사드립니다. 또한 여기에 언급된 제조업체(Qiagen(Valencia, CA), BD Biosciences(San Jose, CA), Life Technologies(Grand Island, NY))가 설명된 대로 제품 사용을 공개할 수 있도록 승인해 주셔서 감사합니다. 이 작업을 위한 자금은 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 상 번호 DA022720, RC1MH088283 및 DA022720-05-S1에서 아낌없이 제공했습니다.

<ol><li>Hernandez, M. E., Martinez-Fong, D., Perez-Tapia, M., Estrada-Garcia, I., Estrada-Parra, S., Pavon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+effect+of+selective+serotonin-reuptake+inhibitors+on+lymphocyte+subsets+in+patients+with+a+major+depressive+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Neuropsychopharmacol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the effect of selective serotonin-reuptake inhibitors on lymphocyte subsets in patients with a major depressive disorder.</a> Eur Neuropsychopharmacol. 20, 88-95 (2010).</li>
<li>Weigelt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TREM-1+and+DAP12+expression+in+monocytes+of+patients+with+severe+psychiatric+disorders+EGR3%2C+ATF3+and+PU.1+as+important+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Immun%22%5BJournal%5D)">TREM-1 and DAP12 expression in monocytes of patients with severe psychiatric disorders EGR3, ATF3 and PU.1 as important transcription factors.</a> Brain Behav Immun. 25, 1162-1169 (2011).</li>
<li>Robertson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+subset+differences+in+patients+with+chronic+fatigue+syndrome%2C+multiple+sclerosis+and+major+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte subset differences in patients with chronic fatigue syndrome, multiple sclerosis and major depression.</a> Clin Exp Immunol. 141, 326-332 (2005).</li>
<li>Rotter, A., Asemann, R., Decker, A., Kornhuber, J., Biermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orexin+expression+and+promoter-methylation+in+peripheral+blood+of+patients+suffering+from+major+depressive+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22J+Affect+Disord%22%5BJournal%5D)">Orexin expression and promoter-methylation in peripheral blood of patients suffering from major depressive disorder.</a> J Affect Disord. 131, 186-192 (2011).</li>
<li>Klengel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allele-specific+FKBP5+DNA+demethylation+mediates+gene-childhood+trauma+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Allele-specific FKBP5 DNA demethylation mediates gene-childhood trauma interactions.</a> Nat Neurosci. 16, 33-41 (2013).</li>
<li>Segman, R. H., Shefi, N., Goltser-Dubner, T., Friedman, N., Kaminski, N., Shalev, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+blood+mononuclear+cell+gene+expression+profiles+identify+emergent+post-traumatic+stress+disorder+among+trauma+survivors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Peripheral blood mononuclear cell gene expression profiles identify emergent post-traumatic stress disorder among trauma survivors.</a> Mol Psychiatry. 10, 500-513 (2005).</li>
<li>Smith, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cohort+Profile%3A+Generation+Scotland%3A+Scottish+Family+Health+Study+%28GS%3ASFHS%29.+The+study%2C+its+participants+and+their+potential+for+genetic+research+on+health+and+illness%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">Cohort Profile: Generation Scotland: Scottish Family Health Study (GS:SFHS). The study, its participants and their potential for genetic research on health and illness.</a> Int J Epidemiol. 42, 689-700 (2013).</li>
<li>Mallone, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+preservation+of+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+analysis+of+islet+antigen-reactive+T+cell+responses%3A+position+statement+of+the+T-Cell+Workshop+Committee+of+the+Immunology+of+Diabetes+Society%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Isolation and preservation of peripheral blood mononuclear cells for analysis of islet antigen-reactive T cell responses: position statement of the T-Cell Workshop Committee of the Immunology of Diabetes Society.</a> Clin Exp Immunol. 163, 33-49 (2011).</li>
<li>Duvigneau, J. C., Hartl, R. T., Teinfalt, M., Gemeiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delay+in+processing+porcine+whole+blood+affects+cytokine+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Delay in processing porcine whole blood affects cytokine expression.</a> J Immunol Methods. 272, 11-21 (2003).</li>
<li>Debey, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+different+isolation+techniques+prior+gene+expression+profiling+of+blood+derived+cells%3A+impact+on+physiological+responses%2C+on+overall+expression+and+the+role+of+different+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogenomics+J%22%5BJournal%5D)">Comparison of different isolation techniques prior gene expression profiling of blood derived cells: impact on physiological responses, on overall expression and the role of different cell types.</a> Pharmacogenomics J. 4, 193-207 (2004).</li>
<li>Uddin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+and+immune+function+profiles+associated+with+posttraumatic+stress+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Epigenetic and immune function profiles associated with posttraumatic stress disorder.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 9470-9475 (2010).</li>
<li>Kessler, R. C., Wang, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+descriptive+epidemiology+of+commonly+occurring+mental+disorders+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Public+Health%22%5BJournal%5D)">The descriptive epidemiology of commonly occurring mental disorders in the United States.</a> Annu Rev Public Health. 29, 115-129 (2008).</li>
