다중 및 단일 세포 기반 분야 분석 실험을 사용하여 인간의 난소 암 세포의 줄기 세포 특성의 평가

이 절차의 전반적인 목표는 다중 및 단일 세포 기반 구체 분석을 사용하여 인간 난소 암종 세포의 줄기 세포 특성을 평가하는 것입니다. 이는 먼저 두 번째 단계에서 Pur Mycin 처리에 의해 SOX 2 리포터 RFP 렌티바이러스 형질전환 세포를 선택함으로써 달성되며, RFP 양성 및 RFP 음성 세포는 웰당 단일 또는 다중 세포 콜로니로 사실에 의해 분리 및 도금됩니다. 다음으로, 1차 구 형성을 현미경으로 분석한 다음 1차 구 배양을 해리하고 2차 구 형성 분석을 위해 재도금합니다.

궁극적으로 이러한 구체 분석은 구 형성 능력을 나타내는 추정 난소암 줄기세포의 비율을 계산하는 데 사용됩니다. 이 방법은 잠재적인 암 줄기세포 집단이 무엇인지, 전체 종양 주머니에서 빈도가 얼마인지와 같은 암 줄기세포 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 난소암 줄기세포 식별에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 유방암과 같은 다른 고형 종양 개체에서 암 줄기세포를 분리하는 데에도 적용될 수 있습니다.

인간 난소암 세포에 렌티바이러스 입자를 형질주입한 후 24시간 후, 바이러스 상층액을 제거하고 PBS 배양액에서 세포를 세척합니다. 세포를 48시간 동안 완전한 배지에 넣습니다. 그런 다음 배지를 변경하고 5일 후에 piro mycin 밀리리터당 10마이크로그램을 추가합니다.

다음날 1에서 1000 희석에 방패 1을 가진 배양물을 대우하십시오. PBS에서 세포를 세척한 다음 0.05% tripsin EDTA로 분리합니다. 3분 후 완전한 매체로 반응을 중지합니다.

세포를 세고 300배 G 및 실온에서 5분 동안 원심분리합니다. 0.5 - 1ml의 멸균 PBS에 세포를 조심스럽게 재현탁시킨 다음 생성된 세포 현탁액을 40마이크로미터 필터를 통해 변형시킵니다. 세포를 밀리리터 희석당 6개의 세포에 5 곱하기 10으로 조정한 다음 단일 세포 기반 구 분석을 위해 다음으로 초저 부착 96웰 플레이트의 각 웰에 100마이크로리터의 구체 매체를 추가합니다.

단일 셀 모드를 사용하여 하나의 셀을 플레이트의 각 웰로 정렬합니다. 그런 다음 세포를 현미경으로 채점하여 도금 효율을 평가합니다. 섭씨 37도의 배지와 5%CO2의 신선한 구체에서 매일 기본 섬유아세포 성장 인자와 표피 성장 인자 보충제를 사용하여 세포를 배양합니다.

일주일 후, 광학 현미경으로 떠오르는 종양 구체의 수와 형광 현미경으로 통합 리포터 시스템의 형광 신호의 존재를 확인합니다. 지름이 100마이크로미터를 초과하는 구는 큰 구로, 지름이 50-100마이크로미터인 구는 작은 구로 계산합니다. 세포 클러스터가 아닌 실제 구를 세는 데 주의하십시오.

그런 다음 통과 공식에 따라 RFP 양극 또는 RFP 음수 셀을 형성하는 구의 비율을 계산합니다. 구체는 각 웰의 내용물을 개별 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기는 것으로 시작합니다. 그런 다음 PBS로 각 웰을 3-5회 헹구어 모든 구체를 모으고 300배 G 및 실온에서 10분 동안 셀을 스핀다운합니다.

원심 분리 후, snat을 제거하고 부드러운 셰이커에서 섭씨 37도에서 0.05 % tripsin EDTA의 200 마이크로 리터에 펠릿을 5 분 동안 현탁시킵니다. 5분 후에도 큰 구체가 보이지 않으면 100마이크로리터 피펫 팁으로 세포 용액을 부드럽게 삼중화하고 500마이크로리터의 완전한 배지를 추가하여 트립신을 비활성화합니다. 스핀 다운 셀, 펠릿을 구체 배지에 조심스럽게 재현탁하고 방금 평가한 대로 40마이크로미터 필터를 통해 생성된 셀 현탁액을 배출합니다.

마지막으로, 단일 세포의 연속 재도금을 위해 100마이크로리터의 구체에 있는 하나의 기본 구에서 단일 세포를 시딩하고, 새로운 초저 부착 96웰 플레이트에서 웰당 배지를 시딩합니다. 그런 다음 1차 구체 분석과 동일한 공식을 사용하여 2차 구체에서 구를 형성하는 세포의 비율을 평가합니다. 다세포 기반 구체에서의 분석: RFP 양성 인간 난소 암 세포의 거의 40%가 RFP 음성 세포의 20%만이 1차 구체 분석에서 개별 종양 구체를 생성했습니다.

놀랍게도, MGEM 및 D-M-E-M-F 12 기반 매체 모두에서 더 적은 수의 도금된 세포에서 더 많은 수의 구체가 계산되며, 이는 도금 방식이 이 분석의 결과를 크게 편향시켰음을 보여줍니다. 대조적으로, 1%의 메틸셀룰로오스를 첨가하여 세포를 고정시킬 때 구 형성의 효율성은 대부분 다중 세포 기반 구체 배양에서 세포 밀도와 무관합니다. RFP 양성 구체의 세포 중 약 35%는 배양 7일 후에 적색 형광 신호를 잃는데, 이는 이러한 세포가 분화를 거쳤음을 시사하는 반면 65% 이상의 세포는 자가 재생 능력을 시사하는 RFP 신호를 보유하고 있음을 시사합니다.

대조적으로, 초기에 RFP 음성 세포에서 생성된 구체의 세포는 RFP 음성을 유지하며, 이는 이러한 조건에서 줄기세포 전위를 재확립할 수 없음을 나타냅니다. 단일 세포에서 생성된 구체에 대해 수행된 형광 현미경 검사는 RFP 양성 세포에서 파생된 단일 구체에 RFP 양성 세포와 RFP 음성 세포가 모두 포함되어 있음을 보여주는 이러한 데이터를 확인합니다. RFP 음성 세포에서 파생된 구체는 이 절차를 따라 빨간색 신호가 없는 상태를 유지합니다.

quantit PCR을 통한 항체, 염색 또는 유전자 발현 분석과 같은 다른 meer를 수행하여 심각한 형성 능력을 가진 세포를 추가로 특성화할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안, 면역 억제 마우스에서 생체 내 이식 분석을 수행하여 구체 시작 세포의 종양 줄기 세포 특성을 검증해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.