신경 세포 유형의 표면에 대한 유동 세포 계측법 프로토콜 및 세포 내 항원 분석

이 절차의 전반적인 목표는 유세포 분석을 사용하여 신경 세포에서 표면 및 세포 내 항원의 발현을 분석하는 것입니다. 이는 먼저 체외 배양 또는 1차 신경 조직에서 신경 세포를 수확하여 수행됩니다. 다음으로, 선택적인 비특이적 세포 내 염색을 세포에 적용합니다.

그런 다음 원하는 표면 항원은 즉시 1차 항체로 표지되는 반면, 원하는 세포 내 항원은 세포 고정 및 투과 후에 표지됩니다. 궁극적으로, 결과는 intracellular label에 의해 정의된 대로 관심 있는 특정 신경 하위 모집단에서 표면 항원의 동시 발현을 위한 유세포 분석을 사용하여 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜은 다색 유세포 분석으로 표면 및 세포 내 항원을 조사하기 위해 조직 배양 유래 신경 세포를 준비하는 방법을 보여줍니다.

먼저 T 75 플라스크에서 자란 부착 신경 세포를 수확하려면 먼저 실온에서 5ml의 마그네슘과 칼슘이 없는 PBS로 세포를 한 번 부드럽게 세척합니다. 그런 다음 3ml의 트립신 대체물을 첨가하여 플라스크에서 세포를 분리하고 섭씨 37도에서 2-5분 동안 배양합니다. 세포 현탁액을 위아래로 몇 차례 피펫팅하여 세포 덩어리를 느슨하게 한 후 6ml의 흐름 완충액을 추가하여 효소 분해를 담금질하고, 전체 세포 현탁액을 새로운 15ml 튜브로 옮겨 세포를 분리합니다.

튜브를 원심분리기에 넣고 실온에서 5분 동안 세포를 스핀다운한 다음 세포 내 염료 라벨링을 준비하기 위해 스내트를 흡인합니다. PBS 5ml와 0.1%BSA로 세포 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 그렇지 않으면 표준 trian blue 염색 프로토콜과 함께 5ml의 흐름 완충액을 추가하십시오.

혈구 분석기를 사용하여 효과적인 생존 가능한 세포 수를 추정합니다. 이전 단계에서 사용한 것과 동일한 완충액을 사용하여 기존 현탁액의 세포 농도를 밀리리터당 100만 개의 생존 가능한 세포로 재조정합니다. 이 세포는 이제 두 가지 염색 옵션, 즉 표면 항원 항체 염색 또는 카르복시 플루오레세인(carboxy fluorescein)을 사용한 선택적 형광 세포 내 염색 후 앞서 언급한 표면 항원 염색을 할 준비가 되었습니다.

카르복시 플루오레세인 CIN 에스테르 염료로 세포 내 라벨링 단계를 수행하려면 먼저 10마이크로리터의 CFSE 원액을 첨가합니다. 세포 현탁액 1ml당 튜브를 200RPM의 셰이커에 놓고 혼합물을 5분 동안 배양합니다. 실온에서는 튜브가 직사광선에 노출되지 않도록 보호하여 광표백을 방지하십시오.

플로우 버퍼와 피펫이 포함된 5가지 부피의 혈청을 첨가하여 모든 비반응성 염료를 담금질하고 몇 번 부드럽게 위아래로 혼합하여 혼합합니다. 그런 다음 실온 원심분리기에서 5분 동안 세포를 스핀다운하고 상등액을 흡입하여 미량의 불반응성 염료를 제거합니다. 세포 펠릿을 5가지 부피의 플로우 버퍼로 현탁시켜 세척합니다.

그런 다음 SUP natant를 버리기 전에 실온 원심분리기에서 5분 동안 세포를 한 번 더 회전시킵니다. 마지막으로, 최종 세포 농도가 밀리리터당 100만 개의 생존 가능한 세포가 되도록 세포 펠릿을 흐름 버퍼로 다시 현탁시킵니다. 다중화 실험의 경우, 다른 실험 조건에서 관심 있는 염색되지 않은 세포를 CFSC 염색된 세포 현탁액에 동일한 수만큼 추가합니다.

이제 세포는 세포 표면 염색을 시작하기 위해 항체로 표면 항원 태깅을 할 준비가 되었습니다. CFSC 라벨이 있거나 없는 100마이크로리터의 세포 현탁액을 새 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 항체 적정 테스트로 이전에 결정된 양으로 세포 현탁액에 fluor four conjugated antibodies를 추가합니다.

튜브를 100RPM의 실온 오비탈 셰이커에 놓고 혼합물을 30분 동안 배양합니다. 빛이 없는 경우 1ml의 플로우 버퍼를 추가하여 항체 혼합물을 희석합니다. 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 세포를 혼합하고 미리 냉각된 섭씨 4도의 마이크로 원심분리기에서 4분 동안 회전시킵니다.

결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 supinate를 흡인하고 이 세척 원심분리기 및 흡인을 반복합니다. 한 번 더 단계를 밟습니다. Reus는 세포 펠릿을 100마이크로리터에 현탁시켜 이전에 염색된 세포에 대한 흐름 완충액을 제공합니다.

500마이크로리터의 고정 완충액을 100마이크로리터의 세포 현탁액에 추가합니다. 튜브를 100RPM의 실온 오비탈 쉐이커에 놓고 어두운 곳에서 15분 동안 배양합니다. 포름알데히드는 서로 가까이 있는 모든 단백질과 DNA 종을 가교하고 생존 불가능한 세포 현탁액을 생성합니다.