<li>Qiagen. QIAamp® DNA Mini and Blood Mini Handbook. , Valencia, California, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=67893a91-946f-49b5-8033-394fa5d752ea">https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=67893a91-946f-49b5-8033-394fa5d752ea</a> (2010).</li>
<li>Thermo Scientific. NanoDrop 1000 Spectrophotometer. , Waltham, Massachusetts, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.nanodrop.com/Library/nd-1000-v3.8-users-manual-8">http://www.nanodrop.com/Library/nd-1000-v3.8-users-manual-8</a> (2010).</li>
<li>Life Technologies. LeukoLOCK™ Total RNA Isolation System. , Grand Island, New York, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.ambion.com/techlib/misc/leuko_iso.pdf">http://www.ambion.com/techlib/misc/leuko_iso.pdf</a> (2011).</li>
<li>Life Technologies. Countess™ Automated Cell Counter. , Grand Island, New York, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.lifetechnologies.com/content/dam/LifeTech/migration/files/cell-analysis/pdfs.par.5257.file.dat/mp10227-countess">http://www.lifetechnologies.com/content/dam/LifeTech/migration/files/cell-analysis/pdfs.par.5257.file.dat/mp10227-countess</a> (2009).</li>
<li>Life Technologies. Alternative Protocol for Extraction of RNA from Cells Captured on LeukoLOCK™ Filters Using TRI Reagent®. , Grand Island, New York, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/nucleic-acid-purification-and-analysis/rna-protocol/alternative-protocol-extraction-of-rna-from-cells-captured-on-leukolock-filters-using-tri-reagent.html">http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/nucleic-acid-purification-and-analysis/rna-protocol/alternative-protocol-extraction-of-rna-from-cells-captured-on-leukolock-filters-using-tri-reagent.html</a> (2011).</li>
<li>Life Technologies. DNA-free™ Kit. , Grand Island, New York, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/cms_055739.pdf">http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/cms_055739.pdf</a> (2012).</li>
<li>Agilent Technologies. Agilent RNA 6000 Nano Kit Guide. , Santa Clara, California, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.genomics.agilent.com/files/Manual/G2938-90034_KitRNA6000Nano_ebook.pdf">http://www.genomics.agilent.com/files/Manual/G2938-90034_KitRNA6000Nano_ebook.pdf</a> (2006).</li>
<li>Koenen, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLC6A4+methylation+modifies+the+effect+of+the+number+of+traumatic+events+on+risk+for+posttraumatic+stress+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Depress+Anxiety%22%5BJournal%5D)">SLC6A4 methylation modifies the effect of the number of traumatic events on risk for posttraumatic stress disorder.</a> Depress Anxiety. 28, 639-647 (2011).</li>
<li>Walsh, K., Uddin, M., Soliven, R., Wildman, D. E., Bradley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associations+between+the+SS+variant+of+5-HTTLPR+and+PTSD+among+adults+with+histories+of+childhood+emotional+abuse%3A+Results+from+two+African+American+independent+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J+Affect+Disord%22%5BJournal%5D)">Associations between the SS variant of 5-HTTLPR and PTSD among adults with histories of childhood emotional abuse: Results from two African American independent samples.</a> J Affect Disord. 161, 91-96 (2014).</li>
<li>Bustamante, A. C., et al. Childhood maltreatment is associated with epigenetic differences in hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis genes in the Detroit Neighborhood Health Study. American Association of Physical Anthropologists 82nd Annual Meeting, Knoxville, TN, , Comprehensive Psychiatry. (2013).</li>
<li>Sipahi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+epigenetic+variation+of+DNA+methyltransferase+genes+is+associated+with+vulnerability+to+post-traumatic+stress+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Psychol+Med%22%5BJournal%5D)">Longitudinal epigenetic variation of DNA methyltransferase genes is associated with vulnerability to post-traumatic stress disorder.</a> Psychol Med. 44, 3165-3179 (2014).</li>
<li>Uddin, M., Koenen, K. C., Aiello, A. E., Wildman, D., de los Santos, R., Galea, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+and+inflammatory+marker+profiles+associated+with+depression+in+a+community-based+epidemiologic+sample%5BTitle%5D)+AND+%22Psychol+Med%22%5BJournal%5D)">Epigenetic and inflammatory marker profiles associated with depression in a community-based epidemiologic sample.</a> Psychol Med. 41, 997-1007 (2011).</li>
<li>Uddin, M., et al. Post-traumatic stress disorder is associated with immunosenescent T cell phenotypes in the Detroit Neighborhood Health Study. 3rd North American Congress of Epidemiology, Montreal, QC, , (2011).</li>
<li>Uddin, M., et al. Post-traumatic stress disorder is associated with immunosenescent T cell phenotypes in the Detroit Neighborhood Health Study. 101st Annual Conference of the American Psychopathological Association, New York, NY, , (2011).</li>
<li>Uddin, M. Biological signatures of post-traumatic stress disorder in the Detroit Neighborhood Health Study. 9th International Conference on Urban Health, New York Academy of Medicine, , (2010).</li>
<li>Aiello, A. E. Cytomegalovirus antibodies as a marker of immunosenescence in the Detroit Neighborhood Health Study. 9th International Conference on Urban Health, New York Academy of Medicine, , (2010).</li>
<li>Bustamante, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBustamante%2C+AC+%22Distinct+gene+expression+profiles+characterize+lifetime+PTSD+and+childhood+maltreatment+in+the+Detroit+Neighborhood+Health+Study%22">Distinct gene expression profiles characterize lifetime PTSD and childhood maltreatment in the Detroit Neighborhood Health Study</a>. , International Society for Traumatic Stress Studies. Philadelphia, PA. (2013).</li>
</ol>

저자는 그들이 더 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.

