Name: 배아의 몸의 다른 크기에 의해 유도 다 능성 줄기에서 망막 색소 상피 세포 (RPE)를 도출 (IPS) 세포 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: 배우세요 iPS 세포에서 배아체 크기에 따른 망막 색소 상피 세포(RPE) 분화 효율을 극대화하는 방법을. 미세우물 기술을 활용한 이 프로토콜은 황반변성 등 망막 퇴행성 질환 치료 연구에 활용됩니다.

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여기에 포함된 의견이나 주장은 저자의 개인적인 견해이며 공식적이거나 육군성 또는 국방부의 견해를 반영하는 것으로 해석되어서는 안 됩니다. 이 연구는 저자인 Alberto Muñiz, Ramesh R Kaini, Whitney A Greene 및 Jae-Hyek Choi가 USAISR에서 National Research Council Postdoctoral Research Associateship을 개최하는 동안 수행되었습니다. 이 작업은 미 육군 CRMRP(Clinical Rehabilitative Medicine Research Program) 및 MOMRP(Military Operational Medicine Research Program)의 지원을 받았습니다.

문화 시약 및 문화 플레이트 1. 준비 <ol><li> 줄기 세포 기초 배지 400㎖의 5 배의 무 혈청 보충 100 ㎖를 첨가하여 피더없는 줄기 세포 배양 배지를 준비한다. 매체는 최대 2 주 동안 4 ℃에서 6 개월 -20 ° C에서 안정적이다. </li><li> RHO 관련, 코일 코일 포함하는 단백질 키나제 (락) 억제제 (Y-27362)에 시중에서 판매하는 배아 체 (EB) 형성 매체의 10 μm의 솔루션을 추가합니다. </li><li> (둘 베코 변형 이글 보통 / 영양소 혼합물 F-12 0.1 밀리미터 β 머 캅토 에탄올, 0.1 mM의 비 필수 아미노산, 2 mM L- 글루타민, 10 % 녹아웃 혈청 교체 (KSR) 및 10 ㎍ / ml의 겐타 마이신을 첨가하여 DMEM을 분화 배지를 준비 / F12). </li><li> 1X N1 보충제, 0.1 mM의 비 필수 아미노산, 250 ㎍ / ml의 타우린 13 NG / ㎖ triiodo-L-로닌 나트륨 염, 20 NG / ㎖의 하이드로 코르티손, 5 ㎍ / ml의 겐타 마이신, 및 15 %를 첨가하여 만능-RPE 미디어를 준비 소 태아 혈청 (FBS) &lt;SUP&gt; 최소 필수 중간 이글 (MEM) 21. 7.4 pH를 조정합니다. </li><li> triiodo-L-티 로닌 나트륨 염 주식 솔루션을 준비합니다. 부드럽게 선회하여 1 N 수산화 나트륨에 triiodo-L-로닌 나트륨 염 1mg을 녹인다. MEM 49 ㎖를 triiodo-L-로닌 나트륨 염을 50ml의 20 ㎍ / mL로. 분취 량을 준비하고 필요할 때까지 -20 ° C에서 동결. 최종 배지에서 원하는 농도를 달성하기 위해 적절한 양을 사용한다. </li><li> 하이드로 주식 솔루션을 준비합니다. 교반과 100 % 에탄올 1 ㎖에 1 mg의 하이드로 코르티손을 가용화. MEM 19 ㎖를 20 ㎖ 하이드로 코르티손 원액 ㎍ / ㎖의 (50)을 추가합니다. -20 ° C에서 나누어지는 및 동결이 필요할 때까지. 최종 배양액의 목적하는 농도를 달성하기 위해 적절한 양을 사용한다. </li><li> DMEM / F12 1 ㎎ / ㎖의 디스 파제의 작업 솔루션을 준비합니다. </li><li> 매트릭스 코팅 된 플레이트의 제조 <ol><li> Engelbreth-홀름 - 스웜 (EHS)에서 추출한 단백질 매트릭스 양해 각서 (MOU)를 준비0.08 ㎎ / ㎖에 DMEM / F12에서 자체 육종 세포. 매트릭스 코트 액 1 mL를 6- 웰 플레이트의 각 웰. 1 시간 동안 실온에서 코팅 된 플레이트를 인큐베이션. </li><li> 1 시간 배양 후, 여분의 DMEM / F12를 대기음. 웰의 건조를 방지하기 위하여 피더없는 줄기 세포 배양액 0.5ml를 추가. 매트릭스 코팅 된 플레이트를 사용할 준비가되었습니다. </li></ol></li><li> DMEM / F12 2 ㎖ 잘 각을 세척하여, 마이크로 웰 플레이트를 준비합니다. DMEM / F12를 제거하고 각 잘하는 락 억제제와 보충 EB 형성 매체의 0.5ml를 추가합니다. 5 분 모든 공기 방울을 제거하기 위해 2000 XG에 플레이트를 원심 분리기. </li><li> 인산 완충 식염수 (PBS)에 아 지드 화 나트륨을 2 % FBS를 혼합하여 FACS 염색 버퍼를 준비하고, 0.09 %. pH가 7.4로 버퍼를 조정합니다. </li><li> DMEM / F12, 10 % FBS를 첨가함으로써 트립신 중화 용액을 준비한다. </li></ol> 2. 만능 문화 <ol><li> 유도 만능 줄기 세포 파종하기 전에 따뜻한 공급 장치가없는 줄기 세포 배양 37 ° C 중간, 그리고 엄마가TRIX 판을 준비 코팅. </li><li> 빠르게 37 ° C의 물을 욕조에 IMR90-1 만능 줄기 세포를 해동. 그런 다음 물을 욕조에서 극저온 유리 병을 제거하고 70 % 에탄올로 유리 병을 닦습니다. 세포 덩어리의 파괴를 최소화하기 위해 2 ㎖의 피펫을 사용하여 15 ML 원뿔 튜브에 세포를 전송합니다. </li><li> 적가 따뜻한 피더 세포에 무 줄기 세포 배양 배지 5 ㎖를 첨가하고 부드럽게 혼합한다. RT에서 5 분 300 XG에서 세포를 원심 분리기와 뜨는을 제거합니다. </li><li> 조심 피더없는 줄기 세포 배양 배지 2 ㎖로 세포를 재현 탁하고 덩어리 매트릭스 코팅 플레이트의 웰에 세포 덩어리를 시드. 5 % CO 2, 95 % 습도가 37 ° C를 인큐베이터에 접시를 놓습니다. </li><li> 매일 만능 줄기 세포 배양 배지를 변경합니다. 