Name: 삽관 매개 기관 내 (IMIT) 떨어 뜨림 : 비 침습적, 폐 별 전달 시스템 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: 배우세요 생쥐 폐에 비침습적으로 박테리아를 전달하는 삽관 매개 기관 내(IMIT) 기관 내 투여법. 이 방법은 호흡기 질환 연구와 치료제 전달에 정확하고 재현 가능한 결과를 제공합니다.

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저자는 Center for Predicative Medicine Animal Models (Carol Vanover, Ashley Biller 및 Jennifer Kraenzle) 및 Microbiology (Daniel Cramer 및 Julie Sotsky) 핵심 시설의 지원에 감사드립니다. 이 작업은 NIH(HHSN272201000033I에서 M.B.L 및 J.M.W.까지)의 자금 지원으로 지원되었습니다.

참고 : 여기에 설명 된 모든 절차를 검토하고 루이빌 기관 바이오 안전성위원회 (프로토콜 # 13-056)과 기관 동물 관리 및 사용위원회 (프로토콜 # 13-064)의 대학에 의해 승인되었습니다. 염료 1. 준비 <ol><li> 0.1 % 희석 (/ w를 v)를 PBS에 쿠마시 브릴리언트 블루 및 0.45 μM 주사기 필터를 이용하여 필터 소독. </li></ol> 녹농균 문화 2. 준비 <ol><li> 점안 전에 15 시간은, 하나의 세균 식민지와 국물 문화의 3 ㎖를 접종. </li><li> 셰이커 (200 RPM)에 37 ° C에서 배양 15 시간 성장. </li><li> 원심 분리기 30 초 동안 1.5 ml의 미세 원심 분리 튜브 12,000 XG에 문화 1 ㎖. </li><li> 배지를 제거하고 PBS 1ml의에서 펠렛을 재현 탁. </li><li> PBS의 세균 재고 서스펜션 1:10 나누어지는을 희석을 결정하기 위해 희석 세균 현탁액의 OD 600을 측정세균 농도. </li><li> IMIT 접종 50 μL의 전달 부피를 사용하여, 박테리아 접종원의 원하는 농도로 PBS에 세균 스톡 현탁액을 희석. </li></ol> 3. IMIT 떨어 뜨림 <ol><li> 이소 플루 란 마취 유도 챔버에 마우스의 군을 배치하고 2하여 마취 - 3 % 이소 플루 란 / 산소 혼합물. </li><li> 진정 작용의 초기 개시에서, 직립 마우스를 잡고, 마우스 목덜미 및 목의 뒤쪽 위관 니들에 의해 2 % 리도카인 용액 10 μl를 관리하고 용액 다운 후두개로 배출되도록. 마취 챔버에 마우스를 돌려줍니다. <ol><li> 국소 마취로 전체 적용하기 위해 리도카인을 허용하기 위해 최소 5 분을 허용합니다. </li></ol></li><li> 마우스가 진정의 원하는 수준을 달성 한 경우 (60 BPM ~의 속도를 호흡), 진정 작용을 유지하기 위해 2 % 이소 플루 란을 줄일 수 있습니다. </li><li> 250 μL의 기밀에 미리로드 염료 또는 세균 접종22 G 긴 무딘 바늘 정밀 주사기 맞습니다. <ol><li> 먼저 주사기의 테프론 플런저에 의해 측정 된 공기의 150 μL를 작성한다. 다음, 주사기 본체에 200 μL 마크에 150 μL 마크에서 테프론 플런저를 전진하여 접종 50 μL를 그립니다. NOTE : 시료 삽관 마우스로 토출 될 때, 50 μl의 현탁액은 폐 걸쳐 균액을 분배하는 150 ㎕의 공기 쿠션에 의해, 제 뒤에 전달 될 것이다. </li></ol></li><li> 유도 챔버에서 하나의 마우스를 제거하고 삽관 플랫폼에서 부정사 누워. 벨크로 스트립에 부착 된 O 링과의 앞니를 후킹하고, 플랫폼에 벨크로를 확보하여 플랫폼에 마우스를 고정합니다. 45 ° 경사에 마우스를 올립니다. </li><li> 마이크로 솜 어플리케이터를 사용하여, 지배적 인 손을 사용하여, 회전 운동과 혀를 후퇴. </li><li> 비 우세 손으로, 모두 엄마에 삽관 specula와 함께 운영 검 이경 맞는 사용혀 후퇴를 intain과 성문을 시각화. </li><li> 지배적 인 손으로, (카테터 노출 카테터의 10mm와 실리콘 슬리브 적합) 마우스 기관에 10mm 깊이에 카테터를 좌석, 마우스를 삽관에 20 G 카테터를 통해 스레드 가이드 와이어를 사용합니다. 검 이경 / specula를 제거합니다. </li><li> 마우스가 제대로 간단히 색깔의 염료를 포함 1/16 &quot;투명 튜브의 루어 연결된 길이를 부착하는 동안 비 우세 손으로 카테터를 확보하여 관을 삽입되었는지 확인합니다. 참고 : 염료 빠르게 호흡에 대한 응답으로 앞뒤로 이동한다. </li><li> 삽관의 확인이이 시점에서 설정되어 있지 않은 경우 다음 단계로 진행하지 마십시오. 삽관이 실패한 시도 된 경우, 삽관에 하나의 추가 시도가 카테터와 가이드 와이어를 다시 설정합니다. 참고 : 마우스에 외상을 유발하지 않고 하나의 세션에서 마우스 두 개 이상의 intubations을 시도하는 바람직하지 않다입니다. </li><li> 계속액체 서스펜션 / 에어 쿠션을 포함하는 정밀 주사기 / 무딘 바늘을 삽입하는 동안 비 우세 손으로 카테터를 고정합니다. </li><li> 직접 하나의 유체 운동의 폐에 액체 / 공기를 분배하고 즉시 마우스에서 바늘 / 카테터를 제거합니다. </li><li> 케이지에 마우스를 반환하고 마취에서 회복 할 수 있습니다. </li></ol> IMT 납품 4. 특성 <ol><li> IMIT의 점안 한 후, 적절한 시간 후 접종에서 CO 2 질식하여 마우스를 안락사. </li><li> 해부 보드의 안락사 마우스를 안전하고 70 % EtOH로는 물총 병을 사용하여 가슴과 복부를 흡수. </li><li> 폐 걸쳐 조영제의 분포를 평가하는 경우, 무균 기술을 사용하여 동물로부터 폐를 제거하고 영상에 적절한 폐 표시. 참고 :. 폐는 적절한 고정 또는 냉동 보관을 통해 추가 조직 학적 염색 기술에 대한 제조 할 수있다 &lt;/ 리&gt; <li> 감염된 폐 조직의 세균 부담을 평가하는 경우, 무균 기술을 사용하여 동물로부터 폐를 제거. 장소 폐는 멸균에, 1 온스 샘플 가방을 preweighed. 달아 샘플 백 + 폐의 중량을 기록한다. <ol><li> 각각의 샘플 가방 + 조직으로 멸균 1X PBS 1 ML을 추가합니다. 샘플 가방을 봉인. </li><li> 샘플 가방 + 조직을 통해 25 ml의 혈청 학적 피펫을 롤링하여 부드러운 조직을 균질화. </li><li> (연구되고 LB, 또는 세균 종에 적절한) 한천 접시에 폐 멸균 PBS에서 균질 및 판의 연속 희석을 생성합니다 : <ol><li> 다음 한천 접시에 멀티 채널로 세중의 샘플을 판 멀티 채널 피펫으로 U-바닥 96 웰 플레이트에서 여섯 배 용액을 희석을 실시한다. </li></ol></li><li> 하룻밤 37 ℃에서 한천 플레이트를 품어 다음날 콜로니 형성 단위를 열거합니다. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Reznik, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+anatomy%2C+physiology%2C+and+function+of+the+upper+respiratory+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Comparative anatomy, physiology, and function of the upper respiratory tract.</a> Environ Health Perspect. 85, 171-176 (1990).</li>
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</ol>

