Name: 쥐 시신경에 주입을위한 최소 침습 기술 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: 학습하세요 쥐 시신경에 약물 또는 줄기세포를 최소 침습적으로 주입하는 방법을. 두개골 개방 없이 신경 재생 연구를 수행하며 수술 합병증을 줄이고 회복 시간을 단축합니다.

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이 연구는 NeuralStem, Inc. 및 Johns Hopkins Project RESTORE의 지원을 받았습니다.

참고 : 모든 동물의 절차는 존스 홉킨스 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 마취 기계는 필요에 따라 매년 검사 및 교정을 필요로한다. 1. 마취 및 위치 <ol><li> 마취. <ol><li> 2~3% 이소 플루오 란과 마취하에 모든 수술 절차를 수행합니다. 발가락 핀치와 호흡 속도에 의해 마취의 적절한 수준을 확인합니다. 쥐가 발가락 핀치에 대한 응답으로 주저하지 않는 것을 확인합니다. 참고 : 움찔 너무 늦기 마취를 표시하고 시작하기 전에 더 이상 마취 또는 더 높은 이소 플루오 란 농도를 필요로 할 수있다. 매 2 초 마취를 나타내는 너무 느립니다 1 호흡보다 호흡 속도가 너무 높고, 이소 플루오 란 농도의 번개가 필요할 수 있습니다. </li><li> 절차 중에 머리의 움직임을 피하기 위해 필요한 동물을 고정. 수술 눈에 리도카인 한 방울을 놓습니다. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 인공 눈물마다 10 분을 사용합니다. 주기0.01 ㎎ / ㎏ SC 사전에 작동하고 모든 6 ~ 8 시간의 프레 노르 핀의 주입이 필요. </li></ol></li><li> 위치. <ol><li> 정위 프레임에 쥐를 넣고 가열 패드 따뜻한 유지. 눈에 노출을 피하기 위해 알코올 복용 케어 두피 모피 젖은. 수술 후 감염의 위험을 최소화하기 위해 멸균 도구 및 무균 기술을 사용합니다. </li></ol></li></ol> 2. 눈 관리 <ol><li> 측면 결막에 4-0 봉합사를 놓고 부드러운 견인을 허용하기에 충분한 봉합사로 묶어. </li></ol> 3. 해부 <ol><li> 초기 해부. <ol><li> .도 1에 도시 된 바와 같이, 크기 10 메스를 사용하여 궤도 릿지를 덮는 피부 ~ 1 인치 절개를 피부와 하부 근막 후퇴 신중 근막을 얻어 해부. 수술에 과도한 출혈을 방지하기 위해, 근막을 해부하면서 혈관을 절단하지 마십시오. PL 전략적으로 사용제압면 팁 지혈을 제공합니다. </li></ol></li><li> 깊은 해부. 참고 : 아래로 소켓에서 눈을 당겨 결막에 부드러운 견인과 함께, 우수한 궤도 근육이보기에 올 것이다. 시신경을 노출하기 위해 절단이 근육 및 레트로 안와 지방이 제거되어야한다. 지방은 폐기 할 수 있으며 주사 후 대체되어서는 안된다. 