파종 후 미분화 식민지에게 5-7일을 준수하십시오. 광학 현미경 아래로 (고밀도 센터와 식민지)에 대한 준비가 미분화 식민지를 확인합니다. </li></ol> 유도 만능 줄기 세포의 3과 Passaging <ol><li> 처음으로 통과하기 전의 IPS 세포는 수욕 중에서 37 ° C로 디스 파제 용액, DMEM / F12 및 피더없는 줄기 세포 배양 배지를 가온. </li><li> 유도 만능 줄기 세포를 계대하기 전에 지역을 긁고 매체를 흡입하여 차별화의 영역을 제거합니다. 조심스럽게 2 ml의 DMEM / F12와 유도 만능 줄기 세포를 씻어. </li><li> / ㎖ 디스 파제 각 웰에 1 mg을 1 ㎖를 추가하고 7 분 37 ° C에서 품어. 디스 파제를 대기음 부드럽게 DME​​M / F12 두 배의 2 ml의 세포 식민지를 씻어. 세척 후, 각 웰에 무 피더 줄기 세포 배양액 2 ㎖를 추가한다. </li><li> 5 ㎖의 피펫을 사용하여 부드럽게 세포 덩어리를 형성하기 위해 판의 식민지를 긁어. 15 ML 원뿔 관에 분리 된 세포 덩어리를 전송합니다. 세포의 다음 구절을 시드하는 충분한 공급이없는 줄기 세포 배양 배지를 추가합니다. </li></ol> 마이크로 웰 플레이트를 사용하여 사채의 4 세대 <ol><li> IPS 세포의 단일 세포 현탁액의 제조 <ol><li> mediu 제거유도 만능 줄기 세포로부터 m과 DMEM / F12의 2 ml로 유도 만능 줄기 세포를 씻어. 6 웰 플레이트에서 유도 만능 줄기 세포에 accutase 750 μl를 추가합니다. 셀 플레이트 (약 5-10 분)에서 분리 할 수 있도록 37 ° C, 5 % CO 2에서 세포를 배양한다. </li><li> 부드럽게 남아있는 세포를 해리 피펫을 사용하고 플레이트 표면에 남아있는 세포를 분리. 50 ML 원뿔 튜브에 세포를 전송합니다. DMEM / F12 5 ㎖와 함께 접시를 씻어 원뿔 튜브에 세포를 세척 DMEM / F12을 결합한다. 가능한 잔여 세포 덩어리를 제거하기 위해 40 μm의 셀 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 전달합니다. </li><li> accutase을 제거하기 위해 RT에서 5 분 동안 300 XG에서 세포를 원심 분리기. 세포 농도가 약 0.5 내지 1.0 × 10 7 세포 / ㎖가되도록 EB 형성 매질에서 세포 펠렛을 재현 탁. </li><li> 트립 판 블루 및 혈구와 세포를 계수하여 생존 세포의 수를 결정한다. </li></ol></li><li> Adjustin마이크로 웰 g의 셀 밀도는 크기 제어 사채를 형성 <ol><li> EB 원하는 크기를 생성하는 마이크로 웰 플레이트의 각 웰에 셀의 수를 조정한다. 균등 부드럽게 세포를 여러 번 피펫 팅하여 세포를 분산 단계에서 제조 된 1.9 마이크로 웰 플레이트에 셀을 추가한다. 참고 : 잘 당 마이크로 웰의 EB의 X 번호 당 세포의 잘 당 필요한 세포의 수 = 원하는 번호. </li><li> 2.0 ml의 최종 부피로 우물에 바위 억제제와 보충 EB 형성 매체를 조정합니다. 부드럽게 각 피펫 팅 잘하여 세포를 재분배. 3 분 동안 100 XG에서 마이크로 웰 플레이트를 원심 분리기. 5 % CO 2, 24 시간 동안 95 %의 습도가 37 ° C에서 인큐베이터에서 접시를 놓습니다. </li></ol></li><li> 마이크로 웰 플레이트에서 수확 사채 <ol><li> 잘 사채의 대부분을 제거하는 1 ml의 micropipettor와 상하 매체를 피펫 팅 마이크로 웰에서 수확 사채. 역 40 μm의 세포를 통해 EB 서스펜션 전달50 ML 원뿔 튜브의 상단에 스트레이너는 하나의 세포를 제거합니다. </li><li> 모든 사채를 제거하는 DMEM / F12의 1 ml의 마이크로 웰 플레이트 5 회 반복한다. 세척을 수집하고 반전 셀 스트레이너를 통해 전달합니다. 새로운 50 ML 원뿔 튜브까지 셀 스트레이너 오른쪽으로 돌립니다. EB 형성 매체로 세척하여 사채를 수집합니다. 수율을 결정하기 위해 사채를 계산합니다. </li></ol></li></ol> 5. 도금 사채 및 초기화 차별화 <ol><li> &lt;1000 사채 /의 밀도에 잘 EB 형성 매체 플러스 10 μM 바위 억제제 (단계 1.8.1에서와 같이) 여섯 잘 접시를 코팅 단백질 매트릭스에 사채 플레이트. 5 % CO 2, 24 시간 동안 95 %의 습도가 37 ° C에서 사채를 품어. </li><li> 24 시간 EB 도금 후, 분화를 시작하기 위해 차별화 매체로 교체합니다. 세포가 추가 분석을 위해 수집 될 때까지 매일 분화 매체의 절반을 변경합니다. </li><li> RT-PCR을 수행하기 위해 6 일, 17, 29 및 60 ℃에서 샘플을 수집, IMMunocytochemistry 및 FACS는 특성 RPE 유전자와 단백질의 발현을 확인합니다. </li></ol> 6. RNA 추출 및 PCR <ol><li> 시중에서 판매되는 키트에 제공된 지침에 따라 EB 샘플에서 RNA를 추출합니다. 분광 광도계를 사용하여 RNA 농도를 측정. </li><li> cDNA를 역 전사 키트 시판 RNA에 따라 총 RNA 100 NG에 역전사를 수행합니다. </li><li> cDNA를 10 μmol / 10 NG의 농도 10ng의 cDNA를 다음의 프라이머를 사용하여 (표 1)로 PCR을 수행한다. 