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IMIT의 점안 재현성 폐에 직접 시약을 주입 할 수있는 능력에서 기존의 호흡기 질환 모델의 핵심 개선 사항을 제공합니다. 그것은 IMIT 기술을 수행 이상적으로 마취 caging의 물류를 관리하는 하나의 두 연구자의 팀에 위치해 빠른 접근, 다른입니다. 마우스 당 3 분 - 대형 연구 (2)의 평균 시간 헌신 IMIT를 사용하여 수행 될 수있다. 접근법은 이소 플루 란 마취제로서 사용하게되므로, 마우스는 복구를 통해 동물을 모니터링의 축산 시간을 줄이고, 마취로부터 신속히 회복. IMIT 방법의 가장 기술적 도전 양상은 마우스 삽관의 초기 단계이다. IMIT을 수행하기 위해 학습 개인은이 첫 번째 카테터 배치 단계 및 그 삽관을 보장하는 것은 염료 운동의 시각적 확인을 통해 달성되었습니다에 초점을 맞출 수 있습니다. 접근법의 이점은 폐 - 스펙 인IFIC의 점안은 새로운 연구원 모두의 신뢰뿐만 아니라 어려운 동물을 삽관을 시도하는 전문가를 증가 삽관의 확인,의 사용을 통해 보장된다. 성공적인 삽관의 가능성을 최적화의 핵심 요소는 다음과 같습니다 깊은 진정을 달성 ⅰ), ⅱ) 입에 specula의 정확한 위치가의 III) 좋은 깊이 배치, 후두개의 좋은 시각화 할 수 있도록 충분한 작업 시간을 허용하도록 specula 혀 절차 내내 후퇴 남아 있고, 절차가 편안하고 안정된 방식으로 수행되도록 틸팅 플랫폼 ⅳ) 사용이 연구자의 손을 지원되도록. IMIT 절차의 한계 중 하나는 IMIT의 점안 이벤트 빈도에 관련된다. 놓친 삽관과 관련된 잠재적 인 외상으로 인해, 그것은 두 개 이상의 삽관 시도 (최대 2 미스에) 하나의 세션에서 실시하지 않는 것이 좋습니다. IMIT그 능력이 우수한 전위 뮤린 폐에 치료제를 전달하기 위해 사용될 수 있으며, 폐 내로 시약 매우 빈번한 전달을 활용하지만 치료법은 IMIT 적합하지 않을 수도있다. 그것은 IMIT 상당한 외상을 일으키지 않고 뮤린 폐에 시약을 제공하기 위해 매일 사용될 수 있음 수도 있지만 삽관과 관련된 외상의 대부분으로, 고도로 숙련 된 연구자가 실시한 경우에만 놓친 삽관 이벤트와 관련이있는 것으로 생각된다 . 이러한 고주파 IMIT 지역 수의사와 IACUC와 논의해야합니다. IMIT의 추가적인 전위 제한 삽관되는 마우스의 크기이다. 20 G 카테터이 크기 범위의 생쥐의 기관에 적합한 크기였다 22 g을, - 상기 IMIT 절차는 약 17의 생쥐를 사용하여 개발되었다. 큰 카테터 성공적 이전 마우스에서 사용되었다; IMIT의 m의 초기 개발&gt; 20g이다 BALB / c 마우스에 18 G 카테터의 에이드 사용. 대체 카테터 크기는 사용되는 경우 중요한, 무딘 바늘은 카테터의 루멘에 맞게 단지 카테터 팁 넘어서 1mm 연장 길이로 손질되어있는 공급한다. 17g보다 작은 마우스 삽관이 가능할 수도 있지만, 필요한 전문성 때문에 바람직하지 않고, 작은 카테터 상술 된 것보다 specula의 사용을 요구한다. 우리는 P. 이외에 여러 가지 호흡기 병원체의 전달을 위해 IMIT를 사용했다 B. 포함 녹농균, pseudomallei 9, 폐렴 간균 (10). IMIT 모델은 B의 우리의 연구에 중요한 발전을했다 pseudomallei 호흡기 질환은 비강 내 접종이 오히려 인간의 질병 (9)에서 관찰 된 전신 질환 엔드 포인트에 비해 쥐의 초기, URT 관련 사망률의 원인 발견 한. B. pseudomallei는 1 단계 SELEC입니다바이오 디펜스에 미치는 영향의 t 에이전트, 및, 호흡기 질환 모델은 에어로졸에 노출 개발되고있다으로하는 모델 무기화 병원균에 대한 항목의 잠재적 인 바이오 디펜스 관련 경로. 현재 에어로졸 모델은 URT와 LRT 모두의 감염 발생하기 때문에, 같은 잠재적 인 초기 사망률 표현형은 우리가 B의 비강 모델 확인했다 pseudomallei 호흡기 질환은 에어로졸 모델에 적용 할 수있다. IMIT 모델의 미래 적응은 마우스 만 폐에 대상 에어로졸 전달을 위해 삽관하는 삽관 매개 에어로졸 전달 (이마 드)이 될 수 있습니다. 기계 환기는 에어로졸, 액체 기반보다는 병원균 도전을 제공하도록 구성 될 수있는 이소 플루 란 마취를 유지하기 위해 현재 사용할 수 있습니다. IMIT는 폐에 박테리아의 전달을 최적화하는 방식으로 초기 개발뿐만 아니라, 마우스 폐에 다른 시약의 전달을위한 애플리케이션을 보유 하였다. DIS로위의 험담을 늘어 놓았다, 낮은 효율 마우스 결과에 화합물의 비강 전달, 폐의 표적 장기에 시약의 높은 변수 전달. 우리가 IMIT가&gt; 98 %의 전달 효과와 multilobar 배포 접근 다른 폐 배달를 대체 할 수있는 뛰어난 성능을 제공하는 증명 반면 쥐의 폐에 양전자 방출 단층 촬영 (PET) 영상 시약의 비강 배달, 40 %의 전달 효율 (11)을 얻었다. 폐에 표적 전달에 이러한 개선은 폐 질환의 치료를위한 치료 적 전달의 재현성을 증가시킬 가능성을 갖는다. I) 환경 폐 자극의 영향, II) 폐암 표현형 연구, III) 폐 특정 siRNA를 노크 다운 : IMIT 유사 연구에 혜택을 제공 할 수 있습니다.

