Name: 말초 혈액에서 인간 Alloantigen 특정 T 세포의 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: 배우세요 말초 혈액에서 인간 Alloantigen 특정 T 세포를 분리하고 복제하는 방법을. 밀도 구배 원심분리, 자기 분리, 유세포 분류술을 활용하여 면역학 및 이식 생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

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저자는 테트라머 생산에 대해 NIH Tetramer Core Facility에 감사를 표합니다. 저자는 또한 세포 분류에 도움을 준 UCSD Human Embryonic Stem Cell Core Facility 유세포 분석 실험실의 E.D. O'Connor와 K.E. Marquez에게 감사의 뜻을 전합니다. 이 작업은 미국 국립보건원(National Institutes of Health) 보조금 K08AI085039(GPM)의 지원을 받았습니다.

참고 :이 프로토콜은 인간의 자원 봉사자 말초 혈액 샘플의 사용이 필요합니다. 인간을 대상으로 모든 연구를 검토하고 헬싱키 선언 (2013)과 건강 보험 양도 및 1996 년 책임에 관한 법안을 준수하기 위해 인간 연구 윤리 심의위원회의 승인을 받아야한다. 전혈에서 T 세포의 분리 1. <ol><li> 시작에 앞서, 실온 밀도 구배 매질을 따뜻하게. 나누어 2-4 멸균 15 ml의 원추형 원심 분리 튜브에 밀도 구배 배지 4 ㎖ (1 관 각각 10 ml의 희석 된 혈액의 총량에 대해 사용된다). </li><li> 1-2 나트륨 헤파린 스프레이 혈액의 10 ~ 20 ml의 코팅 (녹색 위) 정맥 혈액 수집 튜브를 얻습니다. 교육을받은 사람의 감독하에 인간의 표본을 수집하고 심사위원회 (Institutional Review Board)에 따라 프로토콜을 승인했다. </li><li> 70 % 에탄올로 튜브의 외부를 닦으십시오. 조심스럽게 Fi의 꼭대기를 제거수집 튜브를 채워하고 멸균 50 ㎖ 원심 분리 튜브로 혈액을 가만히 따르다. </li><li> 각각의 혈액 수집 튜브에 10 ㎖의 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)를 첨가. , PBS를 수집 경사 전체 혈액에 넣어 천천히 섞는다. </li><li> 25 μL 인간 T 세포 농축 칵테일 / 2 ml의 전체 볼륨을 추가합니다. 20 분 동안 실온에서 인큐베이션. </li><li> 부드럽게 밀도 구배 배지 위에 한 혈액 희석 : 10 ㎖를 피펫을 사용하여, (1) 10 ㎖까지 층. 밀도 기울기 매체의 표면을 방해하지 않도록주의하십시오. </li><li> 20 오 C. 원심 분리기 계층화 혈액 및 밀도 구배 매체를 20 분 동안 1,200 XG에 </li><li> 밀도 구배 매질 및 밀도 구배 매체 희석 플라즈마 사이의 계면에서 백혈구의 층 사이의 계면을 방해하지 않도록주의하면서, 원심 분리기에서 튜브를 제거한다. 5 ml의 피펫을 사용하여 조심스럽게 백혈구 층을 수집하고 새로운 무균 50 ㎖ 원뿔형 욕조로 전송할전자. </li><li> 50ml로 수집 된 PBL의 볼륨을 가지고 부드럽게 섞어 PBS를 추가합니다. </li><li> 20 O ℃에서 5 분 동안 600 XG에 원심 분리기 가만히 따르다. </li><li> 이 재현 탁 완충액 (PBS 멸균 여과는 1 % BSA 함유) 정렬 계측법 10 ㎖의 멸균 유동 세포를 펠렛 화. 샘플 세포 현탁액 10 μL, 1:10 희석는 혈구 세포를 사용하는 계산 트리 판 블루 (90 μL에 추가) (예상 수익률을 1-4 × 10 6 세포 전체 혈액의 / 튜브). <ol><li> 5 ML 튜브로 전송, 1 ml의 나누어지는 제거, 사량으로 표시하지 T 세포의 분석을 위해 얼음에 보관하십시오. 얼음에 세포 현탁액을 유지합니다. </li></ol></li></ol> Alloantigen 특정 T 세포의 2 마그네틱 심화 <ol><li> 1 alloantigen pMHC의 사량을 희석 : (100)를 멸균 종류의 버퍼에. </li><li> 원심 분리기에서 세포 현탁액 20 오 C.에서 5 분 동안 600 XG에 (단계 1.11 9 ml) 중 가만히 따르다. </li><li> 펠렛에 pMHC 량체 alloantigen 희석의 50 μl를 추가세포 (10 7 세포까지). 부드러운 피펫 팅으로 섞는다. 멸균 5 ML 튜브로 전송합니다. 실온에서 30 분 동안 인큐베이션. </li><li> 일종의 버퍼 2 ML을 추가합니다. 20 O ℃에서 5 분 동안 600 XG에 원심 분리기 가만히 따르다. </li><li> 100 μL 종류의 버퍼에 재현 탁 세포. 10 μL 비오틴 선택 칵테일을 첨가하고, 실온에서 15 분 동안 배양한다. </li><li> 5 ㎕의 자성 나노 입자를 첨가하고, 실온에서 10 분 동안 배양한다. </li><li> 2.5 ml의 정렬 버퍼와 피펫으로 부드럽게 혼합 추가합니다. 5 ML 튜브로 전송, 100 μL 나누어지는 제거 및 사전 농축 세포의 분석을 위해 얼음에 보관하십시오. </li><li> 세포 분리 자석에 세포 현탁액을 함유하는 5 ㎖의 튜브를 놓는다. 캡 튜브 위에 느슨하게해야한다. 실온에서 5 분 동안 인큐베이션. </li><li> 부드럽게 튜브의 캡을 제거합니다. 함께 튜브와 자석을 잡고, 신선한 5 ML 튜브로 튜브의 내용을 가만히 따르다. 누르거나 튜브의 내용을 흔들지 마십시오액체의 마지막 방울을 제거합니다. </li><li> 자석에서 튜브를 제거합니다. 2 ml의에게 차가운 종류의 버퍼를 추가하고 피펫으로 가볍게 섞는다. 이 혈구를 사용하여 세포를 계산하는 트리 판 블루 (10 μL에 추가) : 샘플 세포 현탁액 10 μL은, (1) 희석. </li></ol> 단일 셀 유동 세포 계측법 셀 정렬에 대한 T 세포의 3. 준비 <ol><li> 세포의 모든 튜브에 차가운 종류의 버퍼를 추가 (사량 레이블, 사량 표지 농축 - 유엔, 사량 표지 농축) 3 ㎖에 볼륨을 가지고. </li><li> 4 O C에서 5 분 600 XG에 원심 분리기 및 캔트 버퍼는 세포를 복구 할 수 있습니다. </li><li> 25 μl의 차가운 종류의 버퍼에 펠렛 세포를 재현 탁. 5 μL 인간의 Fc 블록을 추가합니다. 20 분 동안 얼음에 품어. </li><li> 유동 세포 계측법 정렬에 대한 항체를 준비합니다. 15 μL 정렬 버퍼, 15 μL 안티 CD5, 15 μL 항 CD14, 15 μL 항 CD19를 섞는다. </li><li> 세포의 각 튜브에 항체 혼합물의 20 μl를 추가합니다. 20 분 동안 얼음에 품어. </li><li> 각각의 튜브에 차가운 종류의 버퍼의 2 ML을 추가합니다. </li><li> 4 O C에서 5 분 600 XG에 원심 분리기 및 캔트 버퍼는 세포를 복구 할 수 있습니다. </li><li> 정렬 버퍼에 1~2 × 106 세포 / ml의 농도로 세포를 재현 탁. </li><li> 인간 T 세포 배양 배지의 분취 량 100 ㎕를가 (Iscove의 DMEM 2 mM의 루타, 10 mM의 HEPES, 50 ㎍ / ml의 겐타 마이신, 50 μM 2- 머 캅토 에탄올, 10 % 열 - 불 활성화 된 인간 AB 혈청, 2.5 NG / ml의 재조합 인간 보충 IL-2)를 96 웰 둥근 바닥 세포 배양 플레이트의 각 웰에. 