이 시점에서, 시신경 근막은 경질에 싸여 혈관 (그림 1)과 함께, 시신경 자체의 번들로 볼 수 있어야합니다. <ol><li> 적은 외상 피어싱 만들기 위해 메스 또는 31 게이지 경 바늘을 사용하여 경질의 작은 절개를합니다. </li></ol></li></ol> 4. 피펫 인젝터 <ol><li> 50 ~ 100 μm의 직경에 유리 마이크로 피펫을 당깁니다. 안정성을 제공하기 위해, 미세 조작기에 마이크로 피펫을 탑재하고 주입 펌프에 연결 해밀턴 주사기에 부착. </li><li> 구슬을 당겨 (또는 줄기 세포)전후 메틸 블루 용액 0.5 μL 부피와 함께 역행 마이크로 피펫으로 0.5-1.0 μL 부피 재구성. 주 : 분당 0.5 μL로 설정 주입 속도는 시신경에 외상을 방지한다. </li></ol> 5. 주입 <ol><li> 단지 흠 경질 위의 시신경 상에 마이크로 피펫의 팁을 낮 춥니 다. 참고 : 최소한의 피해 시신경 결과에 유리 팁의 작은, 그러나 활발한 움직임. 주입 펌프가 시작될 때, 메틸 청색 염료 주입 시신경의 영역을 강조한다. 염료는 지주막 하 공간에 누출하지 않고 시신경 내에서 현지화 된 상태로 유지해야한다. </li><li> 줄기 세포 주입이 완료되면 결정 및 메틸 블루 제를 주입 도즈로 주입 펌프를 끄지 메틸 청색의 제 2 대역을 따르. 높은 방지하기 위해 주입 각 1 μL 볼륨 2 분 동안 시신경 내에서 여전히 마이크로 피펫을 유지마이크로 피펫의 철수시 압력 방출. 참고 : 또 다른 방법은 수동으로 조작 할 수있는 공기 충전 주사기에 피펫 팁을 연결하는 것입니다. 어느 쪽이든, 시신경의 손상을 최소화하기 위해 과도한 힘을 피하십시오. 우리는 각각의 시신경에 볼륨 더 이상 2보다 μl를 주입하는 것이 좋습니다. </li></ol> 6. 후속 <ol><li> 즉시. <ol><li> 주입이 완료되면, 지혈을 제공하기 위해 사용되는 임의의면을 따라 팁을 마이크로 피펫을 제거한다. 3-0 실크 피부를 봉합하고 결막 봉합을 제거합니다. </li><li> 그들이 마취에서 나타날 때까지 가열 패드에 따뜻한 쥐를 유지합니다. 이 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 무인 동물을 두지 마십시오. 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사에 수술을 한 동물을 반환하지 않습니다. </li><li> 동물 과도한 혼수, 운동 실조, 또는 수고 숨쉬기를 포함하여 고통의 징후를 보이는 경우G는, 매일 세 번까지의 근육 부 프레 노르 핀 (0.05 ㎎ / ㎏)와 적절한 진통제를 관리 할 수​​ 있습니다. </li></ol></li><li> 장기간. <ol><li> 다음 24 ~ 48 시간 동안, 부종 또는 방전 상처에서 또는 가창, 구부리고 모양이 아닌 스타일리스트, 또는 식사를하지 고통의 징후를 포함하여 수술의 합병증 쥐를 관찰합니다. 필요에 따라 수의사 또는 윤리 안락사와의 협의를 생각해 보자. </li></ol></li></ol>