다음과 같이 PCR을 설정 : 5 분 동안 95 ° C에서 DNA를 변성, 72 ℃에서 최종 사이클 뒤에 30 초, 1 분, 72 ° C에 대해 15 초 동안 95 ° C에서 35 사이클과 60 ° C를 증폭 10 분간 C. 1 % 아가로 오스 겔에 PCR 제품을 실행합니다. </li></ol> 7. 면역 세포 화학 <ol><li> RT에서 PBS로 2 회 교환 사채를 씻으십시오. 4 % paraformald에 실온에서 EBS을 (를) 수정10 분 동안 ehyde. RT 한 번 PBS로 씻어. 4 ° C에서 PBS에 보관 샘플 염색에 사용되는 때까지. </li><li> 염색 날, 고정 및 투과성으로 시약 고정 된 세포를 취급합니다. RT에서 1 시간 동안 (투과성으로 용액에 10 % 염소 혈청) 차단 용액과 샘플을 인큐베이션. </li><li> 표시된 희석에서 다음 일차 항체를 사용하여 투과성으로 용액에 10 % 염소 혈청으로 면역 화학을 수행 안티 PAX6을 (1:10), 안티 RX (1 : 200), 안티 MITF (1:30)을 수행하고, 항 - ZO1 (1 : 100). 4 ° C에서 항체 O / N 대응과 샘플을 품어. </li><li> 다음날, 세포로부터 차 항체를 제거하고 PBS로 세 번 샘플을 헹군다. 실온에서 1 시간 동안 형광 접합 된 이차 항체와 샘플을 품어. </li><li> 세포에서 차 항체를 제거하고 PBS에서 샘플을 세 번 헹군다. 커버가 장착 매체를 포함 DAPI와 유리 슬라이드에 미끄러 져 마운트 및 샘플 어두운 챔버에서 O / N을 설정할 수 있습니다.염색을 시각화하기 위해 형광 현미경을 사용합니다. </li></ol> FACS 분석 8. 염색 <ol><li> PBS에 두 번 배양 사채을 씻으십시오. 단일 세포 현탁액을 5 ~ 10 분 동안 0.25 % 트립신 0.5 mL를 사채를 품어. 트립신 중화 용액 트립신 (1 ㎖ / 웰)을 중화. </li><li> 10 분 동안 600 XG에 15 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기에 단일 세포 현탁액을 전송합니다. </li><li> 상층 액을 제거하고 튜브에 세포를 DMEM / F12 10 ㎖를 추가합니다. 부드럽게 세포를 섞어 반전. 600 × g에서 원심 분리기. 원심 분리 후, 상청액을 폐기하고 FACS 염색 버퍼에 세포를 재현 탁. </li><li> 세포의 총 수를 계산. 10 분 동안 600 XG에 원심 분리기. 원심 분리 폐기 뜨는 후. 즉시 4 % 파라 포름 알데히드 0.5ml를 첨가하여 세포를 고정. 부드러운 소용돌이로 교반하여 잘 섞는다. 20 분 동안 4 ° C에서 세포를 품어. </li><li> 10 분 동안 600 XG에 원심 분리기 및 제거상층 액. 소용돌이 부드럽게 세포 펠렛을 방해합니다. 냉장 된 투과성으로 용액 1 ㎖를 첨가하여 세포를 Permeabilize 하시려면. 소용돌이 부드럽게 섞어 30 분 동안 얼음에 품어. </li><li> 10 분 동안 600 XG에서 원심 분리기와 뜨는을 제거합니다. FACS 염색 버퍼에 resuspend 3 ㎖를 추가합니다. 한 번 더에 대해이 단계를 반복합니다. 5 × 106 세포 / ml의 최종 농도 FACS 염색 버퍼에 세포를 재현 탁. </li><li> 각각의 미세 원심 튜브에 세포 현탁액 (0.5 × 10 6 세포)의 100 μl를 전송하고 차 항체의 권장 용량을 추가 할 수 있습니다. PAX6를 들어, 세포 현탁액 100 ㎕에 PE 방지 PAX6의 5 μl를 추가합니다. MITF를 들어, 세포 현탁액 100 ㎕에 방지 MITF의 5 μl를 추가합니다. </li><li> 혼합하고 60 분 동안 실온에서 배양한다. FACS 염색 버퍼의 3 ML을 추가합니다. 10 분 동안 600 XG에서 혼합하고 원심 분리기. 상층 액을 제거하고 두 개의 추가 회 8.16를 반복합니다. </li><li> MITF 염색의 경우, 보조 antibo에서 세포를 배양DY, 하나의 희석에 염소 항 - 마우스 알렉사 형석 488 : 4 ° C에서 1 시간 동안 2000. PAX6 염색의 경우,이 단계를 피할 수 있습니다. </li><li> 10 분 동안 600 XG에서 FACS 염색 버퍼와 원심 분리기의 5 ml의 세포를 씻으십시오. 두 번 더에 대해이 과정을 반복합니다. </li><li> 세포 펠렛을 방해 부드럽게 FACS 염색 버퍼 및 500 μl의 소용돌이에 세포를 재현 탁. 샘플은 유세포 분석을위한 준비가되어 있습니다. </li></ol> 9. 만능 줄기-RPE의 분리 및 문화 <ol><li> 하루에 29에서주의 깊게 200 μL 피펫 팁을 사용하여 배양 용기에서 선택한 색소 식민지 주위에 잘라. 15 ML 원뿔 튜브에 떠있는 식민지를 전송합니다. 실온에서 10 분 동안 600 XG에 식민지를 원심 분리기와 뜨는을 제거합니다. </li><li> 10 분 동안 600 XG에 DMEM / F12 원심 10ml에 세포를 재현 탁 콜로니. 상층 액을 제거합니다. </li><li> 7-10 분 동안 37 ℃에서 0.25 % 트립신과 2 ml의 콜로니를 배양하여 단일 세포 현탁액을 제조. 조심스럽게 식민지를 해리 세포 현탁액을 소용돌이. </li><li> 만능-RPE 배지 2 ㎖를 첨가하여 트립신을 중화. 10 분 동안 600 XG에 원심 분리기 상층 액을 버린다. 만능-RPE 배지 2 ㎖로 단일 세포를 재현 탁. 37 ° C, 5 % CO 2 및 95 % 습도 인큐베이터에서 단백질 기질 코팅 6- 웰 플레이트 제자리 세포 이동. </li></ol>