우리는 성공적으로 디트로이트 환경 건강 연구에 1,600 개 이상의 전체 혈액 샘플을 처리하기 위해 적용된 간소화 된 프로토콜을 설명했다. 이들 기술의 대부분은 기존 문헌에서 이용할 수 있지만, 각 단계 사이에 정확하게 타이밍 변화를 포함하여 단계별 편집, 성공적 하류 광범위한 응용으로 생물학적 시료의 종류를 생산 최적화 효율적인 프로토콜이 반영 DNA 메틸화, mRNA 발현과 면역 학적 분석을 포함. 이 시편은 이미 국가 회의 11,20,21,23,24,29에서 동료 검토 문헌에 출판 및 / 또는 제출 된 결과를있는 실험의 다양한 테스트되었습니다. 이 프로토콜은 따라서 DNHS 유사한 인구 기반 연구에서 생물 표본을 수집하고자하는 다른 연구자들의 관심을 끌 수있을 것입니다. 이러한 높은 throughp의 샘플을 처리 할 때UT 방식에서는, 모든 단계에서 정확한 기록을 유지하기 위해 매우 중요하다. 우리는 초기에 cryovial 모든 정보를 저장하는 데이터...

여러 연구와 정신 (또는 다른) 1-4 질병없이 개인간 혈액 유전자 발현, DNA 메틸화 및 세포 서브셋의 차이를 특징으로하고있다. 이러한 연구는, 그러나, 질병 - 관련 차이 때문에 환자를 치료하고자하는 질병에 대해 일반적으로 더 심한 특성을 확대 할 수있는 임상에서 얻어졌다. 때문에 "오 믹스"접근 방법의 발전으로, 지난 십 질병 유병률의 인구 기반의 추정치를 제공하기 위해, 지역 사회 및 / 또는 역학적 설정 5-7에서 생물학적 샘플을 얻는에 대한 관심의 폭발과의 폭 넓은 사진을 보았다 이러한 정신적 / 육체적 질병의 환경 적 결정. 이에 대한 주요 과제는 수집 된 표본의 신속한 처리에 대한 요구이다. 단핵 세포, frequentl 아르 키 면역 시스템 구성 요소들의 열화Y는 개인의 건강, 수집 8-10의 2 시간 후 복구에 상당한 감소와 혈액 무승부를 즉시 시작 평가하는 데 사용됩니다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 인간의 전체 혈액의 여러 구성 요소가 동시에 대도시 지역에 사는 주제의 가정에서 얻어진 샘플로부터 고립되는 최적화 된 프로토콜을 제시한다. 프로토콜은 우리의 컴파일 및 미래의 기술이 더 분리를 허용 이벤트에있는 모든 "추가"분수의 저장을 포함하여 현재 기술의 변경에 기반 / 분석한다. 다른 방법 또는 키트가 여기에 설명 된 각각의 방법, 그 윤곽의 장소에서 이용 될 수 있지만 높은 처리량 방법으로 샘플을 처리하기위한 안정적이고 효율적인 방법으로 증명되었다. 양질의 분획 (PBMC를는, DNA는 혈청 및 RNA) 신선한 혈액의 2 일 (도 1 내에서 이용 가능하다 (2)의 수집 시간과 모든 분석 준비 시험편 내에 제조 할 수있다). 이 프로토콜은 지역 사회 주거, 디트로이트 환경 건강 연구에서 테스트 디트로이트시의 성인 거주자에서 수집 된 샘플의 효율적인 처리를 가능하게하기 위해 개발되었다 (DNHS을, DA022720, RC1MH088283, DA022720-05-S1)을, 인구​​ 기반 외상 후 스트레스 장애 (PTSD) 및 기타 정신 질환의 사회적, 생물학적 결정 요인 연구. 디트로이트에서 외상 후 스트레스 장애의 유병률은 두 번 전국 평균 11, 12 이상입니다. 이 집단에서 PTSD의 생물학적 결정을 확인하는 것은이 도시의 인구 및 기타 위험이 높은 집단 (예를 들어, 군 참전 용사를 반환) 모두에서 장애 그 고통을 돕기 위해 적절한 약물 및 / 또는인지 행동 개입을 개발하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이전에 디트로이트, 미시간 웨인 주립 대학에있는 우리의 실험은, 다양한에서 파생 된 신선한 조직 샘플을 처리하는 우리의 전문 지식을 기반으로 처리를 위해 선정되었다소스, 필요성이 컬렉션의 2 시간 이내에 샘플을 처리하기 시작하고, 수집 사이트에 우리의 근접. 손이 독특한 기회, 우리의 목표는 각 시료로부터 DNA, RNA, 혈청 및 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 최대 수율 (시편 컬렉션 5 파도 위에 N = 1,639 샘플의 합계)에 대한 처리를 최적화하는 것이다. 여기에 설명 된 절차에 따라서, 마이크로 어레이, 성적인, 실시간 RT-PCR을 포함하여 하류 다양한 응용을위한 재료 (평균 수율은 표 1 참조)을 출발 제조, 비 임상 환경에서 동시에 수행하고, 분석 유세포 수있다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52227/52227fig1highres.jpg" width="700"> 그림 1. 전체 작업 흐름. 여기에 도시 된 전체적인 공정은 동의 partic 식별로부터 혈액 표본을 얻는 물류를 포함혈액에 ipants 자체를 그립니다. 고품질, 분획 (말초 혈액 단핵 세포; PBMC를, DNA, 혈청, 및 RNA) 신선한 전혈의 컬렉션의 2 시간 내에 제조 될 수 있고, 모든 분석 시료 준비 2 일 내에 사용할 수있다. 시료는 즉시 시험 될 수없는 경우 또한,이 방법에 의해 제조 된 분획은 장기간 저장에 적합하다. 여기에 설명 된 전체 타임 라인은 하루 (~ 5 시간의 합계)에 완료 될 수 있습니다. 그러나, 이와 같은 일이 특히 상당한 경험과 기술을 가진 단일 기술자 매우 노동 집약적 일 것이다. 따라서, 우리는 적어도 두 기술자 사이에 1 일의 절차를 나누고 일 2. RNA 처리를 완료 추천 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52227/52227fig1highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>QIAamp DNA 혈액 미니 키트</td><td>Qiagen</td><td>51104</td><td>1일차: DNA 분리</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Sigma</td><td>P5493-1L</td><td>1일차: PBMC 분리</td></tr><tr><td>5 &frac34; &rdquo; 파스퇴르 피펫</td><td>Fisher</td><td>13-678-6A</td><td>1일차: PBMC 분리</td></tr><tr><td>태아 소 혈청 (FBS), 열 비활성화</td><td>Life Technologies</td><td>10082147</td><td>1일차: PBMC 분리</td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드 (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D8418-500ml</td><td>1일차: PBMC 분리</td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640, 액체</td><td>Invitrogen</td><td>11875119</td><td>1일차: PBMC 격리</td></tr><tr><td>0.4% 트리판 블루 염색;</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td>1일차: PBMC 분리</td></tr><tr><td>Countess 세포 계수 챔버</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td>1일차: PBMC 분리</td></tr><tr><td>Countess 자동 세포 계수기 또는 현미경 및 혈구계와 같은 세포 계수 장치</td><td>Invitrogen</td><td>C10281</td><td>1일차: PBMC 분리</td></tr><tr><td>LeukoLOCK 분획 및 안정화 키트&nbsp;</td><td>Ambion</td><td>1933</td><td>1일차: 백혈구 RNA 분리</td></tr><tr><td>25&nbsp; G x 5/8 인치 