마우스는 호흡기 질환의 무수히 포함하는 수많은 인간의 질병 증상을 모델링하는데 사용되어왔다. 대리 질병 모델들은 전형적으로 중요한 생리적 또는 두 개의 호스트 모델에서 면역 차이로 모델링 된 질병의 모든 측면 요점을 되풀이 할 수 없다. 따라서, 모델 시스템을 개선 목표 대용 더 자세히 질병 과정을 미러링 또는 원래 호스트 시스템에서 관찰되는 바와 같이 반응을 호스팅 할 수있는 방법을 개발하는 것이다. 그들이 공기를 격려하는 메커니즘에 쥐와 인간 사이에 몇 가지 중요한 생리 학적 차이가 있습니다. URT와 LRT 사이의 크기에서 상당한 비율 적 차이는 이러한 차이에 포함되어 있습니다. 이것은 생쥐&gt; 100 전체 폐 용량 1,2- 대해 정규화 인간 URT 표면적 상대적 접어 가지고있는 것으로 추정되었다. 따라서, 마우스의 비강 비갑개는 breathi의 훨씬 더 큰 레이트를 촉진하기 위해 영감 공기의보다 광범위한 필터링을 허용비강 감염 질병의 진행에 중요한 역할을하는 경우에는 NG, 폐렴의 연구에 중요한 영향을 미칠 수있다. 여러 다른 접근법은 인간과 같은 호흡기 질환을 연구하기 위해 쥐의 폐에 박테리아를 주입하기 위해 사용되어왔다. 이러한 방식의 가장 일반적인 액체 현탁액 마우스 중 하나 또는 모두 콧 구멍에인가되는 비내 접종이다. 비교적 단순한 반면, 이러한 비내 접종 3-5 통해 LRT로 점안의 효율에 영향을 미칠 수있는 사용 마취 점적 양과 유형으로주의. 즉, 밀러 등. 이하 50 μL가 LRT (6)에 박테리아의 점안을 초래하지 않은 볼륨에서 Francisella의 tularensis의 비강 내 점적 주입을 보여 주었다. 마취 주사 케타민 / 자일 라진 (xylazine)에 반대 흡입 이소 플루 란을 사용하는 경우 그들은 더 나은 LRT의 점안을 관찰했다. 그러나, 우리의 experienc에페스트 균의 비강 내 접종와 E는 이소 플루 란 (MBL, 게시되지 않은 데이터)에 비해 더 일관성 접종 케타민 / 자일 라진 (xylazine)을 사용하여 달성 할 수있는 것을 나타냅니다. 이러한 차이는 사용 병원균 또는 실험실 절차에 변화에 있지만, 중요한 것은이 기술의 잠재적 인 변동성을 강조 기인 할 수있다. 또한, 초기 박테리아 접종원 비교적 낮은 비율이 폐에 도달 한 것을 비강 점적 쇼 직후 수확 폐 박테리아의 수많은 것이 제안 (Y. 페스티의 경우는 10 %만이 점안 칠 후 1 시간을 회수 하였다) URT 유지 (또는 위장관으로 섭취) 할 수있다. 유기체는 인간의 질병과 일치하는 방식으로 뮤린 비강 식민지화 수 있는지 특정 질병 모델에서 URT 점막에 세균이 상당한 침착 질환 진행에 대한 우리의 이해를 혼란시킬 수있다. 예를 들어, 생체 내에서 사용하기 &lt;/ EM&gt;는 이미징, 그것은 비강 점적 방법 (8)에 의해 전달되는 경우에 인간 URT 정착하지 부르크 홀데 pseudomallei는, 뮤린 비강 압도적 기회 감염을 일으키는 것으로 관찰되었다. 쥐의 폐에 세균을 주액하는 다른 방법은 또한 감염성 질환 연구에 이용되어왔다. transoral [소화 기관 및 LRT] 그러나, 비강 내 점적 주입에 비해이 방법은 여러 사이트 (예를 들어, 에어로졸 [URT와 LRT]에 감염 개시의 가능성을 제거하지 않고 더 전문 기술 및 / 또는 고가의 장비를 필요로하는 경향이 수술 기관 내 [LRT 및 혈류]). 감염의 보조 사이트와 연관​​ 될 수있는 잠재적 인 합병증을 감안할 때, 우리는 URT를 무시하고 직접 마취 된 쥐의 폐에 병원체를 전달하는 기관 내 접근 방식을 개발하기 위해 노력뿐만 아니라, 실수로 inoculat 제한혈류 또는 GI 관에 이온을. 이를 위해, 삽관 매개 기관 내 (IMIT) 점안 전에 점안을 통해 카테터의 위치를​​ 확인하기 위해 중간 단계를 포함하여 접종의 LRT의 점안을 보장하는 비수술 적 절차로 개발되었다. 시각적으로 폐에 걸쳐 접종의 광범위한 분포를 보여, 및 P.에이 방법은 염료 점안을 사용하여 설명 녹농균의 점안은 폐에이 방법의 매우 효과적인 전달 (&gt; 접종의 98 %)을 설명합니다. 중요한 것은 원래 세균 전달을 위해 개발하면서, IMIT도위한 효과적인 도구 제공 다른 호흡기 질환 모델, ⅱ) 폐 특정 치료 전달 연구를위한 다양한 분자 ⅰ) 점안, 그리고 ⅲ) 염기성 폐 기능 시험은, 타겟을 포함 폐에 siRNA를 전달.