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</ol>

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줄기세포의 시신경에 직접 주사하거나 재생을 촉진하기 위한 기타 제품은 CNS에 주입하는 다른 수단에 비해 편리한 모델을 제공합니다. 이 기술은 시간이 덜 걸리고, 전체 마취가 덜 필요하며, 두개골이나 뼈 조직을 뚫거나 제거하는 것을 피하고, 합병증 발생률을 줄이고, 수술 후 보다 빠른 회복을 가능하게 합니다. 
이 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다: 1. 시신경 다발을 명확하게 시각화할 수 있도록 수술 부위에서 적절한 지혈, 2. 최소한의 외상으로 시신경에 쉽게 삽입할 수 있도록 피펫 팁을 정확하게 측정, 3. 시신경을 최적으로 노출할 수 있는 결막 봉합사를 사용하여 눈을 엄격하게 제어합니다. 
시신경에 대한 대체 측면 접근법은 두개골을 해부하지 않고 시신경에 직접 주입할 수 있는 대안이 이전에 설명되었습니다. 6 우리의 경험에 따르면 측면 보기는 망막 바로 뒤의 최근위 시신경에 더 제한됩니다....

시신경은 중추 신경계 (CNS) 등 시신경염, 녹내장 및 외상 등의 안과 조건을 포함 재생 연구를위한 이상적인 위치를 제공합니다. 줄기 세포의 다양한 주사 어느 축삭 카운트를 증가 및 / 또는 퇴행성 질환 예방 효능을 입증되거나 손실 미엘린 장착에 약속을 보여 주었다. 1,2 인간의 시신경이 약 3.0-3.5 mm의 직경 chiasm에 망막에서 여행 약 120 만 병렬 축삭이 포함되어 있습니다. (3) 실험실에서 인간의 질병을 모델링하기 위해, 쥐가 자주 사용되어왔다. 성인 쥐의 시신경은 약 0.5 mm의 직경 내에서 약 10 만 축삭이 포함되어 있습니다. 중추 신경계의 주요 제한 4 중 하나를 재생 연구 직접 뼈없는 액세스입니다. 동물에 합병증 및 수술 위험은 두개골이나 척추가 제거 될 때 더 높다. 의 장점과 유사척추 최소 침습 방법, 두개골의 서비스 감소 합병증과 더 빠른 회복을 열지 않고 5 직접 시신경 주사. 이 기법은 이전 연구에서 이용되고있다. (6)이 원고 및 첨부 영상에서는 쥐 시신경에 줄기 세포를 주입하는 최소 침습 절차를 보여준다.

<table><tbody><tr><td>루이스 쥐</td><td>찰스 리버</td><td>4</td><td>모든 쥐 균주가 작동합니다.</td></tr><tr><td>마취 기계</td><td>Surgivet</td><td>CDS9000</td><td>CDS 9000 소동물 마취 기계 - 기둥 마운트</td></tr><tr><td>주입 펌프</td><td>스톨팅</td><td>53129</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>National Optical</td><td>409-411-1105</td><td></td></tr><tr><td>광섬유 광원</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-562-21</td><td></td></tr><tr><td>해부 및 입체 기기</td><td>스톨팅</td><td>51400</td><td></td></tr><tr><td>피펫 풀러</td><td>Kopf</td><td>750</td><td></td></tr><tr><td>피펫</td><td>세계 정밀 기기</td><td>18150-6</td><td></td></tr><tr><td>일회용 메스 블레이드</td><td>Harvard Apparatus</td><td>810-15-021</td><td></td></tr><tr><td>홍채 절제술 가위</td><td>전자 현미경 과학</td><td>Uniband LA-4XF</td><td></td></tr></tbody></table>

쥐 시신경에 주입을위한 최소 침습 기술

Minimally-invasive Technique for Injection into Rat Optic Nerve

쥐의 시신경은 줄기세포 재생 연구에 유용한 모델입니다. 쥐의 시신경에 직접 주입하면 뼈를 제거하지 않고 최소 침습 수술로 중추 신경계로 전달할 수 있습니다. 이 기술은 안와 융기에서 경미한 근막 절개 후 시신경을 시각화하고 직접 주입하는 접근 방식을 설명하며, 결막 견인 봉합사를 사용하여 눈을 부드럽게 아래로 당겨 빼냅니다. 주입된 시신경의 대표적인 예는 염색된 비드의 성공적인 주입을 보여줍니다.

실험의 결론에서, 래트를 희생시키고 4 % 파라 포름 알데히드 관류. 시신경 조심스럽게 해부하고 저온 유지 절편에 마운트 하였다. 2 에반스 청색 염료 사이트를 시각화하기 위해 주입되는 저전력 쥐 전체 시신경의 일례를 도시한다. 화살표는 주사의 정확한 위치를 식별합니다. 신경 아래 염료의 확산에 의해 한정되는 바와 같이이 절개가 분사 몇 분 이내에 완료되었다. 다른 주사에서는 몇 시간에 걸쳐 광학 chiasm 향해 염료의 느린 확산을 관찰 하였다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52249/52249fig1highres.jpg" /> 그림 1 :.보기의 외과 분야 쥐가이 그림에서 왼쪽 눈에 액세스하는 위치입니다. 절개 궤도 능선과 근막 위에 만들어진다조직은 눈 뒤에는 해부된...