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세포 치료 용 다 능성 줄기 세포의 전체 약속을 실현하기 위해서는, 일관되고 재생 가능한 방법으로 분화를 조절하는 것이 필요하다. 이 보고서는, 마이크로 웰 플레이트 기술을 사용하여 크기 조절 사채를 형성 RPE으로 분화를 시작하고 RPE의 단백질과 유전자 마커를 식별하기 위해 프로토콜을 설명합니다. 체외 분화를 동기화하려면, 사채의 균일 한 크기는 강제로 집계하여 마이크로 웰 플레이트에서 원심 분리 만능 줄기 세포의 알려진 숫자에 의해 형성되었다. 면역 세포 화학 및 역전사 중합 효소 연쇄 반응 (RT-PCR)을 설명 식 RPE 및 단백질의 유전자를 모니터링하는 데 사용된다. 마지막으로, 서로 다른 크기의 EB를 분화에서의 효율은 FACS 분석에 의해 분석 하였다. 이러한 기술은 미래 애플리케이션 RPE에 만능 줄기 세포의 분화를 촉진 할 수있다. 주의 깊게 이메일에 실행해야합니다이 방법 몇 가지 중요한 포인트가 있습니다정확한 데이터의이 프로토콜과 달성의 성...

유도 된 다 능성 줄기 (IPS) 세포 외적 요인으로 성인 1 셀 재 프로그래밍에 의해 도출 된 다 능성 줄기 세포의 유형이다. 대조적으로, 배아 줄기 세포 (는 ESC), 다 능성 줄기 세포의 다른 유형은, 2-3 배반포의 내부 세포 덩어리로부터 생성된다. 서로 다른 기원에도 불구하고, 유도 만능 줄기 세포와는 ESC는 체외에서 어떤 세포 유형 4-5로 분화하는 능력에 복제 할 수있는 자신의 무제한 용량의 비교입니다. 유도 만능 줄기 세포의 이러한 특성은 그들에게 개인화 된 재생 의학의 애플리케이션에 이상적 후보를합니다. 최근의 연구 노력은 망막 색소 상피 (RPE) 6-11 포함 전문 성인 세포를 제조하기위한 강력한 분화 프로토콜 개발에 초점을 맞추고있다. 만능 줄기 세포 유래의 잠재적 임상 적용의 경우, 특정 세포 유형에 대한 지시 분화 필수적이다. 여러 가지 방법이 있습니다효율성 6-7, 12-16으로 크게 변화 RPE에 모두는 ESC와 유도 만능 줄기 세포의 직접 분화 발표했다. 우리는 여전히 개발 또는 분화하는 동안 세포 / 조직의 운명을 지배하는 분자 이벤트의 많은 모른다. 최근 몇년 최대한 학적 개발을 모방 할 수 분화 프로토콜을 개발하기위한 노력이 이루어지고있다. 배반포 단계에서 줄기 세포의 커밋되지 않은 인구는 세 가지 차원 미세 환경에서 함께합니다. 따라서, 다양한 전략이 함께 조립 ESC / 만능 줄기 세포를 만들어 입체적으로 그들을 성장에 적용되었다. 이러한 줄기 세포 집합체는 배아 체 (사채)이라고합니다. 연구는 줄기 세포의 분화 EB는 배아 발달의 초기 단계를 모사하고 자발적 외면에 원시 내배엽을 야기 할 수 있음을 보여 주었다. EB 개발이 진행됨에 따라 나중에 세 생식 계통의 분화 된 세포의 표현형은 17 ~ 18이 나타납니다. 목erefore, 사채를 기반으로 차별화 프로토콜은 ESC / 유도 만능 줄기 세포의 체외 분화에 대한 많은 관심을 끌었다 및 다 능성 줄기 세포 (13)에서 RPE 생성을위한 좋은 후보입니다했다. 사채는 ESC / IPS 세포에서 여러 가지 방법을 사용하여 제조 될 수있다. 처음에는 사채가 부착 식민지를 긁어 및 비 부착 서스펜션 문화를 유지함으로써 이루어졌다. 그러나이 방법은 낮은 재현성이 발생 사채의 이기종 인구를 산출한다. 매달려 드롭 세포 배양 및 마이크로 웰 기반 사채 형성은 매우 재현성 정의 크기의 균일 한 사채를 얻을 사채 형성을위한 다른 인기있는 기술이다. 또한, 마이크로 웰 기법은 적은 노력으로 많은 수의 집합체를 얻을 수있다. 사채 내에서 세포의 분화는 세포와 세포 내 미세 환경에서 형태 형성 큐의 멀티 플렉스에 의해 조절된다. 월의 차별화는 대조적으로olayer 형식, 교환 사채는 세포의 복잡한 어셈블리 (17)를 발생하는 세포 간 신호 전달을위한 플랫폼을 제공합니다. 흥미롭게도, 개별 EB를 만드는 데 사용 능성 줄기 세포의 수는 세포의 운명에 영향을 관찰 하였다. 1000 셀 EB는 적혈구 계보 (20)을 향해 밀어 반면 예를 들어, 인간는 ESC의 조혈 분화 연구에서, 그것은 500 셀 EB는 골수 계통으로 분화를 촉진하는 것이 관찰되었다. 또 다른 연구에서, 작은 사채는 신경 외배엽 분화 (11), (17)으로 승진 큰 사채 반면 내배엽 분화를 선호. 이러한 과거의 연구는 개개의 EB를 강하게 만드는 데 사용 ESC / IPS 세포의 수는 임의의 유형의 세포로 분화를 기반에 영향을 사채 제안. 그러나, 우리의 지식, RPE으로 차별화하기 위해 성향에 사채 크기의 영향을 규명 한 전류 연구는 없다. 본 연구의 목표의 영향을 특성화하는 것이다망막 색소 상피 세포 (IPS-RPE) 분화 및 망막 색소 상피 혈통을 지향 차별화 사채을 할 수있는 최적의 세포 수를 확인하는 - 유도 만능 줄기 (IPS) 세포에 EB 크기입니다.