얼음에 보관하십시오. </li></ol> 단일 셀 유동 세포 계측법 정렬하여 테트라 머 표지 T 세포 4. 분리 <ol><li> alloantigen-pMHC 량체 표시된 T 세포 (그림 2.A)를 식별하는 게이팅 매개 변수 유동 세포 계측법을 설정합니다. B 세포와 CD14를 발현하는 CD19를 제외, 림프구에 이중선, 게이트를 제거하는 전략을 게이팅 설정하기 위해 사전 농축 사량 표시된 부분을 사용하여단핵구를 발현하고, CD5 식에 의해 T 세포를 식별. (사량으로 표시하지 샘플에서 세포가이 게이트 내에해야한다 - - CD19 CD5 + CD14의 0 %로) 사량 결합 T 세포의 식별을위한 게이팅을 설정하는 형광으로 사량을 뺀 컨트롤을 표시하지 샘플을 사용 . NOTE : 지나치게 제한 게이팅 전략 절연 T 세포의 수를 줄이는 반면, 특정 항원되지 않은 T 세포 또는 T 세포의 분리 될 것이다 충분히 엄격한 아닌 전략을 게이팅. </li><li> 단일 세포 종류의 플레이트 매개 변수를 프로그래밍합니다. CD19 - - 각 웰의 사량 + 셀 (1) CD5 + CD14을 배치 할 분류기을 지시. 각 행의 (그림 2.B 잘 (세포 - CD19 - - 사량 100 CD5 + CD14)을 잘 한 음성 대조군 (어떤 세포가 우물에 분류 없음)과 1 개의 긍정적 인 제어를 포함하도록 설정 판을 직접 </strong&gt;). </li><li> 게이팅 전략 및 플레이트 셋업 계측법 확립 흐름을 사용하여, 직접 유세포 셀 소터를 사용하여 96 웰 플레이트에 각각의 사량 체 - 결합 T 세포를 분리. </li></ol> 5. 문화 및 Alloantigen 특정 T 세포 클론의 확장 <ol><li> 20 O ℃에서 세포 분류, 5 분 600 XG에 원심 분리기 판의 완료 후 6 % CO 2 배양기에서 37 O C에서 개최 배양 플레이트. </li><li> 30 초 동안 소용돌이 자극 항 CD3 / 안티 CD28 마이크로 비드는 구슬을 재현 탁합니다. </li><li> 수집 된 T 세포의 자극에 필요한 활성제 비드 부피 (활성제 마이크로 비드 / 웰의 0.5 μl를) 계산한다. 멸균 5 ML 튜브에 자극 구슬의 계산 된 볼륨을 전송합니다. 1 ml의에게 인간 T 세포 배양 배지와 소용돌이를 추가합니다. </li><li> 자석의 마이크로 비드 서스펜션 튜브를 놓습니다. 캡 튜브 위에 느슨하게해야한다. 실온에서 2 분 동안 인큐베이션. </li><li> 부드럽게 제거튜브의 캡. 신선한 5 ML 튜브에 함께 캔트 튜브의 내용을 튜브와 자석을 들고. 누르거나 튜브의 내용을 흔들지 마십시오. </li><li> 자석에서 튜브를 제거합니다. 인간 T 세포 배양 배지를 추가 (마이크로 비드 100 ㎕ 매체 / 0.5 μL는 처음에 추가). </li><li> 나누어 96 웰 플레이트의 각 웰에 활성제 비드 현탁액 100 ㎕. 6 % CO 2 배양기에서 37 O C에서 배양 플레이트를 품어. </li><li> 현미경 검사에 의해 매일 세포의 성장을 모니터링합니다. 문화의 7 일 (그림 3.A) - 증식하는 세포의 작은 클러스터는 5 후 현미경으로 관찰 할 수있다. NOTE :이 시점에서 T 세포 배양의 시각화가 어려울 수 있으며,이 단계에서 관찰 가능한 셀 클러스터의 부재가 성장하는 T 세포의 결여를 지시하지 않을 수있다. </li><li> 세포 격리 후 십사일에서 조심스럽게 문화의 상단 오프 미디어 100 μl를 제거하여 피드 문화 100 μ로 교체고 l 신선한 인간 T 세포 배양 배지. 6 % CO 2 배양기에서 37 O C에서 배양 플레이트를 배양 계속합니다. </li><li> 현미경 검사 및 배지의 색의 평가에 의해 매일 세포 성장을 모니터링. 3 일 매체 변경 후 - 대형 전지 클러스터는 현미경 2 볼 수 있어야합니다. 거시적으로, 세포 펠렛은 매체 변화에 따른 14 일 동안 볼 수있게해야합니다. </li><li> 세포 격리를 다음 이십팔일에서 현미경 검사로 성장하는 클론을 식별합니다. 200 μl의 인간 T 세포 배양 배지를 함유하는 48 웰 조직 배양 플레이트의 개별 웰에 성장 양성 96- 웰 플레이트의 배양을 200㎕ 부피를 전송합니다. </li><li> 항 CD3 자극 / 항 CD28 마이크로 비드 12.5 μl를 함유하는 100 μl를 추가 (- 5.6 섹션 5.2에 기재된 바와 같이 제조 됨). 6 % CO 2 배양기에서 37 O C에서 배양 플레이트를 품어. </li><li> 현미경 전 매일 문화의 성장을 모니터링민화 및 배지의 색의 평가. T 세포 배양은&gt; 2 × 6 / ㎖에 도달 할 때 (일반적 3-5일 재 자극 후, 미디어 시작되는 날에 의해 추정 될 수 지푸라기 황변)를 24- 웰 조직 배양 플레이트의 웰에, 전사 문화 500 μl의 인간 T 세포 배지를 추가한다. </li><li> 10~14일에서 pMHC 량체의 분석 바인딩 (섹션 3, 4.1에 기술 된 라벨 및 게이트 전략을 사용하고 있습니다) 유동 세포 계측법에 의해 alloantigen 특이성을 평가하기 위해 T 세포 배양 200 μl를 수집, 재 자극 따릅니다. </li></ol> 6. 장기 다시 자극 및 문화 T 세포 클론의 <ol><li> 지속적으로 14 일마다 할 수 있습니다 원하는 특이 클론 T 세포 배양을 다시 자극하고 확장합니다. 마지막 항 CD3 / CD28의 마이크로 비드 자극 다음 14 일에서 멸균 5 ML 튜브에 T 세포 배양를 수집합니다. 2.5 ml의 부피로, 하나의 튜브에서 동일한 T 세포 클론의 여러 웰을 결합. </li&gt; <li> 2.5 ml의에 최종 볼륨을 가져오고 피펫으로 부드럽게 혼합 매체를 추가합니다. </li><li> 배양 물로부터 이전 마이크로 비드를 제거하기 위해 세포 분리 자석으로 T​​ 세포 배양을 포함하는 5 ㎖의 튜브를 놓는다. 캡 튜브 위에 느슨하게해야한다. 실온에서 5 분 동안 인큐베이션. </li><li> 부드럽게 튜브의 캡을 제거합니다. 함께 튜브와 자석을 잡고, 신선한 5 ML 튜브에 세포 현탁액을 가만히 따르다. 누르거나 액체의 마지막 방울을 제거하기 위해 튜브의 내용을 흔들지 마십시오. </li><li> 4 ml의 최종 볼륨을 가지고 매체를 추가합니다. 샘플 10 μL은 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다. </li><li> 실온에서 5 분 동안 600 XG에서 원심 분리하여 T 세포 복구. </li><li> 가만히 따르다 뜨는. 10 106 세포 / ml의 인간 T 세포 배양 배지에 재현 탁 T 세포. 전송 한 24 웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 분취 량. </li><li> 자극 항 CD3 / 12.5 μl를 함유하는 100 ㎕의 미디어를 추가하여 T 세포를 자극 재NTI-CD28 마이크로 비드 (- 5.6로 섹션 5.2 참조). 6 % CO 2 배양기에서 37 O C에서 품어. </li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다.