쥐의 시신경에 직접 주입하는 것은 재생 연구에 유용합니다. 우리는 두개골을 열지 않는 쥐의 시신경에 직접 주입하는 최소 침습적 기술을 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 수술 합병증을 최소화하고 회복 속도가 빨라집니다.

The rat optic nerve is a useful model for stem cell regeneration research. Direct injection into the rat optic nerve allows delivery into the central ...

본 절차의 전반적인 목적은 살아있는 쥐의 시신경에 약물이나 줄기세포를 주입하기 위한 최소 침습적 접근법을 제공하는 것입니다. 이를 위해 먼저 쥐를 마취시켜 해부대 위에 배치하고, 안구 조작을 위해 결막에 봉합사를 삽입합니다. 이후 두 번째 단계로, 안구 뒤쪽의 안와 능선을 절개하여 시신경을 노출시킵니다.다음으로, 유리 피펫을 시신경에 삽입하고, 수술 부위를 봉합하여 쥐를 마취에서 깨우기 전에 약물이나 줄기세포를 주입합니다. 최종적으로 일정 시간이 지난 후 쥐를 희생시켜 시신경을 박리하며, 수술적 주입 또는 이식의 효과를 현미경으로 관찰할 수 있습니다. 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 최소 침습적 접근 방식이라는 점이며, 이를 통해 필요한 기간만큼 쥐를 생존시킬 수 있습니다.수술적 주입 또는 이식의 효과를 연구합니다. 실험 절차의 시연은 본 연구실의 학생 기술자인 Kate Schwartz가 담당합니다. 모든 수술 절차는 2~3% isof fluorine 마취 하에 수행하십시오.발가락 꼬집기와 호흡수를 통해 적절한 수준의 마취 상태를 확인하십시오. 발가락을 꼬집었을 때 쥐가 움찔거리지 않는지 확인합니다. 시술 중 머리가 움직이지 않도록 필요에 따라 동물을 고정하십시오.그런 다음 수술할 눈에 리도카인 한 방울을 떨어뜨립니다. 마취 상태에서 건조증을 방지하기 위해 10분마다 인공눈물을 사용하십시오. 수술 전 buprenorphine 0.01 mg/kg을 피하 주사하고, 이후 필요에 따라 6~8시간마다 투여합니다.가열 패드를 사용하여 동물을 따뜻하게 유지합니다. 알코올로 두피의 털을 적십니다. 이때 눈에 노출되지 않도록 주의합니다.수술 후 감염 위험을 최소화하기 위해 반드시 멸균 도구와 멸균 기술을 사용하십시오. 다음으로 결막 외측에 4-0 봉합사를 배치하고, 가벼운 견인이 가능하도록 충분한 길이의 봉합사로 묶습니다. 안와 능선 위쪽 피부를 약 1인치 길이로 절개합니다.10번 메스를 사용하여 피부와 하부 근막을 견인하고 근막을 조심스럽게 박리합니다. 수술 부위로 과도한 출혈이 발생하는 것을 방지하기 위해, 상안와낭(superior orbital sac)이 노출될 수 있도록 견인된 피부에 봉합사를 한 번으로 고정합니다.근막을 박리할 때 혈관이 절단되지 않도록 주의하십시오. 결막을 부드럽게 견인하여 안구를 안와 밖으로 아래쪽과 바깥쪽으로 당기면 상안와근이 보일 것입니다. 시신경을 노출시키기 위해서는 안와 뒤쪽의 지방을 제거하고 이 근육을 절단해야 합니다.지방은 제거하며 주입 후 다시 채워 넣지 않아야 합니다. 이 시점에서 시신경 근막은 경막으로 둘러싸인 혈관과 함께 시신경 자체의 다발 형태로 보여야 합니다. 더 깊은 박리를 수행하려면 메스나 31게이지 베벨 바늘(beveled needle)을 사용하여 DRA에 작은 절개를 가해 천자 시 조직 손상을 줄이고, 안정성을 확보하기 위해 직경 50~100 µm의 유리 마이크로 피펫을 준비하십시오.