PBS 1ml를 첨가하여 고정 혼합물을 희석하고 위아래로 몇 번 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다. 그런 다음 미리 냉각된 섭씨 4도의 원심 분리기에서 3분 동안 고정된 세포를 회전시킵니다. 100마이크로리터의 액체가 세포 펠릿 위에 남아 후속 세포 내 항원 라벨링을 위해 세포막에 침투하도록 supinate를 흡인합니다.

100마이크로리터의 세포 현탁액에 500마이크로리터의 투과 완충액을 추가합니다. 튜브를 100RPM의 실온 오비탈 쉐이커에 놓고 어두운 곳에서 15분 동안 배양합니다. PBS 1ml를 부드럽게 위아래로 몇 번 피펫팅하여 사전 냉각된 섭씨 4도 원심 분리기에서 3분 동안 고정된 셀을 혼합하고 회전시켜 투과 혼합물을 희석합니다.

배양 전에 SUP natant를 완전히 흡인하십시오. PBS에 0.5%tween 20 buffer를 더한 항체를 희석하여 1차 항체 작업 원료를 준비합니다. 1% BSA 10% 당나귀 세럼 또는 10% 염소 세럼으로 더욱 풍부해집니다.

그런 다음 멤브레인 투과성 세포 펠릿을 100마이크로리터의 1차 항체 작업 재고로 재현탁합니다. 튜브를 200RPM의 실온 오비탈 쉐이커에 놓고 어두운 곳에서 30분 동안 배양합니다. 1ml의 플로우 버퍼를 추가하여 기본 항체 혼합물을 희석합니다.

차례 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 미리 냉각된 섭씨 4도의 원심분리기에서 4분 동안 세포를 혼합하고 회전시킵니다. 결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 supinate를 완전히 흡인합니다. 다음으로, 펠릿을 100마이크로리터의 2차 항체 작업 재고로 재현탁합니다.

빛으로 보호된 실내 온도 배양을 30분 동안 반복합니다. 동일한 Shaker에서 1ml의 플로우 버퍼를 추가하여 2차 항체 혼합물을 희석합니다. 동일한 튜브 반전 혼합, 스핀 다운 및 상등액 제거를 반복하여 결합되지 않은 모든 항체를 제거합니다.

동일한 1ml 세척 원심분리 및 상층액 제거 단계를 두 번 더 반복하되 새 PBS를 세척 버퍼로 사용합니다. 대신, 최종 결과는 CFSC 세포 외 또는 세포 내 표적 형광 항체 또는 150 마이크로리터의 흐름 완충액에 라벨링된 세포 펠릿인 세 가지 재현탁액의 조합으로 라벨링된 깨끗한 세포 펠릿이 될 것입니다. 세포 현탁액을 유세포 분석기로 옮기고 4층의 각 층에 대해 적절한 레이저 여기 및 방출 필터 설정으로 분석을 시작합니다.

전방 및 측면 산란 데이터를 가이드로 사용하여 유세포 분석 소프트웨어 내에서 초기 전방 산란 대 측면 산란을 설정하여 세포 파편 및 사멸 세포와 같은 비특이적 데이터 포인트를 제외합니다. 다음으로, 염색되지 않은 세포 현탁액의 원시 데이터를 음성 대조군으로 사용하여 다색의 배경 형광을 설명하기 위해 세포 외 및 세포 내 항원 라벨 모두에서 양성 방출 신호를 선택하는 다중 형광 통합 게이트를 설정합니다. 스펙트럼 중첩 효과는 단일 항체 염색 대조군의 원시 데이터를 사용하여 형광 게이트를 재조정합니다.

다중화 팩스 실험에서 카르복시 플루오레세인 태그는 항체를 사용하지 않고 두 개의 서로 다른 계통 또는 실험 조건의 세포를 구별할 수 있는 기준선 신호로 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 이질적인 세포 현탁액에서는 녹색 채널에서 형광의 유무를 보는 것만으로도 CFSC로 태그가 지정된 신경 세포와 태그가 지정되지 않은 섬유아세포를 즉시 구별할 수 있습니다. 또한 CFSE Esther 라벨링과 함께 다양한 색상의 형광 항체를 사용하여 혼합 샘플 내에서 CFSE 라벨링된 부분과 라벨링되지 않은 부분 집합 간의 표면 항원의 차별 발현을 결정할 수 있습니다.

예를 들어, 녹색 형광 채널에서 CFSE로 표지된 SHSY 5 Y 신경모세포종 세포는 높은 수준의 CD 24 표면 항원을 공동 발현했지만 섬유아세포 마커 CD 54는 그렇지 않았습니다. 대조적으로, CFSC 음성 BJ 섬유아세포는 CD 54에 대해 양성이며 CD 24.Combinatorial의 수치가 낮습니다. 신경 표면 항원의 분석은 세포 내 항원의 항체 기반 검출과 함께 수행할 수도 있습니다.

표면 항원 및 세포 내 항원에 대한 염색되지 않은 샘플과 단일 염색 대조군을 포함하는 것은 여기에 표시된 신경 마커 맵 2와 같은 세포 내 항원의 1차 및 2차 항체 기반 라벨링에 대한 대안으로 매우 중요합니다. 1차 항체의 비공유 형광 표지는 동시 발현 분석에서 유사한 결과를 얻을 수 있으며 프로토콜을 단축할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 다양한 대체 라벨링 접근 방식과 이들의 조합을 사용하여 기본 유세포 분석을 위해 신경 세포를 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.