T 세포 동종 반응성은 오랫동안 연구되고 임상적으로 관련된 현상입니다. 동종 자극에 대한 T 세포의 강력한 증식 및 이펙터 반응은 비활성화된 동종 세포에 대한 말초 혈액 T 세포의 비교적 간단한 혼합 림프구 반응을 통해 시험관 내 인간 T 세포 반응의 광범위한 분석을 가능하게 했습니다. 그러나, 이러한 일차 동종 반응성 T 세포 반응은 특정 동종 항원에 반응하는 다수의 개별 T 세포로 구성된 올리고클론입니다. T 세포 반응의 이러한 다양성은 동종 반응성 T 세포 반응을 유도하는 pMHC 리간드 인식의 생화학을 검사하는 능력을 손상시킵니다. 이 문제에 대한 표준 솔루션은 주어진 동종 세포주를 사용한 반복 자극과 제한 희석 분석을 통해 클론 T 세포주를 생성하는 것이었습니다. 이 접근법은 단일 특이성을 가진 클론 T 세포주를 생성할 수 있지만 나이브 T 세포의 올리고클론 반응의 원래 구성을 반영하지 않을 수 있습니다. 또한, 이 접근법은 인식된 특정 pMHC 동종항원을 직접 식별하지 않습니다(단일 HLA 분자에 대한...

