Name: 진정한 검출 마우스 B 리니지 세포를 IgE 항체가 발현 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: 배우세요 마우스 B 세포에서 IgE 항체를 발현하는 진정한 IgE 생성 세포를 트립신 처리와 세포내 염색을 통해 정확하게 검출하는 방법을. 이 프로토콜은 IgE 생물학 연구에 필수적인 기술입니다.

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DRW는 NIH 보조금 AI089972과 AI113217,에 의해 점막 면역학 연구 팀에 의해 지원하고, 버로우즈 웰컴 기금 의료 과학자에 대한 경력 상을 보유하고있다.

참고 : 여기에 설명 된 모든 실험은 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 가이드 라인에 따라했고, 동물 연구 아동 병원 (ARCH), 보스턴, 질량에 의해 승인했다. 시약 1. 준비 <ol><li> 1000 배 스톡 IL-4 : H 2 O 0.1 % 소 혈청 알부민 (BSA)의 20 μg의 / ㎖ 묽은 IL-4 사이토 카인. -20 ℃에서 1.5 ml의 마이크로 원심 분리 튜브 및 상점을 200㎕ 분량 씩 분주한다. </li><li> 1,000 배 안티 CD40 : 4 ℃에서 1.0 ㎎ / ㎖, 가게에서 제조 업체에서 얻습니다. </li><li> B 세포 자극 미디어 : RPMI-1640 배지 425 mL의 추가, 75 갓 해동 소 태아 혈청의 ㎖ (FCS), 1.0 M HEPES 버퍼, 5 ML의 L 글루타민 재고 10 ㎖, 5 ml의 페니실린 : 스트렙토 마이신 주식, 5 2- 머 캅토 에탄올 ml의 최소 필수 중간 비 필수 아미노산 (MEM-NEAA), 3.5 μL. 일주일에 최대 4 ℃에서 둡니다. IL-4 (20 NG / ㎖) 및 항 CD40 (1.0 ㎍ / ㎖)에 사용 직전에 추가단지 필요한 미디어의 볼륨. </li><li> 2 % FCS-FACS 버퍼 : 1X PBS의 490 ml의 FCS의 10 ML을 추가합니다. 4 ℃에서 보관하십시오. </li><li> 배 트립신 EDTA 용액 : 1X PBS 20ml에 10 배 트립신 EDTA 원액 (5.0 g 트립신, 리터 당 2.0 g의 EDTA) 5 mL를 희석. 저장 트립신 EDTA는 2 배에서 4 ° C에서 분주 작업. 사용하기 전에 실온으로 가온시킨다. </li><li> 태아 혈청은 : 최대 2 주 동안 4 ℃에서 해동 FCS를 유지합니다. 세포질 염색 절차 전에 얼음 15 분에 놓습니다. </li><li> 중성 완충 포르말린 : 10 % 포르말린 용액 (3.7 % 파라 포름 알데히드)를 준비한다. 포르말린은 독성이 적절한 PPE를 착용하는 동안 따라서 실험실 흄 후드를 처리 할 수​​ 있습니다. 화학 스토리지 캐비닛을 실온에서 보관 포르말린. </li><li> 메탄올 : -20 ° C에서 보관 절대 메탄올 (100 %)의 세포 투과 가능하게 할 준비가 될 때까지. 그 메탄올이 가연성 적절한 냉동실에 보관해야합니다. </li></ol> 2.정제 된 B 세포의 활성화 <ol><li> 갓 수확 된 마우스의 비장에서 부드럽게 3 ㎖ 주사기의 플런저와 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 장기를 눌러 단일 세포 현탁액을 제조. 15 ml의 원추형 원심 분리 관에서, 4 ℃에서 5 분 동안 300 XG에서 1X PBS 10ml에 세포를 수집하고 원심 분리기. </li><li> 5 분 동안 적혈구 용혈 완충액 1 ㎖에 재현 탁 상등액과 펠렛을 따르다. 5 분 동안 300 XG에서 1X PBS 13.5 ml의 원심으로 중화. </li><li> (선택 사항) 자기 (磁 气) 제조업체의 지침에 따라 MACS 정화 프로토콜 다음, 구슬을 방지 CD45R (B220)를 사용하여 B 세포를 표지 된 구분합니다. </li><li> 37 ° C에서 IL-4 (20 NG / ml) 및 오일에 대한 항 CD40 (1.0 ㎍ / ㎖) 함유 가온 B 세포 자극 배지에서 1.0 × 106 세포 / ml으로 정제 된 B 세포를 자극한다. 6 웰 배양 판 (4 ml의 각)의 두 우물로 나누어 문화의 8 ml로 시작합니다. </li><li> cultu 확인1.0 × 106 세포 / ml로 유지하기 위해 매일 재. 다른 웰로 분할 신선한 IL-4와 항 CD40을 함유하는 B 세포 자극 매체 배양을 희석하여 농도를 조정한다. </li></ol> 3. 트립신, 고정 및 투과성으로 <ol><li> 트립신 <ol><li> 5 분 300 XG에, 15 ML 원뿔 튜브에 원심 분리기를 배양 세포의 최대 1.0 × 10 (7)를 수집, 상층 액을 가만히 따르다. </li><li> 셀 수집 미디어에서 잔류 단백질을 제거하기 위해 PBS의 10 ml로 세척 할 것. 