<table><tbody><tr><td>설치류, 틸팅 작업대</td><td>Hallowell EMC</td><td>000A3467</td><td>BSC</td></tr><tr><td>작동 이경 헤드</td><td>Welch Allyn</td><td>21700</td><td></td></tr><tr><td>검이경 3.5 V Li 배터리</td><td>Welch Allyn</td><td>71900</td><td></td></tr><tr><td>마우스 삽관 스페큘라 짧은, 오토클레이브 가능</td><td>Hallowell EMC</td><td>200A3589S</td><td></td></tr><tr><td>앞니 루프</td><td>Hallowell EMC</td><td>210A3490A</td><td></td></tr><tr><td>면 세밀한 팁 적용기</td><td>Puritan</td><td>871-PC DBL&nbsp;</td><td>혀 후퇴에 사용</td></tr><tr><td>I.V. 카테터, 20 G</td><td>Exel Int</td><td>26741</td><td>옵션: 카테터 표면이 10mm로 노출된 실리콘 슬리브 가스</td></tr><tr><td>밀폐 주사기, 250 ul</td><td>Hamilton</td><td>81120</td> IMIT Blunt Needle에 <td>의한 액체 접종물 전달에 사용</td></tr><tr><td>, 22 G</td><td>Hamilton</td><td>91022</td><td>20 G 카테터에서 1mm 돌출 길이로 트리밍</td></tr><tr><td>가이드 와이어(광섬유 와이어, 0.5mm)</td><td>TheFiberOpticStore.com</td><td>FOF .50</td><td>6" 길이로 자르기: 삽관</td></tr><tr><td>투베르큘린 주사기, 1 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>309659</td><td>가이드 와이어로 광섬유 와이어로 조립</td></tr><tr><td>브릴리언트 블루 R (쿠마시)</td><td>시그마</td><td>B0149</td><td></td></tr><tr><td>타이곤 튜빙, 1/16"</td><td>세인트 고뱅</td><td>ALC00002&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>남성 Luer 1/16" 미늘</td><td>Cole Parmer</td><td>45503-22</td><td></td></tr><tr><td>여성 Luer 1/16" 미늘</td><td>Cole Parmer</td><td>45500-00</td><td></td></tr><tr><td>리도카인, USP</td><td>Spectrum</td><td>LI102</td><td>pH 리도카인 2%(w/v) pH7.0</td></tr><tr><td>샘플 백, 1oz</td><td>Whirl-Pak</td><td>B01067</td><td></td></tr><tr><td>U-bottom 96 웰 플레이트, 멸균</td><td>Greiner</td><td>650161</td><td></td></tr></tbody></table>