T 림프구는 적응 면역 시스템의 중요한 구성 요소입니다. T 세포뿐만 아니라 직접 효과기 메카니즘을 통해 다양한 병원균에 보호 면역 반응을 매개 할뿐만 아니라 적극적으로 자기 면역 관용을 유지하고 면역 체계에서 다른 세포의 반응을 지시 할 책임이있다. 이러한 함수는 T 세포 수용체 (TCR) 결찰, 사이토 카인 및 케모카인, 및 대사 산물 일 포함한 집적 신호의 숫자를 통해 지향된다. 이 적응 면역으로 T 세포의 역할을 정의하는 특성 특이성을 제공하기 때문에 이러한 신호 중, TCR은 특히 중요하다. TCR은 T 세포의 이펙터 기능을 시작하는 신호를 제공하기 위해 민감도와 특이도가 매우 높은 방식으로 MHC (인간의 ortholog의 HLA) 분자 (pMHC 단지)에 의해 제시 선형 펩티드 항원과 상호 작용한다. pMHC 리간드와 TCR 상호 작용의 생화학 매개 변수 T에 대한 특이성뿐만 아니라 제공세포 활성화는 또한 후속하는 T 세포의 기능 (2)에 정 성적 영향을 미친다. 따라서 공부 T 세포의 기능은 종종 정의 항원 특이성 T 세포 클론의 응답을 검사하는 요구한다. 10 8 별개 αβTCRs 3-4 - 약 10 12 αβ의 T 세포를 함유하는 인간 T 세포 구획, 추정 된 107를 포함한다. 이 다양한 레퍼토리 보호 면역에 대한 T 세포 반응을 필요로 할 가능성이 병원균에서 펩타이드의 광대 한 배열의 인식을위한 기회를 제공한다. 그 항원 5 종래 면역 반응의 부재 10-7 - 이는 자기 MHC 제시 주어진 외래 항원에 대한 T 세포 응답의 주파수는 10-4 정도이다 것으로 추정된다. 나이브 T 세포 레퍼토리는 펩티드 항원 및 한계 반응 제시 자기 MHC 인식하는 능력을 보장하기 위해 흉선 선택에 의해 형성된다자기 항원에 대한 펩타이드의 ivity 보호 면역성이 중개 용 잠재 성을 극대화. 이 위반 반응성, 비교적 큰 주파수, 10-3 설계에서 그러나, - 면역 나이브 개체로부터 T 세포 10-4을, 외국인 MHC 분자뿐만 아니라 그들이 제시 내인성 펩티드를 모두 인식 동종 세포 자극에 반응 6. 동종 pMHC 리간드의 인식은 자기 MHC 제시 외국 항원의 인식과 구조적으로 유사하다; TCR은 동종 MHC 분자뿐만 아니라 펩티드 제시 7 모두 중요한 생화학 적 상호 작용을한다. pMHC의 다양성으로부터 동종 자극의 결과로 T 세포 반응의 강력한 특성상 동종 세포 (8)의 표면에 존재하는 복합체. 이것은 각각의 MHC 약 2 × 4 다른 내인성 펩티드 항원 제시 9 것으로 추정된다. 이 B동종 자극에 대한 응답의 readth은 T 세포 alloreactivity 인한, 이러한 숙주 질환 (GVHD) 대 동종 이식 거부 반응 또는 이식편과 같은 임상 적으로 관련 병리학의 중요한 측면이다. 인간 T 세포 alloreactive 반응 연구는 전통적으로 동종 세포 자극 이후 나이브 T 세포의 클론 반응 검사에 의존하고있다. 한계 희석 조합 같은 동종 세포주 반복 자극은 동종의 HLA (10)의 정의와 인식 클론 T 세포를 생성 할 수있다 분석한다. 내인성 pMHC의 크고 다양한 HLA 레퍼토리는 T 세포의 광범위한 레퍼토리를 자극 주어​​진 동종위한 본 복합체 그러나,이 접근법은, 개별 pMHC 동종 리간드에 대한 반응을 검사하는 문제가있다. 이 벌크 인구 자극 제한 희석 방법은 원하는를 Reacti와 T 세포를 분리하기 위해 다수의 클론의 스크리닝을 필요하나의 pMHC 리간드에 대한 vity. 또한, 개별 pMHC 동종 리간드에 반응 T 세포의 빈도는 소정의 항원에 응답하여 인간 T 세포 클론의 효율적인 생성에 대한 장벽을 제공 나이브 T 세포 집단 중에서 비교적 낮다. 식별 및 클론 집단에서 항원 특이 적 T 세포의 분리는 형광 표지 된 pMHC의 다량 체 (11)의 현상에 의해 활성화되었습니다. 이 접근 방법은 스트렙 타비 딘 - 표지 된 형광 물질에 결합함으로써 표시되어 재조합 가용성 바이오틴 MHC 분자에로드 특정 펩타이드 항원을 이용한다. pMHC의 Multimerization 수용성 pMHC 리간드 TCR의 본질적 낮은 (μM)의 친 화성을 보상 결합력을 증가시킨다. 표지 된 세포를 식별하고 유동 세포 계측법에 의해 단리 할 수​​있다. 그러나,이 접근은 아직 일반적이다 나이브 T 세포 집단 중 항원 특이 적 T 세포의 낮은 주파수에 의해 제한된다대부분의 유동 세포 계측기에 대한 정확한 확인 및 정량 한계 이하의 크기 순서. 이러한 한계를 해결하기 위해, 테트라 - 표지 된 세포 pMHC 량체 라벨 및 후속 자성 비드 농축 방법 (12)을 개발되었다. 이 방법은 신뢰할 수있는 검출, 열거 및 저주파수 항원 특이 적 T 세포의 분리를 보여 주었다. 이 프로토콜은 특별히 개별 pMHC 동종 리간드에 반응 인간 T 세포 클론의 생성을위한 유효 프로토콜을 설명한다. 프로토콜은 단일 정렬 세포로부터 T 세포 클론의 생산 (활성화 세포 분류 유세포 인간 T 세포의 생체 외 배양을위한 견고한 방법 alloantigen 특정 인간 T 세포의 분리를 위해 합체 라벨링 및 농축 pMHC (HLA)을 적용 그림 1의 개요).