원심 분리 단계를 반복하여 상층 액을 가만히 따르다. </li><li> (약 100 μL)을 경사 분리 한 후 잔류 체적의 세포 펠렛을 재현 탁. </li><li> 조심스럽게 세포에 실온 0.1 % (2 배) 트립신 EDTA의 800 μl를 추가합니다. 원추형 튜브의 측면 아래로 45 ° 각도로 천천히 디스펜스. </li><li> 튜브를 닫고 액체가 관 5-6 시간의 길이를 따라 실행되도록 튜브를 기울여 부드럽게 혼합의. 힘줄, 백색 침전물은 용액 중에 형성 할 수있다. 분 아래에 트립신 시간을 제한합니다. </li><li> 감기 FCS 1ml의 트립신 처리로 반응을 켄칭. 즉시 차가운 PBS 10 ㎖를 첨가하여 희석 FCS. </li><li> 4 ° C에서 5 분 300 XG에 원심 분리 한 후 상층 액을 가만히 따르다과 얼음에 튜브를 반환합니다. </li></ol></li><li> 정착 <ol><li> 경사 분리 후 잔류 체적의 세포를 재현 탁. 필요한 경우, 차가운 PBS 100 μL에 볼륨을 가져. </li><li> 흄 후드에서, 세포에 10 % 중성 완충 포르말린 용액 800 μL를 추가하고 상하 피펫. 튜브는 포르말린 첨가시 따뜻하게. 10 분 동안 37 ℃에서 배양한다. </li></ol></li><li> 투과성으로 <ol><li> 부드러운 흔들림 속도로 벤치 탑 와류 믹서를 설정합니다. </li><li> 10 ㎖의 혈청 학적 피펫으로 추운 (-20 ° C) 메탄올 9 ml에 그립니다. </li><li> 와류 믹서를 통해 세포를 포함하는 튜브를 잡고 부드럽게 흔들리는 시작g 세포. </li><li> 튜브는 여전히 떨고 메탄올을 지속적으로 혼합되는 동안이 세포에 적가 쓰러 튜브에 냉 메탄올을 추가합니다. 메탄올 2ml의 제 후에 분배 속도가 느린 스트림으로 증가 될 수있다. </li><li> 30 분 투과성으로를 완료 할 때 튜브가 얼음에 앉아 보자. 대안 적으로, 세포는 개월까지 -20 ℃에서 저장 될 수있다. </li></ol></li></ol> 의 IgG1과 IgE의 클래스 전환 4. 형광 염색 <ol><li> 원심 분리기에서 5 분 동안 300 XG에 샘플은 메탄올 용액 캔트. 백색 침전물을 세포 펠릿있다. </li><li> 5 분 세포를 씻어 300 XG에서 객실 PBS 1X 온도와 원심 분리기 10 ML을 추가합니다. 한 번 반복합니다. 참고 : 실온 PBS와 펠렛을 세척하는 단계 4.1 이후에 형성 할 수있다 여분의 침전물을 용해. </li><li> 2 % FCS-FACS 완충액 10 mL로 추가 세척을 수행합니다. </li><li> 바닥 판 라운드 96 웰에 샘플을 배포5 분 동안 원심 분리기 (300) XG. 상층 액을 가만히 따르다과 얼음에 접시를 넣어. </li><li> 다음과 같은 항체를 희석 잘 2 % FCS-FACS 버퍼의 60 μL에 얼룩 : 안티 IgM 항체 RPE / Cy7, 1 : 200, 안티의 IgG1 PE, 1 : 600, 안티 IgE에 FITC, 1 : 100, 안티 - CD45R (B220)를 PerCP-Cy5.5, 1 : 200 </li><li> 5 분 염색 한 후, 300 x g에서 5 분 동안 2 % FCS-FACS 완충액 원심 150 μL로 플레이트를 세척한다. </li><li> 5 ML의 FACS 튜브에 40 μm의 나일론 셀 스트레이너를 통해 2 % FCS-FACS 버퍼와 피펫 400 μL에 재현 탁. </li></ol> 5. 다음 게이팅 전략을 사용합니다 : <ol><li> FSC / SSC 플롯 (그림 1)에있는 발파 림프구 인구에서 CD45R (B220) 양성 세포를 분리합니다. </li><li> B220 양성 세포에서 해당 인구를 나타 내기 위해 IgE 항체와의 IgG1 플롯을 사용합니다. </li></ol>

<ol><li>Chaudhuri, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+immunoglobulin+heavy+chain+class+switch+recombination+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Evolution of the immunoglobulin heavy chain class switch recombination mechanism.</a> Advances in immunology. 94, 157-214 (2007).</li>