삽관 매개 기관 내 (imit) 떨어 뜨림 : 비 침습적, 폐 별 전달 시스템

Intubation-mediated Intratracheal (IMIT) Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

호흡기 질환 연구는 통상적 대리 시스템 같은 뮤린 모델의 사용을 포함한다. 그러나, 특히 자신의 상부 호흡기 (URT)의 쥐와 인간의 호흡 시스템 사이의 중요한 생리 학적 차이가있다. 잠재적으로 이러한 질병을 연구하기 위해 마우스 모델의 유용성을 제한 비내 점적 기법을 사용할 때 일부 모델에서, 뮤린 비강에서 이러한 차이는 하부 호흡기 (LRT)에서의 질환 진행과 표현에 상당한 영향을 미칠 수있다. 이러한 이유로, 그것은 URT의 개입없는 LRT 질환을 연구하기 위해, 마우스 폐로 직접 박테리아를 주입하는 기술을 개발하는 것이 유리하다. 우리는이 폐 특정 배달 기술 삽관 매개 기관 내 (IMIT) 점안로 명명했다. 이러한 기술은 비 침습적 침습적 traditi 중에 발생할 수있는 혈류 내로 점적에 대한 가능성을 최소화도 그러 외과 기관 내 감염 방법, 및 불가피한 소화관 전달의 가능성을 제한한다. IMIT 생쥐 먼저 폐 내로 박테리아의 직접 전달을 중재하는 카테터에 무딘 바늘의 삽입으로, 기관에 올바른 카테터 배치를 보장하기 위해 중간 단계로, 삽관 하였다되는 두 단계 프로세스이다. 이 방법은 폐 걸쳐 시약의 우수한 분배와 폐로 전달&gt; 98 %의 효능을 용이하게한다. 따라서 IMIT 인간 호흡기 질환을 연구하는 대리로 쥐를 사용하는 능력 향상에 직접적으로 LRT 폐 질환 및 치료 전달을 연구하는 새로운 접근법을 나타낸다. 또한, 본 전달 시스템의 정확도 및 재현성이 또한 우수 실험실 실무 표준 (GLPS) 의무뿐만 아니라 폐에 고효율 전송을 필요 시약의 다양한 전달한다.