<table><tbody><tr><td>나트륨 헤파린 정맥 채혈 튜브 16 x 100 mm</td><td>Becton, Dickenson and Company</td><td>366480</td><td></td></tr><tr><td>림포렙</td><td>줄기세포 기술</td><td>7801</td><td></td></tr><tr><td>Rosette Sep 인간 T 세포 농축 키트</td><td>줄기세포 기술</td><td>15061</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS, 1x without Ca or Mg</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6635</td><td></td></tr><tr><td>형광단 표지 pMHC 테트라머</td><td>NIH 테트라머 시설</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>EasySep 비오틴 선택 키트</td><td>Stemcell Technologies</td><td>18553</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Selection</td><td>Magnet Stemcell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>TruStain FcX Human Fc 차단 솔루션</td><td>바이오레전</td>드 <td>422301</td><td></td></tr><tr><td>안티-CD5 PE-Cy7 (클론 UCHT2)</td><td>바이오레전</td><td>드 300621</td><td></td></tr><tr><td>안티-CD14 FITC (클론 HCD14)</td><td>바이오레전</td><td>드 325603</td><td></td></tr><tr><td>안티-CD19 FITC (클론 HIB19)</td><td>바이오레전</td>드 <td>302205</td><td></td></tr><tr><td>이스코브의 DMEM, b-ME 또는 L-글루타민</td><td>없이 코닝</td><td>15-016-CV</td><td></td></tr><tr><td>헤페스</td><td>코닝</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>b-메르캅토에탄올&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>글루타맥스</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>황산겐타마이신(50mg/ml)</td><td>Omega Scientific</td><td>GT-50</td><td></td></tr><tr><td>Human AB serum, 남성 기증자</td><td>Omega Scientific</td><td>HS-30</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 IL-2</td><td>Peprotech</td><td>AF 200-02</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28</td><td>Life Technologies</td><td>11131D</td><td></td></tr><tr><td>매체</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>세포 분류 완충액</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>1 L</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>10 g</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0.5 M)</td><td>2 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>인간 T 세포 배양 배지</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iscove의 DMEM</td><td>351.6 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>열 비활성화 인간 AB 혈청</td><td>40ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>4 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>글루타맥스(100x)</td><td>4 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>겐타마이신(50 mg/ml)</td><td>0.4 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>b-메르캅토에탄올(14.3 M)</td><td>1.4 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 IL-2 (1 mg/ml)</td><td>1 ml</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