바늘</td><td>Becton Dickinson</td><td>305122</td><td>Day 1: Leukocyte RNA 분리</td></tr><tr><td>주사기 (5&nbsp; ml)</td><td>Becton Dickinson</td><td>309646</td><td>Days 1 and 2: Leukocyte RNA isolation</td></tr><tr><td>Denaturing Lysis Solution&nbsp;</td><td>Ambion</td><td>8540G</td><td>2일차: 백혈구 RNA 분리</td></tr><tr><td>5&nbsp; M NaCl</td><td>Life Technologies</td><td>24740011</td><td>2일차: 백혈구 RNA 분리</td></tr><tr><td>TRI 시약</td><td>Ambion</td><td>9738</td><td>2일차: 백혈구 RNA 분리</td></tr><tr><td>Bromo-3-chloro-propane (BCP)</td><td>Sigma</td><td>B-9673</td><td>2일차: 백혈구 RNA 분리</td></tr><tr><td>스핀 카트리지&nbsp;</td><td>Ambion</td><td>10051G</td><td>2일차: 백혈구 RNA 분리</td></tr><tr><td>0.1&nbsp; mM EDTA</td><td>Ambion</td><td>9912</td><td>2일차: 백혈구 RNA 분리</td></tr><tr><td>DNA-free 키트</td><td>Ambion</td><td>AM1960</td><td>2일차: DNase</td></tr><tr><td>treament RNA 6000 Ladder&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>5067-1529</td><td>Day 2: 바이오분석기 분석</td></tr><tr><td>RNA 6000 Nano Series II 키트&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>5067-1511</td><td>2일차: 바이오분석기 분석</td></tr><tr><td>RNaseZAP</td><td>Ambion</td><td>AM8782</td><td>2일차: 바이오분석기 분석</td></tr><tr><td>에탄올 >99%</td><td>Sigma</td><td>E7023-500ml</td><td></td></tr><tr><td>이소프로판올 >99%&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I9516-500ml</td><td></td></tr><tr><td>뉴클레아제가 없는 초순수&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>9938</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁(뉴클레아제 무함유)</td><td>Eppendorf</td><td>22491253</td><td></td></tr><tr><td>Pipetter(혈청학)</td><td>Eppendorf</td><td>2223020-4</td><td></td></tr><tr><td>피펫터(1&nbsp; ml)</td><td>Eppendorf</td><td>3120000-054</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes (serological)</td><td>Fisher</td><td>13-678-27E</td><td></td></tr><tr><td>Controlled rate freezing containers</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>Cryoboxes (to hold 2&nbsp; ml 및 5&nbsp; ml cryovials 및 1.5&nbsp; ml 마이크로 원심분리기 튜브)</td><td>Fisher</td><td>03-395-464</td><td></td></tr><tr><td>시험관 랙</td><td>Thermo Scientific</td><td>14-804-134</td><td></td></tr><tr><td>15&nbsp; ml 폴리프로필렌 튜브</td><td>Fisher</td><td>14-959-49D</td><td></td></tr><tr><td>1.5&nbsp; ml 및 0.65 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Fisher</td><td>07-200-534 및 07-200-185</td><td></td></tr><tr><td>2&nbsp; ml 및 5&nbsp; ml cryovials</td><td>Fisher</td><td>10-500-26 및 10-269-88F&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>8&nbsp; ml CPT vacutainer</td><td>BD Biosciences</td><td>362761</td><td>2 튜브</td></tr><tr><td>6&nbsp; ml K2 EDTA vacutainer</td><td>BD Biosciences</td><td>367863</td><td>2 튜브</td></tr><tr><td>8.5&nbsp; ml SST vacutainer</td><td>BD Biosciences</td><td>367988</td><td>1 튜브</td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Fisher</td><td>2215365</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브용 가열 블록이 있는 건식 수조 인큐베이터</td><td>Fisher</td><td>11-715-1250</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 후드 내에서 사용하기 위한 여과/진공 시스템</td><td>Fisher</td><td>01-257-87</td><td></td></tr><tr><td>에어로졸 밀폐 뚜껑이 있는 마이크로 원심분리기 튜브용 고정각 로터</td><td>Eppendorf</td><td>22637002</td><td></td></tr><tr><td>16 x 125&nbsp용 스윙 버킷 로터와 에어로졸 타이트 캡이 있는 냉장 원심분리기; mm vacutainers 및 15&nbsp; ml 폴리프로필렌 튜브</td><td>Eppendorf</td><td>22628157</td><td>2, 냉장 할 필요가 없습니다</td></tr><tr><td>Nanodrop 2000 (소량의 정확성을 위해 권장) 또는 기타 분광 광도계 장치</td><td>Fisher</td><td>13-400-411</td><td></td></tr><tr><td>Agilent Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2940CA</td><td></td></tr><tr><td>액체 질소 탱크</td><td>Thermo Scientific</td><td>11-676-56</td><td></td></tr><tr><td>Sharps 용기</td><td>Fisher</td><td>22-037-970</td><td></td></tr><tr><td>생물학적 폐기물 용기</td><td>Thermo Scientific</td><td>1223P52</td><td></td></tr><tr><td>Biosafety Level 2&nbsp; 인증된 세포 배양 후드</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-261-315</td><td></td></tr></tbody></table>