IMIT 방법을 통해 얻은 물질의 분포를 시각화하기 위해, 0.1 % 쿠마시 브릴리언트 블루 염료의 50 μL은 마취 된 쥐의 폐에 주입되었다. 마우스가 바로 안락사 된 폐 멸균 부검에 의해 제거되었다. 염료는 폐의 모든 엽 (叶)에 전달 된 것을 1은 그림. IMIT 방법을 통해 폐로 전달 박테리아의 양, 쥐의 세 개의 그룹 (N = 3) P. 세 가지 농도로 주입 하였다 결정하려면 녹농균 (1.21 × 10 (8), 1.21x10 7, 1.21 × 10 6 콜로니 형성 단위 [CFU] 50 μL 당). 즉시 IMIT의 점안 한 후, 마우스는 폐를 제거, 안락사, 세균 숫자는 접종 (그림 2)에 열거하고 비교 하였다. 주입의 접종 배달은 폐에서 발견 접종의&gt; 98 %로,이 방법을 통해 매우 효율적이다동물. 또한, IMIT 점적 주입에 관계없이 접종 (= 0.9951 R 2)의 농도 재현성이었다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52261/52261fig1highres.jpg" /> 그림 1 : IMIT의 점안이 폐에 걸쳐 접종을 배포 모든 로브 배포 0.1 % 코마시 브릴리언트 블루 쇼 파란색 염료의 50 μL로 주입 쥐에서 폐.. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52261/52261fig2highres.jpg" /> 그림 2 :. 폐 마우스에 세균 IMIT의 점안은 P.에 주입했다 녹농균 및 폐 내로 주입 균수가 (10 CFU 로그 - 회수) 추정 균액 비교 하였다 (10 CFU 로그 - 전달). 각각의 서클은 개별적 마우스 (의 CFU / 폐 n = 각 3를 나타내고세균 투여).

시약의 기관 내 삽관 매개 (IMIT) 점안 호흡기 질환뿐만 아니라 폐에 직접 치료 시약을 주액하는 방법을 연구 우수한, 비 침습적 방법이다. 이 임상 시험에 적합한 신속하고 재현성이 높은 방법이다.

삽관 매개 기관 내 (IMIT) 떨어 뜨림 : 비 침습적, 폐 별 전달 시스템

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences ...