<table><tbody><tr><td>mTeSR1 배지 + 5x 보충제</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 (Rock Inhibitor)</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>72304</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M-7154</td><td></td></tr><tr><td>Non essential amino acids</td><td>Hyclone(Fisher)</td><td>SH30853.01</td><td></td></tr><tr><td>녹아웃 세럼 교체용</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin&nbsp;</td><td>라이프 테크놀로지</td>스 <td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>라이프 테크놀로지</td>스 <td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>MEM 매체</td><td>라이프 테크놀로지</td>스 <td>10370-021</td><td></td></tr><tr><td>N1 보충제</td><td>시그마</td><td>N-6530-5ML</td><td></td></tr><tr><td>타우린</td><td>시그마</td><td>T-8691-25G</td><td></td></tr><tr><td>하이드로코르티손</td><td>시그마</td><td>H0888-1G</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>Hyclone (Fisher)</td> <td>SH3008803HI</td><td></td></tr><tr><td>Triiodo-L- 티로닌 나트륨&nbsp; 소금</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>수산화 나트륨</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Life Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>Hyclone (Fisher)</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Aggrewell 400 플레이트</td><td>줄기 세포 기술</td><td>27940</td><td></td></tr><tr><td>AggreWell 배지</td><td>줄기 세포 기술</td><td>5893</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>줄기 세포 기술</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm 고정/투과화 키트</td><td>BD Biosciences</td><td>554714</td><td></td></tr><tr><td>마우스 Anti-PAX6 항체</td><td>개발 연구 Hybridoma Bank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit Anti-RX 항체</td><td>Abcam</td><td>Ab23340</td><td></td></tr><tr><td>마우스&nbsp; Anti-MITF 항체</td><td>Thermo Scientific</td><td>MS-772-P</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit Anti-ZO-1 항체</td><td>Invitrogen</td><td>40-2200</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy plus mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>PCR 마스터 믹스</td><td>Promega</td><td>M7502</td><td></td></tr><tr><td>고용량 RNA to cDNA 키트</td><td>Life Technologies</td><td>4387406</td><td></td></tr></tbody></table>