지역 사회 기반의 설정에서 획득 샘플의 신속한 분별 및 전체 혈액 성분의 분리

Rapid Fractionation and Isolation of Whole Blood Components in Samples Obtained from a Community-based Setting

비 임상 설정에서 수집 및 전체 혈액 샘플의 처리와 기존 조건없이 모두 지역 사회에 거주하는 개인을 평가하는 독특한 기회를 제공합니다. 이들 샘플의 신속한 처리가 주요 세포 성분의 열화를 방지하는 것이 필수적이다. 동시에 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), DNA에 대한 방법이 여기에 포함된다, RNA 및 처리와 대도시 지역에 걸쳐 참가자를 동의의 가정에서 수행 한 혈액 추첨에서 혈청 분리, 컬렉션의 2 시간 이내에 시작했다. 우리는 1,600 혈액 표본이어서 성공적인 DNA 메틸화, 유전자형, 유전자 발현에 이용하고 유동 세포 계측법 분석 한 항복 일관된 고품질의 재료를 처리하는 이러한 기술을 이용했다. 사용되는 방법 중 일부는 표준; 설명 된 방식으로 조합 그러나, 그들은 인구 문제 및 / 또는 참가자를 커뮤니티의 샘플의 효율적인 처리를 가능하게일반적으로 임상에서 평가되지 않는다 기반 연구. 따라서,이 프로토콜은 일반적인 인구의 대표적인 (후속 데이터) 샘플들을 획득 할 수있는 잠재력을 갖는다.

이것은 전체적인 절차 유전자 마이크로 어레이와 RT-PCR 분석을 통해 발현 후성 변형을 검출하고, 셀 집합의 변화를 포함 하류 다수의 애플리케이션에서 분석을위한 높은 품질의 재료를 생성하는 것이 필수적이다. 표 1은 물질의 평균 수율 및 품질을 나타내는 각 프로세스에서. 3 백혈구 RNA 분리 및 필터 처리 방법의 품질의 출력의 예를 그림. 도 3의 좌측 이미지는 모세관 전기 영동에 의한 겔 사진이다. 각 레인은 저하를 나타냅니다 최소한의 그림자와 함께 두 가지 밴드를 생산한다. 아래 겔 크로마토 그램의 피크의 위치와 크기에 기초하여 결정될 수있다 열화의 레벨 및 유형에 추가적인 모습을 제공한다. (; 저하 낮음)에 RNA 무결성 번호 (린) 1 범위 다른 품질 측정10 (높은 순수한, 좋은 품질의 RNA). 이러한 높은 처리량 방법은 가끔 오류로 빌려 준다,하지만 품질 관리를 보장하...

추가 분석을 위한 다양한 성분을 얻기 위해 전혈을 처리하는 방법론을 간략하게 설명합니다. 당사는 비임상 환경에서 전혈 샘플의 빠르고 높은 처리량의 동시 처리를 가능하게 하는 간소화된 프로토콜을 최적화했습니다.

