쥐 시신경에 주입을위한 최소 침습 기술

이 절차의 전반적인 목표는 살아있는 쥐의 시신경에 약물이나 줄기세포를 주입하는 최소 침습적 접근 방식을 제공하는 것입니다. 이것은 먼저 쥐를 마취하고, 박리대에 놓고, 눈을 조작하기 위해 결막에 봉합사를 삽입함으로써 이루어집니다. 나중에 두 번째 단계는 눈 뒤의 안와 융기를 절개하여 시신경을 노출

다음으로, 유리 피펫을 시신경에 삽입하고 약물 또는 줄기 세포를 주입한 후 수술 부위를 봉합하고 쥐를 마취에서 소생시킵니다. 궁극적으로 일정 시간이 지나면 쥐를 희생하고 시신경을 절개하며 외과적 주사 또는 이식의 효과를 현미경으로 시각화할 수 있습니다. 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 접근 방식이 최소 침습적이며 필요한 만큼 쥐가 생존할 수 있다는 것입니다.

외과적 주사 또는 이식의 효과를 연구합니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 학생 기술자인 Kate Schwartz입니다. 모든 수술은 마취 하에 2-3%의 불소를 투여하여 시행한다.

발가락 꼬집음과 호흡 속도에 의한 적절한 마취 수준을 확인하십시오. 쥐가 발가락에 반응하여 움찔하지 않는지 확인하십시오. 꼬집다. 시술 중 머리가 움직이지 않도록 필요에 따라 동물을 고정합니다.

그런 다음 수술용 눈에 리도카인 한 방울을 떨어뜨립니다. 마취 상태에서 건조를 방지하기 위해 10분마다 인공 눈물을 사용하십시오. 수술 전에 부프레노르핀을 킬로그램당 0.01mg씩 피하주사로 투여한 후 필요에 따라 6-8시간마다 주사합니다.

발열 패드로 동물을 따뜻하게 유지하십시오. 두피 털에 알코올을 적십니다. 눈에 노출되지 않도록 주의하십시오.

수술 후 감염의 위험을 최소화하기 위해 멸균 도구와 멸균 기술을 사용하십시오. 다음으로, 외측 결막에 4개의 봉합사를 놓고 부드러운 견인력을 허용하기에 충분한 봉합사로 묶습니다. 안와 융기 위에 있는 피부를 대략 1인치 절개합니다.

크기 10 메스를 사용합니다. 피부와 밑에 있는 근막을 수축시키고 근막을 조심스럽게 절개합니다. 수축된 피부에 봉합사 하나를 삽입하여 상안와낭이 노출되도록 하여 수술 부위로의 과도한 출혈을 방지합니다.

근막을 절개하는 동안 혈관을 절단하지 마십시오. 결막을 부드럽게 당기고 눈을 아래로 당겨 눈구멍 밖으로 빼내면 상부 안와 근육이 시야에 들어옵니다. 시신경을 노출시키기 위해서는 후안와지방을 제거하고 이 근육을 잘라내야 합니다.

지방질은 버려질 수 있고 주입 후에 대체되면 안됩니다. 이 시점에서, 시신경 근막은 경막으로 감싼 혈관과 함께 시신경 자체의 다발로 보여야 합니다. 더 깊은 해부를 위해 메스 또는 31 게이지 베벨 바늘을 사용하여 DRA를 작게 절개하여 피어싱이 덜 외상되도록하고 안정성을 제공하기 위해 직경 50-100 미크론의 당겨진 유리 마이크로 피펫을 준비했습니다.

마이크로 피펫을 마이크로 매니퓰레이터에 장착하고 20cc 플라스틱 주사기에 부착합니다. 유리 피펫에 염료를 주입하기 전과 후에 0.5 마이크로리터의 메틸 블루 용액과 함께 0.5-1 마이크로리터로 재구성된 비드 또는 줄기 세포를 마이크로피펫 역행으로 끌어올립니다. 1cc 주사기와 30게이지 바늘을 사용하여 마이크로 피펫의 끝을 흠집이 난 경막 바로 위의 시신경으로 내립니다.

유리 팁이 시신경으로 작지만 빠르게 움직이면 플런저에 느리고 지속적인 압력을 가하면서 손상을 최소화할 수 있습니다. Evans 파란색 염료는 주입된 시신경 부위를 강조해야 합니다. 염료는 지주막하 공간으로 누출되지 않고 시신경 내에 국한되어 있어야 합니다.

Evan's Blue Dye의 두 번째 밴드를 따라 줄기 세포 주입이 완료되는 시점을 확인합니다. 필요한 양이 시신경에 주입되면 플런저를 놓으십시오. 주입이 완료되었을 때 마이크로 피펫을 빼낼 때 고압 배출을 방지하기 위해 마이크로 피펫을 시신경 내에 5분 동안 가만히 두십시오.

지혈을 제공하는 데 사용되는 면 팁과 함께 마이크로 피펫을 제거합니다. 3.0 실크로 피부를 봉합하고 결막 봉합사를 제거합니다. 쥐가 마취에서 나올 때까지 발열 패드에서 쥐를 따뜻하게 유지하십시오.

동물이 흉골 누운 상태를 유지할 수 있을 만큼 충분한 의식을 회복할 때까지 동물을 방치하지 마십시오. 동물이 과도한 무기력, 운동 실조 또는 호흡 곤란을 포함한 통증 징후를 보이는 경우 하루 최대 3회까지 근육 주사 부프레노르핀으로 적절한 진통제를 투여합니다. 실험이 끝난 후, 쥐를 희생시키고 파라알데히드를 관류시켰다.

시신경은 저온 유지 절편을 위해 조심스럽게 해부되고 장착되었으며, 여기에 표시된 것은 Evan의 파란색 염료가 주입된 저전력의 쥐구멍 시신경의 예입니다. 부위를 시각화하기 위해 화살표는 주입의 정확한 위치를 식별합니다. 이 박리는 주입 후 며칠 이내에 이루어졌으며, 이는 염료가 발달 후 신경을 따라 제한적으로 확산되는 것으로 나타났습니다.

이 기술은 재생 신경학 분야의 연구자들이 시신경을 재생하고 이 탈수초성 질병의 쥐 모델에서 잃어버린 시력을 잠재적으로 회복할 수 있는 새로운 방법을 모색할 수 있는 길을 열었습니다.