말초 혈액에서 인간 alloantigen 특정 t 세포의 생성

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

인간 T 림프구 생물학에 대한 연구는 종종 리간드 활성화에 대한 반응을 조사하는 것을 포함합니다. T 세포는 T 세포 수용체(TCR)를 통해 MHC(human ortholog HLA) 분자에 의해 제시된 처리된 펩타이드 항원을 매우 민감하고 특이적인 방식으로 인식하고 반응합니다. T 세포의 주요 기능은 자가 MHC에 의해 제시된 외부 항원에 대한 보호 면역 반응을 매개하는 것이지만, T 세포는 동종 조직의 항원 차이에 강력하게 반응합니다. 동종항원에 대한 T세포 반응은 직접적 또는 간접적인 동종반응으로 설명할 수 있습니다. 동종반응성(alloreactivity)에서, T 세포는 제시된 펩타이드와 MHC 분자 모두에 대한 매우 특이적인 인식을 통해 반응합니다. 동종 자극에 대한 T 세포의 강력한 올리고클론 반응은 동종 조직에 잠재적으로 자극적인 동종 항원이 많이 존재한다는 것을 반영합니다. 동종반응성 T세포 반응의 폭은 이식편 대 숙주 질환 및 동종이식 거부반응과 같은 생물학적으로 관련된 동종반응과 관련된 병리학을 시작하고 매개하는 데 중요한 요소이지만, 동종 리간드에 대한 T세포 반응 분석을 배제할 수 있습니다. 이를 위해 본 프로토콜은 알려진 펩타이드-MHC(pMHC) 동질항원에 반응하는 미성숙한 인간 말초 혈액 백혈구(PBL)로부터 동종성 T 세포를 생성하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 pMHC multimer 라벨링, 마그네틱 비드 농축 및 유세포 분석을 동종 항원 특이적 T 세포 클론 생성을 위한 단일 세포 in vitro 배양 방법에 적용합니다. 이를 통해 동종 자극에 반응하는 T 세포의 생화학 및 기능을 연구할 수 있습니다.

전략 정렬 계측법 자성 비드 농축 및 단일 셀을 통해 유동 특이성 alloantigen 정의와이 프로토콜은 클론 인간 T 세포 배양의 생성을 설명한다. (1)가 처리의 개요를 제공하는 도표. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52257/52257fig1highres.jpg" /> 그림 1 : 프로토콜 개요 프로토콜은 여기에 설명 된 말초 혈액에서 alloantigen 특정 인간 T 세포 클론의 생성을위한 신뢰할 수있는 방법을 제공합니다.. 하나의 T 세포의 분리 및 배양 세포를 셋업하는 과정은 약 4.5 시간이 걸릴 것으로 예상된다. T 세포 클론 확장 비특이적 T 세포 자극 배양 각 복용 14 일에 여러 라운드를 필요로한다. 클론 문화 이십팔일...

이 논문은 정의된 동종항원에 특이적으로 반응하는 인간 T 세포 클론의 생성 및 증식 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 다양한 펩타이드-MHC 리간드에 특이적인 인간 T 세포를 클로닝하는 데 적용할 수 있습니다.