Collection and processing of whole blood samples in a non-clinical setting offers a unique opportunity to evaluate community-dwelling individuals both ...

이 절차의 전반적인 목표는 빠른 눈 처리량, 전혈 샘플의 동시 처리를 가능하게 하는 간소화된 프로토콜을 제공하는 것입니다. 비임상 환경에서 액포 처리는 D-N-A-R-N-A 말초 혈액 단핵 세포 또는 pbmc 혈청의 고품질 분획과 혈장 및 적혈구의 잔류 분획을 효율적으로 분리할 수 있도록 중첩 방식으로 수행됩니다. 공정은 혈청 액포의 원심분리, 피알 튜브의 DNA 분리 원심분리를 위해 액포테이너를 포함하는 하나의 피알에서 부분 표본을 제거하는 것으로 시작됩니다.그런 다음 DNA 분리 후 DNA 분리가 완료되고 K2 EDTA vacutainer에서 RNA 유래 RNA 분리가 발생할 수 있습니다. 각 액포의 혈액은 해당 필터를 통과하고 PBS로 세척한 다음 액포자가 포함된 피알로 돌아가는 RNA 안정화제로 처리합니다. 잔류 플라즈마를 제거하고 단핵층을 PBS로 세척합니다.관이 회전하는 동안 잔류 적혈구를 수집하고 분리된 혈청을 분취합니다. 마지막으로, pbmc는 세포 동결 매체에 보존됩니다. 궁극적으로, 채취 후 2시간 이내에 고품질의 신선한 혈액 분획을 생산할 수 있으며, 모든 분석 준비가 된 검체는 2일 이내에 사용할 수 있습니다.기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 비임상 환경에서 절차를 동시에 수행할 수 있으므로 마이크로어레이 후성유전학적 실시간 R-T-P-C-R 및 유세포 분석을 포함한 다양한 다운스트림 응용 분야에서 2일 이내에 시작 물질을 생산할 수 있다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 전혈 샘플 처리를 시작하는 실험실 관리자인 Amy Weckl이 될 것입니다. 버퍼, 원심분리기 및 열 블록이 모두 준비되었는지 확인하십시오.샘플 추적 시트에 진공 배송 시간을 문서화하십시오. 샘플을 받은 후 혈청 분리를 문서화합니다. 검체 로그의 시작 시간: 브레이크와 가속을 끈 상태에서 7ml 혈청 진공 청소기를 원심분리하여 즉시 처리를 시작합니다.에어로졸 캡이 있는 스윙 버킷 로터를 사용하여 세럼 진공 청소기를 원심분리하는 동안 섭씨 1300GS 4도에서 20분 동안 사용합니다. BSL 2세포 배양 후드에서 DNA 분리 시작 시간을 문서화합니다. 피알 젤이 들어있는 진공 용기를 5 번 뒤집고 진공 용기 중 하나의 상단에서 200 마이크로 리터의 전혈을 20 마이크로 리터의 프로테아제 분취액 2 개 각각에 추가합니다.프로테아제와 혈액 마이크로 원심분리기 튜브를 후드에 그대로 두고 진공 용기가 들어 있는 콜의 원심분리를 계속합니다. 원심분리 전. 채혈 후 2시간 이내여야 하는 PBMC 격리 시작 시간을 문서화합니다.에어로졸 밀폐 용기에 이미 있는 진공 용기가 포함된 FI 호출을 8-10회 반전합니다. 그런 다음 섭씨 30Gs에서 1600분 동안 브레이크 및 가속을 끈 상태에서 진공 흡입기를 원심분리합니다. 후드의 DNA 분리 샘플로 돌아가서 각 프로테아제 및 혈액 마이크로 원심분리 튜브에 200마이크로리터의 완충액을 추가합니다.튜브에 캡을 씌우고 후드에서 제거합니다. 그런 다음 15초 동안 소용돌이치게 합니다. 와류 후 즉시 플래시, 스핀 샘플.DNA가 Ellucian의 열에서 암시될 때까지 동반된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 DNA 분리를 진행합니다. 참가자당 두 개의 열에서 DNA를 풀링하여 참가자당 총 800마이크로리터의 수율을 얻었습니다. 백혈구 RNA 분리 시작 시간을 문서화합니다.K two EDTA 진공 청소기의 고무 격막에 전사 스파이크로 뚫습니다. K two EDTA 튜브 시스템을 조립한 후 나중에 사용할 수 있도록 피복과 나사 캡을 보관하십시오. 금속 주걱의 끝을 사용하여 바늘을 안전하게 풀고 바늘을 빈 10ml 배출 혈액 채취 튜브에 삽입합니다.K two EDTA vacutainer 필터 수신기 튜브 어셈블리를 뒤집어 설정을 완료합니다 여과 및 A PBS 세척 후 새 10ml 주사기를 사용하여 RNA 안정화제 3ml를 회수합니다. RNA 안정화제가 부착된 상태로 유지되도록 필터를 세척합니다. 그런 다음 플런저를 후퇴시키지 않고 필터에서 주사기를 분리합니다.전사 스파이크에서 유지된 덮개와 나사 캡으로 필터 입구와 출구를 밀봉하고 필터를 RNA 안정화제로 포화 상태로 둡니다. RA 분리가 완료될 때까지 필터를 섭씨 영하 80도에서 최소 2시간 동안 보관하십시오. 액포가 BSL 2 후드로 되돌아 오면 스토퍼를 제거하고 혈청 피펫을 사용하여 단핵층에 가까이 가지 않고 상단 플라즈마 층의 1.5 밀리리터를 빼냅니다.