배아의 몸의 다른 크기에 의해 유도 다 능성 줄기에서 망막 색소 상피 세포 (rpe)를 도출 (ips) 세포

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

만능 줄기 세포는 무한정 증식하고 거의 모든 세포 유형으로 분화할 수 있는 능력을 가지고 있습니다. 또한 체세포를 유도만능줄기세포(iPS)로 재프로그래밍하는 기술의 개발은 맞춤형 개인 재생의학의 가능성에 대한 관심과 흥분을 불러일으켰습니다. 그러나 원하는 계통을 향한 줄기세포 분화의 효율성은 여전히 낮습니다. 본 연구의 목적은 체외 분화 과정에서 흔히 발생하는 배아체(EB)의 균질한 집단을 생성하기 위해 조직공학적 접근법을 적용하여 iPS 세포(iPS-RPE)에서 망막 색소 상피(RPE)를 유도하는 프로토콜을 설명하는 것입니다. 이 프로토콜은 마이크로웰 플레이트 기술을 사용하여 특정 크기의 EB 형성을 적용합니다. 면역세포화학(immunocytochemistry) 및 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)에 의한 RPE의 단백질 및 유전자 마커를 확인하는 방법도 설명됩니다. 마지막으로, RPE 마커의 형광 활성화 세포 분류(FACS) 분석으로 모니터링되는 다양한 크기의 EB에서 분화의 효율성에 대해 설명합니다. 이러한 기술은 향후 응용 분야에서 iPS 세포를 RPE로 분화하는 것을 용이하게 할 것입니다.

이 실험에서, 유도 만능 줄기 세포는 배양 및 사채의 망막 색소 상피 계보로 분화. 제어 된 크기의 마이크로 웰 플레이트는 EB를 이용하여 형성 하였다. 도 1 EB 형성에서 보이는 바와 같이 마이크로 웰 플레이트에서 균일했다. 이러한 사채 후 (도 2)를 수집하고, 6 웰 플레이트에 플레이 팅 하였다. RPE는 RPE 마커들은 고전 육각 형태, 착색 및 발현에 의해 식별 될 수있다. 문화 12 주 후, 200 셀 사채는 성상 세포와 섬유 아세포 형태를 개발했다. 어떤 착색이 세포 (도 3A)에서 관찰되지 않았다. 큰 사채 고전 RPE의 형태와 색소 침착의 단층을 개발했다 (그림 3B 및 C) 면역 세포는 망막 색소 상피 마커를 검출하기 위해, MITF와 ZO1 500 셀과 3000 셀 사채에서 파생되었다 단백질의 공동 발현을...

이 보고서의 목적은 배아 체의 다른 크기를 이용하여 유도 된 다 능성 줄기 (IPS) 세포로부터 망막 색소 상피 (RPE)를 도출하는 프로토콜을 기술한다.

배아의 몸의 다른 크기에 의해 유도 다 능성 줄기에서 망막 색소 상피 세포 (RPE)를 도출 (IPS) 세포

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of ...