마이크로 피펫을 마이크로 매니퓰레이터에 장착하고 20 cc 플라스틱 시린지에 연결합니다. 유리 피펫에 염료를 채우기 전과 후에, 0.5 µL의 메틸 블루 용액과 함께 0.5에서 1 µL로 재구성된 비드 또는 줄기세포를 마이크로 피펫 내부로 역방향으로 흡입합니다. 1 cc 시린지와 30게이지 바늘을 사용하여 마이크로 피펫의 팁을 절개된 경막 바로 위의 시신경 위에 내립니다.플런저에 천천히 일정한 압력을 가하면서 유리 팁을 시신경 속으로 작고 빠르게 움직여 삽입하면 손상을 최소화할 수 있습니다. Evans blue 염료는 주입된 시신경 부위를 강조해야 합니다. 염료는 지주막하 공간으로 누출되지 않고 시신경 내에 국소적으로 유지되어야 합니다.Evans Blue 염료의 두 번째 밴드를 따라가며 줄기세포 주입이 완료되는 시점을 확인하십시오. 필요한 부피가 시신경에 주입되면 플런저를 놓으십시오. 주입 완료 후 마이크로 피펫을 제거할 때 높은 압력으로 인해 시료가 역류하는 것을 방지하기 위해, 마이크로 피펫을 시신경 내에 5분 동안 그대로 유지하십시오.지혈을 위해 사용한 면봉과 함께 마이크로 피펫을 제거합니다. 3.0 silk로 피부를 봉합하고 결막 봉합사를 제거합니다. 쥐가 마취에서 깰 때까지 가열 패드 위에서 따뜻하게 유지합니다.동물이 흉곽 거상 자세(sternal recumbent)를 유지할 수 있을 만큼 충분히 의식을 회복할 때까지 방치하지 마십시오. 과도한 무기력증, 운동실조 또는 호흡 곤란을 포함하여 동물이 통증 징후를 보일 경우, buprenorphine을 근육 내 투여하여 하루 최대 3회까지 적절한 진통제를 처치하십시오. 실험 후, 쥐를 희생시키고 paraldehyde로 관류하였습니다.시신경을 조심스럽게 박리하여 크라이오스탯 절편 제작을 위해 고정했습니다. 여기에 제시된 예시는 Evans blue 염료를 주입한 쥐의 시신경을 저배율로 관찰한 것입니다. 주입 부위를 시각화하기 위해 화살표로 정확한 주입 위치를 표시했습니다. 염료가 신경을 따라 확산된 범위가 제한적인 것으로 보아, 이 박리 작업은 주입 후 며칠 이내에 수행되었음을 알 수 있습니다.이 기술은 재생 신경학 분야의 연구자들이 탈수초성 질환 쥐 모델에서 시신경을 재생하고 잠재적으로 상실된 시력을 회복시키기 위한 새로운 방법을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

Intravitreous 주사는 안구 질환 또는 현지 치료의 직접적인 응용 프로그램으로 시각 과학 연구에 널리 사용되는 기법입니다. 이 동영상은 유리 피펫과 1ml 주사기를 사용하여 intravitreous 사출을위한 프로토콜을 보여주었다. 과다 출혈 및 렌즈 손상을 피하에 대한 유용한 팁은 주어집니다.

안구 질환 모델 구축을위한 Intravitreous 사출

시신경의 절개면은 성인 CNS 손상의 널리 사용되는 모델입니다. 이 모델은 전 세계적으로 망막을 대상에 직접 망막 신경절 세포의 부상의 연결 인구를 대상으로 실험 조작의 번호를 수행하는 데 이상적입니다.

포유류의 CNS에서 시신경의 절개 후 실험에 대한 노는 방법

이 비디오는 마취된 동물의 시신경에 외과적으로 접근하여 국소 탈수초를 유도하기 위해 리솔레시틴을 정확하게 전달하여 추가 연구를 위한 신경 병리학적 조건을 만드는 절차를 보여줍니다.

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