두 개의 진공 포장기에서 플라즈마를 5ml cryo 바이알로 옮깁니다. 그런 다음 수집된 볼륨을 기록합니다. 혈청학적 피펫을 사용하여 나머지 플라즈마와 단핵층을 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다.그런 다음 이전에 준비된 XPBS 1개를 충분히 추가하여 원뿔형 튜브의 총 부피를 최대 15ml까지 가져옵니다. 튜브의 뚜껑을 닫고 5번 뒤집습니다. 그런 다음 섭씨 300GS 22도에서 15분 동안 브레이크 및 가속을 끈 상태에서 튜브를 원심분리합니다.후드에 진공 용기가 들어 있는 파이브로 돌아가서 적혈구 또는 적혈구를 수집합니다. 5인치 및 3/4인치 페이스트리 피펫을 사용하여 주위를 빙빙 돌리고 파이알 젤 층의 바깥쪽을 풀고 제거합니다. 혈청학 피펫을 사용하여 적혈구를 수집하여 5ml cryo 바이알로 옮깁니다.그런 다음 볼륨을 기록합니다. 다음으로, 플라즈마 및 RBC 극저온 바이알을 제어 속도 동결 용기로 옮기고 최소 24시간 동안 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. 24시간 후 샘플을 극저온 상자로 옮기고 장기 보관을 위해 섭씨 영하 80도로 되돌립니다.원심분리가 완료되면 원뿔형 튜브를 후드로 되돌리고 액체를 흡인하여 펠릿을 방해하지 않고 500마이크로리터의 PBS를 남깁니다. XPBS 1개를 추가하여 부피를 10밀리리터로 늘리고 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 튜브를 부드럽게 덮고 다섯 번 뒤집습니다.그런 다음 브레이크와 가속을 끈 상태에서 섭씨 300GS 22도에서 10분 동안 샘플을 원심분리합니다. 원심분리 후, 액포의 상단 혈청층을 2mL cryo 바이알로 분취하고 부피를 문서화합니다. 4개의 극저온 바이알과 200마이크로리터를 극저온 바이알에 분취합니다.1000 마이크로 리터 1 개를 극저온 바이알 2 개. 그런 다음 남은 부피를 극저온 바이알 3과 4로 나눕니다. 극저온 바이알을 극저온 상자로 옮기고 장기 보관을 위해 섭씨 영하 80도로 보관하십시오.그리고 냉동실 시작 시간을 문서화하십시오. PBMC 격리를 계속합니다. 원심분리 후 샘플을 후드로 되돌리고 펠릿을 방해하지 않고 가능한 한 많은 상층액을 흡입합니다.우리는 펠릿을 2.5 밀리리터의 PBMC에 현탁시킵니다. 중간 정도. 2.5ml의 PBMC를 넣고 DMSO와 RPMI를 포함하는 배지 2를 동결합니다.미리 준비된 세포 용액에 배지를 달고 샘플을 부드럽게 와류시킵니다. 그런 다음 10마이크로리터의 세포 용액을 마이크로 원심분리기 튜브에 분취합니다. 마이크로 원심분리기 튜브에 10마이크로리터의 0.4% 트립 팬 블루 스테인을 넣고 여러 번 피펫팅하여 용액을 혼합합니다.다음으로, 혼합물 10마이크로리터를 세포 계수 챔버에 피펫팅합니다. 혼합 후 3분 이내에 슬라이드를 세포 카운터에 밀어 넣습니다. 셀을 확대하고 초점을 맞춥니다.그런 다음 셀 수를 선택하여 A-P-B-M-C 수를 구합니다. 실행 가능한 PBMC 수가 밀리리터당 300만 개 세포 이상인 경우, 샘플을 밀리리터당 최소 300만 개 세포 농도의 최대 5개의 극저온 바이알로 분취합니다. 각각은 시료 로그에 cryo 바이알당 세포 수를 문서화합니다.실행 가능한 PBMC 수가 밀리리터당 300만 셀 미만인 경우 진행 방법에 대해서는 함께 제공되는 텍스트 프로토콜을 참조하십시오. 마지막으로, 극저온 바이알을 제어된 속도 동결 용기로 옮기고 최소 24시간 동안 섭씨 영하 80도에 놓습니다. 24시간 후, 극저온 바이알을 극저온 상자로 옮기고 장기 보관을 위해 상자를 액체 질소 탱크의 증기상에 놓습니다.표본 로그에 냉동고 시작 시간을 문서화하십시오. 백혈구 RNA 분리 및 필터 처리 방법은 모세관 전기영동으로 인한 이 겔 이미지를 생성했습니다. 두 개의 뚜렷한 띠가 ATT s 및 28 s 리보솜 RNA를 나타내는 최소한의 분해로 생성되었습니다.이 절차를 시도하는 동안 정확한 기록을 유지하는 것이 중요하다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 처음부터 부피, 농도, 품질, 바코드 및 보관 위치를 포함한 모든 극저온 바이알 정보를 저장할 수 있는 데이터베이스를 개발하는 것이 좋습니다. 샘플 구성에 대한 추가 권장 사항은 텍스트 프로토콜에서 찾을 수 있습니다.

rapid-fractionation-isolation-whole-blood-components-samples-obtained

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 동영상은 혈소판 수 스크리닝, 혈액 채취 및 원심분리, 혈소판 분리를 통한 고품질 혈소판 풍부 혈장(PRP)의 준비를 보여줍니다. 이 PRP는 조직 재생 및 치유를 위한 치료 응용 분야에 사용됩니다.