말초 혈액에서 인간 Alloantigen 특정 T 세포의 생성

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

이 절차의 전반적인 목표는 정의된 allo antigen specificity를 가진 human T cell을 식별, 분리 및 복제하는 것입니다. 이는 먼저 밀도 구배 원심분리를 통해 전체 말초 혈액에서 T 림프구를 분리함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계에서는 allo antigen specific T cell을 Fluor four conjugated peptide, HLA, tetramers로 표지하고 자기 분리를 통해 농축합니다.다음으로, 표지된 T cell은 single cell flow cytometry cell sorting에 의해 분리됩니다. 마지막으로, 단세포 배양액은 anti CD 3 및 anti CD 25 항체로 자극됩니다. 궁극적으로 항원 특이적 T 세포의 allo 반응성은 유세포 분석을 통해 평가할 수 있습니다.벌크 림프구 자극 및 희석 제한과 같은 다른 기술에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 기술을 통해 잘 정의된 allo 항원에 대한 특정 반응성을 가진 T 세포 클론을 생성할 수 있다는 것입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 사용하는 개인은 T 세포 클론의 배양 및 확장에 어려움을 겪을 수 있습니다. 이를 위해서는 절차를 시작하기 전에 배양을 매일 주의 깊게 모니터링해야 합니다.4 밀리리터의 실온 밀도 구배를 2-4 개의 멸균 15 밀리리터 원뿔형 원심 분리 튜브로 나누고 70 % 에탄올을 사용하여 건강한 지원자의 혈액이 들어있는 1-2 개의 채워진 녹색 상단 혈액 수집 튜브의 외부를 닦은 다음 조심스럽게 상단을 제거하고 혈액을 멸균 50 밀리리터 원심 분리 튜브에 넣으십시오. 그런 다음 각 수집 튜브를 10ml의 PBS로 재조정합니다. 세척액을 디캔팅된 전혈과 함께 모으고 용액을 부드럽게 혼합한 다음 희석된 혈액의 총 부피 2ml당 25마이크로리터의 인간 T 세포 농축 칵테일로 세포를 배양합니다. 20분 후 10ml 피펫을 사용하여 밀도 구배 매체 위에 최대 10ml의 혈액을 부드럽게 층을 이루고 구배 표면을 방해하지 않도록 주의합니다.세포를 10분 동안 원심분리한 다음 5ml 피펫을 사용하여 밀도 구배와 희석된 혈장의 경계면에서 백혈구 층을 50ml 원추형 튜브의 멸균 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 수집된 말초 혈액 림프구의 부피를 PBS로 최대 50ml까지 가져오고 세포 현탁액을 부드럽게 혼합합니다. 그런 다음 세포를 계수하고 분석을 위해 1mL 부분 표본을 제거합니다.다음으로, 세포 resus를 스핀 다운 한 후, 펠릿을 1 밀리리터의 유세포 분석 버퍼에 현탁시키고 50 마이크로 리터의 희석 된 allo antigen 펩타이드 MHC tetramer를 세포 현탁액에 혼합합니다. 세포를 멸균된 5밀리리터 튜브로 옮기고 30분 후에 2밀리리터의 분류 완충액 용액으로 세포를 세척합니다. 100마이크로리터의 분류 완충액에 입천장을 현탁시킨 다음 10마이크로리터의 비오틴 선택 칵테일에 15분 동안 세포를 배양합니다.다음으로, 5마이크로리터의 자성 입자에 세포를 10분 동안 배양한 다음 세포 현탁액을 2.5ml의 분류 버퍼와 부드럽게 혼합합니다. preen 농축 세포 분석의 100마이크로리터 분취액을 제거한 다음 튜브를 세포 분리 자석에 넣습니다. 5분 후, 튜브와 자석을 함께 잡고 내용물을 새 5ml 튜브에 넣습니다.그런 다음 자석에서 튜브를 제거하고 2ml의 분류 버퍼로 세포를 세척하고, 펠릿을 냉간 분류 버퍼에 재현탁하고, 샘플 유형당 2ml의 냉간 분류 버퍼로 세포를 분취합니다. 샘플을 다시 회전시킨 후 펠릿을 25마이크로리터의 냉간 분류 버퍼에 다시 현탁시키고 20분 동안 얼음 위에서 5마이크로리터의 인간 FC 블록에 세포를 배양합니다. 다음으로, 튜브에 20마이크로리터의 적절한 항체 칵테일을 배양합니다.20분 후, 2ml의 냉선별 완충액으로 세포를 세척하고 펠릿을 밀리리터당 1-200만 개의 세포로 재현탁합니다. 더 많은 완충액에서 100 마이크로 리터의 인간 T 세포 배양 배지를 96 웰 둥근 바닥 세포 배양 플레이트의 각 웰에 분취하고 분류가 완료 될 때까지 플레이트를 얼음 위에 보관합니다. 분류 후 플레이트를 원심분리한 다음 셀을 섭씨 37도의 6%CO2 인큐베이터에 넣습니다.다음으로, 볼텍싱을 통해 적절한 부피의 활성제 비드를 혼합하고 적절한 부피의 비드를 멸균된 5밀리리터 튜브로 옮깁니다. 자석에서 비드를 세척한 후 세척 용액을 디캔팅하고 튜브에 마이크로비드 0.5마이크로리터당 배지인 100마이크로리터의 인간 T 세포 배양을 추가합니다. 그런 다음 100 마이크로 리터의 활성제 비드 현탁액을 96 웰 플레이트의 각 웰로 분취하고 세포를 인큐베이터로 되돌립니다.증식하는 세포의 작은 클러스터는 세포 분리 후 14일 후, 배양 5-7일 후에 현미경으로 관찰할 수 있습니다. 배양액 상단에서 100마이크로리터의 배지를 100마이크로리터의 신선한 인간 T 세포 배양액으로 조심스럽게 교체합니다. 중간 크기의 세포 클러스터는 섭식 후 2-3일 후에 현미경으로 볼 수 있어야 하며, 거시적으로 세포 펠릿은 배지 변화 후 14일 동안 볼 수 있어야 합니다.세포 분리 후 28일 후, 200마이크로리터 부피의 성장 양성 배양액 전체를 200마이크로리터의 인간 T 세포 배양 배지가 포함된 48웰 조직 배양 플레이트의 개별 웰로 옮깁니다. 그런 다음 100 마이크로 리터의 인간 T 세포 배양 배지에 12.5 마이크로 리터의 자극성 항 CD 3 개, 항 CD 28 마이크로 비드를 첨가하고 복원 3-5 일 후에 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣으십시오. 매체가 빨대가 노랗게 변하기 시작해야 합니다.이 시점에서 배양물을 24웰 조직 배양 플레이트의 개별 웰로 옮기고 각 배양에 500마이크로리터의 인간 T 세포 배지를 추가합니다. 마지막으로, 재조정 후 10-14일에 각 T 세포 배양액 200마이크로리터를 수집하여 펩타이드의 유세포 분석을 통해 동종 항원 특이성을 평가합니다. MHC 테트라머 결합: 동종 항원 특이 T 세포의 예상 수율은 기증자, 사용된 동종 항원 및 공여체 내 반응성 T 세포의 해당 빈도에 따라 달라집니다.예를 들어, 평균적인 건강한 헌혈자는 혈액 1밀리리터당 4, 500, 000에서 1,000만 개의 백혈구를 가지고 있으며, 그 중 약 20%는 T 림프구입니다. 이 점도표는 HLAD 4 음성 공여자의 T 세포와 특정 동종 항원의 결합을 측정한 결과를 보여줍니다. 예를 들어, 이 실험에서는 이 시작 세포 집단에서 2,000만 개의 백혈구에서 4개 중 1개의 빈도인 776개의 동종 항원 특이적 T 세포를 열거했습니다.88 개의 개별 temer 표지 T 세포를 분리 할 수 있었고 2 차례의 마이크로 비드 자극 및 배양 후 현미경 검사로 2 개의 성장 양성 배양을 확인하고 A 2 30 48 HLA DR의 결합을 검사하여 동종 항원 특이성을 평가했습니다. 4개의 사합체. 이 절차를 시도하는 동안 세포 사멸과 배양물의 과다 증식을 방지하기 위해 매일 세포 배양을 모니터링하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 T 세포 클론을 사용하여 동종 리간드 인식의 생화학을 조사하고 이것이 효과적인 면역 반응으로 어떻게 변환되는지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