이 절차의 전반적인 목표는 배아체 분화를 RPE 계통으로 유도하기 위해 배아체 크기가 IPS 세포에서 RPE 분화에 미치는 영향을 특성화하는 것입니다. 이는 먼저 마이크로웰 기술을 사용하여 정의된 크기의 균일한 배아체를 생성함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계에서는 IPS 세포의 유도 분화가 망막 계통을 향해 시작되고, 그 다음 I-P-S-R-P-E 세포가 확인되고 분리됩니다.마지막 단계에서는 I-P-S-R-P-E 세포가 농축 및 확장됩니다. 궁극적으로 I-P-S-R-P-E 세포는 I-P-S-R-P-E 특이적 마커의 발현을 분석할 수 있습니다. 자발적 미분법과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 우리의 기술이 더 높은 RP를 가져온다는 것입니다. 이 물질은 RP 계통을 향한 IPS 세포의 지시된 분화를 최적화하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 기술의 의미는 황반 변성, 망막염 또는 스타가르트 병과 같은 망막 퇴행성 질환의 치료로 확장됩니다. 병에 걸린 RPE를 IPS 세포에서 유래한 건강한 RPE로 대체하는 것이 시력 상실을 예방하는 최선의 방법일 수 있기 때문에, 일반적으로 줄기세포는 매우 섬세하고 손잡이의 미묘한 변화가 분화 과정에 영향을 미칠 수 있기 때문에 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 어려움을 겪을 것입니다. 이 방법의 시각적 시연은 마이크로파 장소에서 배아체 채취 단계가 어렵기 때문에 매우 중요합니다.파종하기 전에 피더 프리 줄기 세포 배양 배지를 섭씨 37도로 예열한 다음 IMR 90 dash one IPS 세포를 섭씨 37도의 수조에서 빠르게 예열합니다. 세포가 해동되면 세포 배지인 따뜻한 피더 프리 줄기 세포 배양액 5ml를 적가하고 부드럽게 섞습니다. 다음으로, 세포를 스핀다운한 다음 2ml의 피더 프리 줄기 세포 배양액에 세포 덩어리를 조심스럽게 재현탁합니다.배지는 매트릭스 코팅 플레이트의 개별 웰에 덩어리를 파종한 다음 세포를 섭씨 37도의 이산화탄소 5%, 습도 95% 및 매일 배지 변화로 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다. 5-7일 후, 광학 현미경으로 통과할 준비가 된 조밀한 중심을 가진 미분화 군체를 관찰합니다. 세포가 준비되면 섭씨 37도의 따뜻한 공간 1밀리리터를 각 웰에 추가하고 플레이트를 섭씨 37도에서 7분 동안 배양합니다.그런 다음 DYS 공간을 흡인하고 2ml의 예열 DM MF 12로 세포 콜로니를 부드럽게 헹굽니다. 두번. 헹궈낸 후 각 웰에 2ml의 피더 프리 줄기 세포 배양 배지를 추가하고 5ml 피펫을 사용하여 콜로니를 부드럽게 긁어 세포 덩어리를 풀어줍니다.그런 다음 분리된 덩어리를 15ml 원추형 튜브로 옮기고 충분한 공급기가 없는 줄기 세포 배양 배지를 추가하여 배아체를 생성하기 위한 세포의 다음 통로를 시딩합니다. 먼저 IPS 세포를 2밀리리터의 DMMF 12로 헹군 다음 750마이크로리터의 아큐테인을 6웰 플레이트의 각 웰에 5-10분 동안 추가합니다. 세포 배양 인큐베이터에서 세포가 분리되기 시작하면 피펫을 사용하여 세포를 단일 세포 현탁액으로 부드럽게 해리한 다음 50ml 원뿔형 튜브로 옮깁니다.DM MF 12 5ml로 플레이트를 헹구고 원뿔형 튜브의 세포와 함께 세척물을 모읍니다. 그런 다음 40마이크로미터 세포 여과기에 세포 현탁액을 통과시켜 잔류 세포 덩어리를 제거합니다. 이제 세포를 스핀 다운하여 Accutane과 resus를 제거하십시오.펠릿을 배아 형성 배지에 0.5 내지 1 곱하기 10 내지 7 밀리리터 농도로 현탁시킨다. trian blue exclusion으로 생존 가능한 세포의 수를 결정한 후, micro well plate의 각 well에 적절한 수의 세포를 추가하여 원하는 배아를 생성합니다. 신체 크기.세포의 균일한 분포를 촉진하기 위해 배양액을 부드럽게 피펫팅한 다음 암석 억제제가 보충된 배아체 형성 배지를 최종 부피 2.0ml로 조정합니다. 보다 부드러운 피펫팅 후 마이크로 웰 세포 배양을 스핀다운하고 세포 배양 인큐베이터에서 플레이트를 24시간 동안 배양합니다. 다음 날, 1ml 마이크로 피펫터를 사용하여 각 마이크로 웰에 피펫 배지를 위아래로 넣어 대부분의 배아체를 채취한 다음 배아체 현탁액을 역40마이크로미터 세포 여과기에 통과시켜 단일 세포를 제거합니다.다음으로, 1ml의 DMMF 12로 마이크로 웰 플레이트를 5회 헹구어 여과기를 통해 세척된 나머지 배아체를 제거합니다. 그런 다음 페트리 접시에서 세포 여과기를 거꾸로 뒤집고 수집된 배아체를 더 많은 배아체 형성 배지로 여과합니다. 수집된 세포를 계수한 후, 배아체 형성 배지에서 웰당 1000개 미만의 배아체로 코팅된 6개의 웰 플레이트에서 배아체를 배아체를 배양하고, 24시간 동안 세포 배양 인큐베이터에서 10마이크로몰 암괴제(micromolar rock inhibitor)를 보충합니다.마지막으로, 배아체 형성 배지를 분화 배지로 교체하여 분화를 시작합니다. 6일, 17일, 29일, 60일에 샘플을 채취하여 적절한 다운스트림 분석을 수행합니다. 12주간의 배양 후 200개의 세포 배아체는 눈에 띄는 색소 침착 없이 성상세포 및 섬유아세포 형태를 발달시키는 반면, 더 큰 배아체는 RPE 마커를 검출하기 위해 이러한 이미지에서 입증된 바와 같이 고전적인 RPE 형태 및 색소 침착의 단층을 발달시키며, MITF 및 ZO 1은 500개의 세포 및 3000개의 세포 배아체에서 유래한 이러한 단백질의 동시 발현을 보여줍니다.이 그래프에서 신경외배엽 마커 PAC six는 유세포 분석을 통해 서로 다른 시점의 다양한 크기의 배아체에서 측정되었습니다. 예를 들어, 3000개의 세포 배아체에서 분석된 세포의 약 50%가 배양 6일차에 PAC 6에 대해 양성이었습니다. 또한 다양한 크기의 배아체에서 RPE 마커 MITF의 팩스 분석을 통해 세포의 20%가 분화 60일째까지 MITF를 발현하는 것으로 나타났습니다.배양된 RPE는 또한 색소와 다각형 형태를 잃고 포장 시 섬유아세포 표현형을 얻을 수 있는 능력이 특징입니다. 예를 들어, 여기에서는 색소를 잃고 섬유아세포 형태를 얻은 새로운 배양 세포가 표시됩니다. 그런 다음 이 세포는 증식하여 합류 시 고전적인 다각형 형태를 회복하고 몇 주 내에 색소 침착을 회복합니다.이 절차를 시도하는 동안 개발 후 IPS RP 콜로니를 적절하게 식별하고 격리하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 기술은 줄기세포 생물학 분야의 연구자들이 정상적인 발생학적 발달을 모방하여 많은 성체 세포 유형에 대한 지시된 분화를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 조직에서 작업하는 가상 실험실은 매우 위험할 수 있으며 이러한 절차를 수행하는 동안 레그 코트, 장갑 및 안경을 착용하는 것과 같은 영향을 항상 받아야 한다는 것을 잊지 마십시오.이 비디오를 시청한 후에는 원하는 크기의 균일한 배아체를 생성하여 삼림 벌채를 I-P-S-R-P E로 유도하고 RPE 세포를 분리 및 농축하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

deriving-retinal-pigment-epithelium-rpe-from-induced-pluripotent-stem

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

마이크로 RNA (miRNA의) 인간 유도 만능 줄기 (IPS) 세포 (IPS-RPE) 태아 RPE에서 파생 된 인간 유도 만능 줄기의 프로파일 (IPS) 세포, 망막 색소 상피 (RPE)를, 비교 하​​였다.