Preparation of Platelet-Rich Plasma from Human Peripheral Blood(인간 말초 혈액에서 혈소판이 풍부한 혈장)의 제조

혈액 백혈구 및 혈소판은 개인의 생체 에너지 전반적인 건강의 마커로 사용하고 있으므로 병적 과정 및 치료의 효과를 모니터링하기위한 잠재력을 가질 수있다. 여기에서 우리는 미토콘드리아의 기능이 세포의 산화 버스트를 분리하고 측정하는 방법을 설명합니다.

인간 백혈구 및 혈소판의 분리 및 평가를위한 프로토콜 : 생물 에너지와 산화 버스트

Leucocyte-Platelet Rich Fibrin (L-PRF)은 독특한 피브린 구조, 풍부한 혈소판 및 풍부한 성장 인자를 가진 자가 혈소판 농축액의 FDA 승인 제제를 나타냅니다. 여기에서는 L-PRF의 체어 사이드 생성을 위한 프로토콜을 제시하고 단축 테스트 및 봉합사 유지 강도 테스트를 포함한 기계적 특성을 평가합니다.

백혈구 - 혈소판 풍부한 섬유소, 소설 생체 재료의 특성

내피 전구 세포 (내피 전구 세포는) 결정적으로 허혈성 조직의 혈관 신생에 관여한다. 이 방법은 말초 혈액에서 인간 내피 전구 세포의 분리뿐만 아니라, 심장 수술 환자의 혈청 샘플에 대한 그들의 이동성 전위의 식별을 설명한다.

심장 수술 후 혈청 샘플의 영향을 건강한 자원 봉사자와 그들의 철새 잠재력에서 내피 전구 세포의 분리

여기, 선물이 원형질 막, 세포질 및 고속 원심 분리의 사용 없이 U937 세포의 미토 콘 드리 아를 분리 하는 프로토콜. 이 기술은 정화 subcellular 분수 immunoblotting 통해 단백질 지역화의 후속 검사에 대 한 사용할 수 있습니다.

고속 원심 분리의 부재에서 U937 세포의 세포 분별 법

이 프로토콜은 번역 바이오마커 분석에 사용될 수 있는 임상 시험 현장에서 고품질 PBMC 및 플라즈마 바이오샘플의 임상 구현 가능한 제제를 상세히 설명합니다.

바이오마커 분석을 위한 임상 시험 현장에서 단하나 혈액 무승부에서 말초 혈액 단핵 세포 펠릿 및 플라즈마의 준비

우리는 세자리 증후군으로 진단 된 환자로부터 얻은 전혈에서 말초 혈액 단핵 세포를 분리하기위한 간단한 프로토콜을 제시하고, CD4 + T 세포의 선택, phorbol12-myristate13-acetate 및 A23187 ionophore로 자극, 전사 프로파일 링을위한 RNA 준비.

전사 프로파일링을 위해 세자리 증후군 환자로부터 인간 말초 혈액 단핵 세포 및 CD4+ T 세포 분리

이 프로토콜은 전혈, 버피 코트 또는 백혈구 막에서 호중구를 분리하여 좋은 수율, 높은 순도 및 최소한의 세포 활성화를 달성하는 방법을 자세히 설명합니다. 그라데이션 정제, 적혈구(RBC) 퇴적물 및 RBC 용액을 활용하여 고품질/순도 호중구 제제를 획득합니다.

전신 혈액과 버피 코트에서 인간의 호중구의 격리

액체 생검은 종양학 번역 연구에 대한 우리의 접근 방식에 혁명을 일으켰으며, 샘플 수집, 품질 및 보관은 성공적인 임상 적용을위한 중요한 단계입니다. 여기에서는 대부분의 번역 연구 실험실에 적용 할 수있는 다운스트림 순환 프리 DNA 응용 프로그램에 대한 표준화되고 검증 된 프로토콜을 설명합니다.

다운스트림 순환 프리 DNA 응용을 위한 표준화된 액체 생검 사전 분석 프로토콜

이 프로토콜은 바이오뱅킹 및 기타 목적을 위해 인간 말초 혈액 단핵 세포를 분리하는 고처리량 자동화 호환 방법에 대해 자세히 설명합니다.

High Throughput Immunomagnetic Bead Separation을 통해 Buffy Coats에서 인간 말초 혈액 단핵 세포 분리

학습하세요 전혈 샘플에서 DNA, RNA, 혈장, PBMC를 신속하게 분리하는 최적화된 프로토콜입니다. 원심분리와 RNA 안정화를 활용하여 비임상 환경에서 고품질 혈액 성분을 효율적으로 얻는 방법을 탐색하세요.

지역 사회 기반의 설정에서 획득 샘플의 신속한 분별 및 전체 혈액 성분의 분리

더 많은 동영상 탐색