본 논문은 인간의 말초 혈액 mononuclear 세포의 alloantigen 특정 anergy를 유도하는 간단한 기술을 설명합니다. 기술은 아닌 alloreactive 기증자의 세포를 생성하는 임상 적용할 수 있습니다. 이러한 세포의 주입은 면역 reconstitution를 개선하고 all​​ogeneic 조혈 줄기 세포 이식 후 독성을 줄일 수 있습니다.

공동 stimulatory 신호 봉쇄와 Alloantigen 자극에 의​​해 사람 말초혈 Mononuclear 세포 Alloantigen 특정 Anergy의 유도

우리는 한 인간의 혈액 기증자로부터 규제, 메모리 및 나이브 T 세포를 생성하는 방법을 설명합니다. 편광 Tregs 그때도 여기에 설명된 억제 분석을 포함한 유전자 균질성와 유전 및 기능 다양한 어플 리케이션의 다른 하위 집합을 비교할 수 있습니다.

기본 인적 나이브 및 메모리 T의 세포로부터 유도된 규제 T 세포의 생성

우리는 잠재적으로 이식 거부의 높은 위험없이 이식 후 면역 억제제의 철수를 결정하는 데 사용할 수있는 유용한 진단 분석을 설명합니다. 분석은 지연 형 과민 반응의 원리를 사용하여받는 사람이 탑재 된 두 기증자 특정 이펙터 및 규제 면역 반응의 정확한 평가를 제공합니다.

항원 특정 규제 트랜스 생체 지연 형 과민 분석

여기에서는 간단한 수동 단백질 침전 단계와 온라인 컬럼 추출을 사용하여 건조된 혈액 반점에서 면역억제제 타크로리무스를 정량화하기 위한 고성능 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법(HPLC-MS/MS) 분석에 대해 설명합니다.

LC-MS / MS를 사용하여 건조 혈액 명소에 면역 억제제 타 크롤리 무스의 정량화

여기서는 쥐 모델에서 자가면역 관절염의 면역 요법을 위해 유도 만능 줄기 세포(iPSC)에서 기능적 항원(Ag) 특이적 조절 T 세포(Tregs)를 개발하는 방법을 제시합니다.

자가 면역 대해 줄기 세포 유래의 항원 특이 적 조절 T 세포의 발달

이 논문 계측법 촬상 흐름을 사용하여 T 세포의 혼합 집단에서 alloreactivity를 측정하는 방법을 설명한다.

이미징 유동 세포 계측법을 사용하여 T 세포 Alloreactivity의 측정

여기, 선물이 프로토콜을 이식, 허용 오차를 유발 하 고 생체 외에서 그리고 vivo에서 평가 받는에서 고유한 셀 하위 집합의 진압 용량 및 기증자 또는 외 인 항 원 받는 사람의 면역 상태.

생체 외에서 그리고 Vivo에서 T, B 및 골수성 세포 진압 활동 및 이식 받는 체액 응답의 평가

이 문서에서는 OP9/DLL1 공동 배양 시스템을 사용하여 기능성 종양 항원 특이적 유도 만능 줄기 세포 유래 CD8αβ+ 단일 양성 T 세포를 생성하는 방법을 설명한다.

종양 항원 특이적 T 세포의 생성을 위한 인간 유도 만능 줄기 세포를 사용하여

이 프로토콜은 인간 키메라 항원 수용체 조절 T 세포(CAR Tregs)를 생성하고 테스트하기 위한 간소화된 워크플로우를 제공합니다.

인간 키메라 항원 수용체 조절 T 세포의 생성

in vitro 에서 naive monocyte 유래 수지상 세포에서 내성 수지상 세포를 생성하는 약리학적 제제의 능력을 평가하고 자가 조절 T 세포 생성을 통해 그 효능을 검증하는 절차를 설명합니다.

인간 CD14+ 단핵구에서 톨러겐 수지상 세포 생성을 위한 면역조절제를 테스트하는 간단하고 효율적인 방법

배우세요 말초 혈액에서 인간 Alloantigen 특정 T 세포를 분리하고 복제하는 방법을. 밀도 구배 원심분리, 자기 분리, 유세포 분류술을 활용하여 면역학 및 이식 생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

말초 혈액에서 인간 Alloantigen 특정 T 세포의 생성

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