이 절차의 전반적인 목표는 박테리아를 비침습적으로 쥐의 폐로 직접 전달하는 것입니다. 이것은 먼저 150마이크로리터의 에어 쿠션을 가스 밀폐 주사기에 적재한 다음 준비된 박테리아 현탁액 50마이크로리터를 적재하여 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 마취된 마우스에 가이드 와이어를 사용하여 20게이지 카테터를 삽관하여 배치를 돕습니다.그런 다음 간단한 유량계를 사용하여 삽관의 성공을 확인한 후 박테리아 접종물을 22게이지 길이의 뭉툭한 바늘로 카테터를 통해 폐로 직접 전달합니다. 궁극적으로, 기관내 삽관 매개 또는 접종 생략은 생쥐의 하기도 질환을 연구하는 데 사용할 수 있으며, 상부 호흡기의 동시 침범을 피할 수 있습니다. 비강 내 접종 방법에 비해 모방의 주요 장점은 이 기술을 통해 접종물을 폐에 직접 정확하고 재현 가능하게 전달할 수 있다는 것입니다.IIT는 비수술적 기법이기 때문에 외과적 기관내 시술과 관련된 합병증의 가능성도 줄여줍니다. 이 방법은 발병 기전을 연구하기 위해 박테리아를 폐로 전달하는 신뢰할 수 있는 메커니즘을 제공할 수 있지만, IMA는 폐 손상을 연구하기 위한 환경 화합물, 치료를 위한 치료제의 표적 전달, 이미징 프로브 또는 기본 폐 생물학을 연구하기 위한 SRNA의 전달과 같은 다른 시약의 전달에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 동물의 신중한 위치와 가이드와이어 삽입을 위한 자동 내시경이 필요하기 때문에 삽관 단계에서 어려움을 겪을 것입니다.이 방법의 시각적 시연은 가이드와이어를 기관에 처음 배치하는 것이 새로운 연구자에게 개념적으로 설명하기 어렵기 때문에 도움이 됩니다.설치 15시간 전에 단일 박테리아 콜로니로 3ml의 육수 배양을 접종하고 섭씨 37도에서 배양하고 200RPM에서 셰이커를 배양합니다. 15시간 후, 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 1ml의 세포를 넣고 1ml의 PBS에 입천장을 다시 매달아 놓습니다.다음으로, OD 600에서 박테리아 스톡 현탁액의 1-10 희석을 측정하여 박테리아 농도를 측정합니다. 그런 다음 PBS의 박테리아 세포를 접종물 50마이크로리터당 원하는 박테리아 농도로 희석합니다. IIT 설치의 경우, 간침 마우스로 가볍게 마취된 마우스에 2% 리도카인 용액을 투여하여 마우스에 IIT를 준비합니다.리도카인이 효과를 발휘하는 동안 마취로 돌아갑니다. 이제 22게이지 길이의 무딘 바늘이 장착된 250마이크로리터 가스형 폐지 주사기에 150마이크로리터의 공기를 끌어들입니다. 그런 다음 테프론 플런저를 150마이크로리터 표시에서 주사기 본체의 200마이크로리터 표시로 전진시켜 주사기가 로드될 때 50마이크로리터의 박테리아 접종물을 뽑습니다.LA, 삽관 플랫폼에 누워 있는 진정된 쥐는 플랫폼에 연결된 벨크로 스트립에 부착된 링이 없는 앞니로 동물을 고정합니다. 마우스를 45도 각도로 들어 올린 다음 마이크로 코튼 애플리케이터를 사용하여 주로 사용하는 손으로 롤링 동작으로 혀를 집어넣습니다. 다음으로, 주로 사용하지 않는 손으로 삽관 스페큘러가 장착된 수술용 검이경을 사용하여 혀 후퇴를 유지하고 후두개염을 시각화합니다.그런 다음 주로 사용하는 손에 20게이지 카테터를 끼운 가이드 와이어를 잡고 마우스를 기관 내 10mm 깊이까지 삽관하고 검이경을 제거합니다. 주로 사용하지 않는 손으로 카테터를 고정합니다. 그런 다음 유색 염료가 포함된 16번째 투명 튜브 하나의 루어 연결 길이를 카테터에 짧게 부착합니다.염료는 동물이 성공적으로 삽관되었을 때 동물의 호흡에 반응하여 앞뒤로 빠르게 이동해야 합니다. 22 게이지 뭉툭한 바늘을 카테터에 삽입하고 한 번의 유체 동작으로 접종물을 폐에 직접 분배합니다. 그런 다음 즉시 동물에서 바늘과 카테터를 제거하고 동물이 마취에서 완전히 회복 될 때까지 모니터링하면서 마우스를 케이지로 되돌립니다.감염된 폐 조직의 박테리아 부담을 평가하려면 멸균 기술을 사용하여 폐를 제거하고 조직을 미리 계량된 멸균 1온스 샘플 백에 넣습니다. 샘플 백과 폐의 무게를 측정한 후 조직에 1ml의 멸균 PBS를 추가하고 샘플 백을 재판매합니다. 그런 다음 25ml의 혈청학적 피펫을 샘플 백 위에 부드럽게 굴려 조직을 균질화합니다.멸균 폴리에스터 벽 코스 필터를 통해 연결된 조직을 제거하고 균질액을 최종 농도 100%로 tritton X 100으로 처리하여 박테리아를 방출합니다. 다음으로, 멀티채널 피펫을 사용하여 UBO 96 웰 플레이트에서 균질액을 6배 연속 희석합니다. 그런 다음 8웰 다중 채널을 사용하여 균질한 삼중 10마이크로리터 분취액을 LBA 한천 플레이트에 플레이트합니다.마지막으로, 섭씨 37도에서 밤새 플레이트를 배양하고 다음 날 군체 형성 단위를 열거합니다. 이 대표적인 실험에서 주입된 동물의 폐에서 회수된 슈도모나스 에어로겐 접종물의 98% 이상이 이 방법을 통해 박테리아의 전달이 매우 효율적입니다. 또한, IIT 설치는 투여된 접종물의 농도에 관계없이 재현성이 높습니다.IIT 방법을 통해 주입된 물질의 분포를 시각화하기 위해 접종에 대해 방금 입증된 것처럼 50마이크로리터의 0.1% Kumasi brilliant blue dye를 폐로 전달할 수 있습니다. 주목하라, 폐의 모든 엽에 염료의 분포 일단 숙달되면. 이 방법은 두 명의 연구자로 구성된 팀과 함께 마취, IMA 접종 및 마취 회복을 포함하여 평균 2-3분 안에 신속하게 수행할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 마우스 삽관 시도가 두 번 이상 실패하지 않는 것이 중요합니다. 삽관에 실패하면 카테터를 기관이 아닌 식도에 삽입하여 잠재적인 외상을 입을 수 있습니다. abs L 3 봉쇄가 필요한 병원체를 포함한 많은 호흡기 병원체는 안전 캐비닛에서 입증된 바와 같이 이 절차를 수행할 수 있고 추가로 안면 보호대를 포함한 완전한 호흡기 보호구를 착용한 연구원에 의해 수행될 수 있으므로 imed에 의해 효과적으로 전달될 수 있습니다.우리는 모방이 쥐의 폐로 물질을 직접 전달하는 매우 정확하고 효율적인 방법임을 입증했습니다. 이러한 특성으로 인해 재현성이 높은 모델 시스템이 필요한 GLP 유형 연구에 적합합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

Intratracheal instillations 직접 폐에 solutes을 제공합니다. 이 절차는 폐암의 말초 지역에 instillate의 전달을 대상으로하고, 따라서 종종 폐포를 공부하기위한 연구에 통합됩니다. 우리는 생쥐에서 intratracheal instillations을 수행하기위한 세부적인 생존 프로토콜을 제공합니다.