인간 iPS 세포의 마이크로 RNA 발현 프로파일, IP의 유래 망막 색소 상피 세포, 태아의 망막 색소 상피

줄기세포 유래 망막 색소 상피(RPE) 세포는 망막 변성을 위한 세포 기반 치료, 질병 모델링 및 약물 연구를 포함한 여러 응용 분야에 사용할 수 있습니다. 여기에서는 줄기세포에서 RPE를 재현성 있게 유도하기 위한 간단한 프로토콜을 제시합니다.

줄기 세포에서 망막 색소 상피 세포의 효율적인 유도

여기에서 우리는 쥐와 생쥐에 RPE 세포 덩어리를 망막하 주입하기 위한 멀티미디어 형식의 커뮤니티 승인 프로토콜을 제시합니다. 이 접근 방식은 망막 변성의 동물 모델에 이식할 때 이식된 RPE 세포의 구조 가능성, 안전성 프로필 및 생존 능력을 결정하는 데 사용할 수 있습니다.

서스펜션에 망막 색소 상피 세포를 제공하기 위해 설치류에서 망막 주사를 수행

이 프로토콜 pluripotent 줄기 세포에서 망막 색소 상피 세포 (RPE)를 생산 하는 방법을 설명 합니다. 메서드를 사용 하 여 성장 인자와 작은 분자의 조합 분화 줄기 세포의 미 숙 RPE로 14 일에 성숙, 기능 RPE 3 개월 후.

인간의 배아 또는 유도 만능 줄기 세포에서 망막 안료 상피 세포의 급속 한, 감독 차별화

여기 선물이 베어링 환자 파생 된 돌연변이 인간 만능 줄기 세포에서 망막 안료 상피 (RPE) 세포를 분화 하는 프로토콜. 돌연변이 세포 라인 immunoblotting, 면역 형광 검사, 패치 클램프 등 기능 분석에 대 한 사용할 수 있습니다. 이 질병에서 요리 방법 circumvents 네이티브 인간의 RPE 세포를 얻기의 어려움.

차별화, 유지 보수, 및 인간 망막 안료 상피 세포의 분석: BEST1 돌연변이 대 한 접시에 질병 모델

전문된 망막 세포 pluripotent 줄기 세포의 생산은 망막 질환 줄기 세포 기반 치료의 발전에 있는 전환 점을. 현재 종이, 변환, 기본 및 임상 연구에 대 한 organoids 망막과 망막 색소 상피의 효율적인 생성을 위한 간단한 방법을 설명합니다.

정의 된 이종 무료 및 급지대 무료 문화 세대의 인간 iPSC 파생 된 망막 세포 모델에 대 한

망막 조직을 인간의 양수 막과 동물 모델에 이식의 준비 위에 경작 인간의 pluripotent 줄기 세포에서 파생 된 망막 색소 상피 세포의 구성 하는 방법을 설명 합니다.

인간 배아 줄기 세포에서 파생 된 이식 적합 한 망막 색소 상피 조직 공학

자기 조직화 방법을 사용하여 광 수용체의 생성을 크게 증가시킬 수있는 COCO를 첨가 한 프로토콜을 개발합니다.

인간 만능 줄기 세포에서 망막 오가노이드의 지시 유도

여기서 우리는 다양한 인간 다능성 줄기 세포주에 적합한 최적화된 망막 오르간성 유도 시스템을 설명하여 높은 재현성과 효율성을 가진 망막 조직을 생성합니다.

인간 다능성 줄기 세포에서 3D 망막 조직의 파생을 위한 망막 오르간로이드 유도 시스템

이 프로토콜은 hiPSC를 안구 클러스터로 분화하고 부착 및 현탁 배양 시스템을 모두 포함하는 단순화된 배양 조건을 사용하여 신경-망막 오가노이드를 생성하는 효율적인 방법을 설명합니다. RPE 및 각막 상피와 같은 다른 안구 세포 유형도 망막 배양의 성숙한 안구에서 분리할 수 있습니다.

Healthy and Retinal Disease-Specific Human-Induced Pluripotent Stem Cells에서 망막 오가노이드 생성

본 프로토콜은 높은 반복성과 효율성으로 망막 오가노이드의 접착 및 융합을 감소시키는 최적화된 3D 신경 망막 유도 시스템을 설명합니다.

인간 만능 줄기세포에서 신경 망막 생성

배우세요 iPS 세포에서 배아체 크기에 따른 망막 색소 상피 세포(RPE) 분화 효율을 극대화하는 방법을. 미세우물 기술을 활용한 이 프로토콜은 황반변성 등 망막 퇴행성 질환 치료 연구에 활용됩니다.

배아의 몸의 다른 크기에 의해 유도 다 능성 줄기에서 망막 색소 상피 세포 (RPE)를 도출 (IPS) 세포

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