삽관 매개 기관 내 (IMIT) 떨어 뜨림 : 비 침습적, 폐 별 전달 시스템

이 절차의 전반적인 목표는 박테리아를 비침습적으로 쥐의 폐로 직접 전달하는 것입니다. 이것은 먼저 150마이크로리터의 에어 쿠션을 가스 밀폐 주사기에 적재한 다음 준비된 박테리아 현탁액 50마이크로리터를 적재하여 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 마취된 마우스에 가이드 와이어를 사용하여 20게이지 카테터를 삽관하여 배치를 돕습니다.

그런 다음 간단한 유량계를 사용하여 삽관의 성공을 확인한 후 박테리아 접종물을 22게이지 길이의 뭉툭한 바늘로 카테터를 통해 폐로 직접 전달합니다. 궁극적으로, 기관내 삽관 매개 또는 접종 생략은 생쥐의 하기도 질환을 연구하는 데 사용할 수 있으며, 상부 호흡기의 동시 침범을 피할 수 있습니다. 비강 내 접종 방법에 비해 모방의 주요 장점은 이 기술을 통해 접종물을 폐에 직접 정확하고 재현 가능하게 전달할 수 있다는 것입니다.

IIT는 비수술적 기법이기 때문에 외과적 기관내 시술과 관련된 합병증의 가능성도 줄여줍니다. 이 방법은 발병 기전을 연구하기 위해 박테리아를 폐로 전달하는 신뢰할 수 있는 메커니즘을 제공할 수 있지만, IMA는 폐 손상을 연구하기 위한 환경 화합물, 치료를 위한 치료제의 표적 전달, 이미징 프로브 또는 기본 폐 생물학을 연구하기 위한 SRNA의 전달과 같은 다른 시약의 전달에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 동물의 신중한 위치와 가이드와이어 삽입을 위한 자동 내시경이 필요하기 때문에 삽관 단계에서 어려움을 겪을 것입니다.

이 방법의 시각적 시연은 가이드와이어를 기관에 처음 배치하는 것이 새로운 연구자에게 개념적으로 설명하기 어렵기 때문에 도움이 됩니다.설치 15시간 전에 단일 박테리아 콜로니로 3ml의 육수 배양을 접종하고 섭씨 37도에서 배양하고 200RPM에서 셰이커를 배양합니다. 15시간 후, 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 1ml의 세포를 넣고 1ml의 PBS에 입천장을 다시 매달

다음으로, OD 600에서 박테리아 스톡 현탁액의 1-10 희석을 측정하여 박테리아 농도를 측정합니다. 그런 다음 PBS의 박테리아 세포를 접종물 50마이크로리터당 원하는 박테리아 농도로 희석합니다. IIT 설치의 경우, 간침 마우스로 가볍게 마취된 마우스에 2% 리도카인 용액을 투여하여 마우스에 IIT를 준비합니다.

리도카인이 효과를 발휘하는 동안 마취로 돌아갑니다. 이제 22게이지 길이의 무딘 바늘이 장착된 250마이크로리터 가스형 폐지 주사기에 150마이크로리터의 공기를 끌어들입니다. 그런 다음 테프론 플런저를 150마이크로리터 표시에서 주사기 본체의 200마이크로리터 표시로 전진시켜 주사기가 로드될 때 50마이크로리터의 박테리아 접종물을 뽑습니다.

LA, 삽관 플랫폼에 누워 있는 진정된 쥐는 플랫폼에 연결된 벨크로 스트립에 부착된 링이 없는 앞니로 동물을 고정합니다. 마우스를 45도 각도로 들어 올린 다음 마이크로 코튼 애플리케이터를 사용하여 주로 사용하는 손으로 롤링 동작으로 혀를 집어넣습니다. 다음으로, 주로 사용하지 않는 손으로 삽관 스페큘러가 장착된 수술용 검이경을 사용하여 혀 후퇴를 유지하고 후두개염을 시각화합니다.

그런 다음 주로 사용하는 손에 20게이지 카테터를 끼운 가이드 와이어를 잡고 마우스를 기관 내 10mm 깊이까지 삽관하고 검이경을 제거합니다. 주로 사용하지 않는 손으로 카테터를 고정합니다. 그런 다음 유색 염료가 포함된 16번째 투명 튜브 하나의 루어 연결 길이를 카테터에 짧게 부착합니다.

염료는 동물이 성공적으로 삽관되었을 때 동물의 호흡에 반응하여 앞뒤로 빠르게 이동해야 합니다. 22 게이지 뭉툭한 바늘을 카테터에 삽입하고 한 번의 유체 동작으로 접종물을 폐에 직접 분배합니다. 그런 다음 즉시 동물에서 바늘과 카테터를 제거하고 동물이 마취에서 완전히 회복 될 때까지 모니터링하면서 마우스를 케이지로 되돌립니다.

감염된 폐 조직의 박테리아 부담을 평가하려면 멸균 기술을 사용하여 폐를 제거하고 조직을 미리 계량된 멸균 1온스 샘플 백에 넣습니다. 샘플 백과 폐의 무게를 측정한 후 조직에 1ml의 멸균 PBS를 추가하고 샘플 백을 재판매합니다. 그런 다음 25ml의 혈청학적 피펫을 샘플 백 위에 부드럽게 굴려 조직을 균질화합니다.

멸균 폴리에스터 벽 코스 필터를 통해 연결된 조직을 제거하고 균질액을 최종 농도 100%로 tritton X 100으로 처리하여 박테리아를 방출합니다. 다음으로, 멀티채널 피펫을 사용하여 UBO 96 웰 플레이트에서 균질액을 6배 연속 희석합니다. 그런 다음 8웰 다중 채널을 사용하여 균질한 삼중 10마이크로리터 분취액을 LBA 한천 플레이트에 플레이트합니다.

마지막으로, 섭씨 37도에서 밤새 플레이트를 배양하고 다음 날 군체 형성 단위를 열거합니다. 이 대표적인 실험에서 주입된 동물의 폐에서 회수된 슈도모나스 에어로겐 접종물의 98% 이상이 이 방법을 통해 박테리아의 전달이 매우 효율적입니다. 또한, IIT 설치는 투여된 접종물의 농도에 관계없이 재현성이 높습니다.

IIT 방법을 통해 주입된 물질의 분포를 시각화하기 위해 접종에 대해 방금 입증된 것처럼 50마이크로리터의 0.1% Kumasi brilliant blue dye를 폐로 전달할 수 있습니다. 주목하라, 폐의 모든 엽에 염료의 분포 일단 숙달되면. 이 방법은 두 명의 연구자로 구성된 팀과 함께 마취, IMA 접종 및 마취 회복을 포함하여 평균 2-3분 안에 신속하게 수행할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 마우스 삽관 시도가 두 번 이상 실패하지 않는 것이 중요합니다. 삽관에 실패하면 카테터를 기관이 아닌 식도에 삽입하여 잠재적인 외상을 입을 수 있습니다. abs L 3 봉쇄가 필요한 병원체를 포함한 많은 호흡기 병원체는 안전 캐비닛에서 입증된 바와 같이 이 절차를 수행할 수 있고 추가로 안면 보호대를 포함한 완전한 호흡기 보호구를 착용한 연구원에 의해 수행될 수 있으므로 imed에 의해 효과적으로 전달될 수 있습니다.

우리는 모방이 쥐의 폐로 물질을 직접 전달하는 매우 정확하고 효율적인 방법임을 입증했습니다. 이러한 특성으로 인해 재현성이 높은 모델 시스템이 필요한 GLP 유형 연구에 적합합니다.