마우스 폐에 Solutes 직접 Tracheal 떨어뜨림

우리는기도를 통해 anesthetized 생쥐의 폐에 시험 물질의 비 수술 전달을 보여줍니다. 이 방법은 세균과 바이러스 병원균, 크린 시토킨, 항체, 구슬, 화학, 또는 염료로 폐 노출 수 있습니다. 우리는 더 이상 수확 및 유동세포계측법에 대한 폐, 폐 배수 림프절 (LDLNs) 처리 설명합니다.

유동세포계측법에 의해 폐, 폐 배수 림프절의 분석과 마우스의 비 수술 Intratracheal 떨어뜨림

이 비디오는 실험제를 원위 우측 및 좌측 폐에 선택적으로 투여하는 기관지 내 접근법을 설명합니다. 주요 프로토콜에서는 폐 섬유증에 대한 더 나은 모델을 얻기 위해 블레오마이신을 마우스에 기관지 내로 투여할 것입니다.

기관지 내 전달: 실험 제제를 쥐의 폐에 선택적으로 투여하는 기술

인간 폐 질환의 상태를 본뜬 모델의 사용은 특정 질환의 병태 생리학 및 / 또는 병인을 연구 및 치료 적 개입을 개발에 중요하다. 여기에 직접 마우스의 폐에 외인성 물질을 제공 할 수있는 비 침습적 인 기관 내 삽관 방법이 제시된다.

비 침습적 기관 내 삽관 마우스 폐의 병리학 및 생리학을 연구하는

이 문서에서는 삽관을 통해 마우스 기관에 직접 블레오 마이신 관리를위한 신속하고 간단한 방법을 제공합니다. 이러한 방법의 주요 장점은 마스터 높은 재현성 쉽고, 특수 장비 나 긴 회복 시간을 요구하지 않는다는 점이다.

마우스의기도 신속 삽관 용 개선 된 방법

쥐에서 실험제의 INTracheal (IT) 투여는 종종 말단 폐에 비대칭 전달을 초래한다.  이 보고에서는, 우리는 살아있는 마우스에 있는 각 폐를 비 작동가능하게 캐뉼기 위하여 직접적인 기관내 (IB) 접근을 기술합니다.  이러한 접근법은 하나의 폐에 제제를 선택적으로 투여하기 위해 사용될 수 있거나 또는 두 폐에 대한 대칭에이전트 전달을 개선하기 위해 적응될 수 있다.

마우스 폐 내 선택적 에이전트 침착을 개선하기 위한 직접 기관내 투여

흡입을 위한 건식 분말 제형은 호흡기 질환 치료에 큰 잠재력을 가지고 있습니다. 인간 연구에 들어가기 전에, 전임상 연구에서 건식 분말 제형의 효능을 평가할 필요가 있다. 간 내 막 경로를 통해 마우스에서 건조 분말을 투여하는 간단하고 비침습적 방법이 제시된다.

쥐에서 건조 분말 제형의 장내 투여

신생아 설치류의 기관에 약물을 직접 주입하는이 기술은 국소 투여 약물 또는 생물학이 신생아 폐 질환에 미치는 영향을 연구하는 데 중요합니다. 추가적으로, 이 방법은 또한 동물 모델에서 폐 손상을 유도하는데 사용될 수 있다.

폐 질환을 치료하기 위해 신생아 설치류에 약물을 기관 내 점적하는 최소 침습적 방법

여기에서 우리는 비침습적 구인두 기관내 삽관을 통한 기관내 지질다당류(LPS) 전달을 위한 프로토콜을 제안합니다. 이 방법은 동물에 대한 수술 절차의 외상을 최소화하고 LPS를 기관으로 정확하게 전달한 다음 폐로 전달합니다.

Noninvasive Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation in Mice

이 프로토콜은 마우스를 최적으로 배치하고 카메라 기반 검이경을 경구로 삽입하면 성문을 시각화하고, 조직 외상을 최소화하면서 신속한 삽관을 수행하며, 폐에 액체를 일관되게 전달할 수 있는 방법을 보여줍니다.

쥐의 폐에 액체를 전달하기 위한 개선된 방법론: 소비자 검이경을 사용한 삽관

세포 요법은 전구 세포를 사용하여 손상된 조직을 복구하고 폐 기능을 개선함으로써 폐 섬유증에 대한 유망한 중재를 제공합니다. 이미징이 세포 통합을 추적하는 데 중추적인 역할을 하기 때문에 여기에서는 마우스 모델에서 폐 섬유증에 대한 세포 요법의 자기 입자 이미징 유도 생체 내 추적에 대해 설명합니다.

자기 입자 이미징을 사용한 폐 섬유증에 대한 이식된 원위 폐 상피 전구 세포의 이미지 유도 생체 내 추적

배우세요 생쥐 폐에 비침습적으로 박테리아를 전달하는 삽관 매개 기관 내(IMIT) 기관 내 투여법. 이 방법은 호흡기 질환 연구와 치료제 전달에 정확하고 재현 가능한 결과를 제공합니다.

삽관 매개 기관 내 (IMIT) 떨어 뜨림 : 비 침습적, 폐 별 전달 시스템

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