<li>Gould, H. J., Sutton, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgE+in+allergy+and+asthma+today%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">IgE in allergy and asthma today.</a> Nature reviews. Immunology. 8, 205-217 (2008).</li>
<li>Winter, W. E., Hardt, N. S., Fuhrman, S. Immunoglobulin E. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 124 (9), 1382-1385 (2000).</li>
<li>Ozcan, E., Notarangelo, L. D., Geha, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+immune+deficiencies+with+aberrant+IgE+production%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Primary immune deficiencies with aberrant IgE production.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 122, 1054-1062 (2008).</li>
<li>Bacharier, L. B., Geha, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+IgE+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+allergy+and+clinical+immunology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of IgE regulation.</a> The Journal of allergy and clinical immunology. 105, 547-558 (2000).</li>
<li>Yokota, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+species+of+human+Fc+epsilon+receptor+II+%28Fc+epsilon+RII%2FCD23%29%3A+tissue-specific+and+IL-4-specific+regulation+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Two species of human Fc epsilon receptor II (Fc epsilon RII/CD23): tissue-specific and IL-4-specific regulation of gene expression.</a> Cell. 55 (4), 611-618 (1988).</li>
<li>Boboila, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+end-joining+catalyzes+class+switch+recombination+in+the+absence+of+both+Ku70+and+DNA+ligase+4%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Alternative end-joining catalyzes class switch recombination in the absence of both Ku70 and DNA ligase 4.</a> The Journal of experimental medicine. 207, 417-427 (2010).</li>
<li>Nimmerjahn, F., Ravetch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fcgamma+receptors+as+regulators+of+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Fcgamma receptors as regulators of immune responses.</a> Nature reviews. Immunology. 8 (1), 34-47 (2008).</li>
<li>Callen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((53BP1+mediates+productive+and+mutagenic+DNA+repair+through+distinct+phosphoprotein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">53BP1 mediates productive and mutagenic DNA repair through distinct phosphoprotein interactions.</a> Cell. 153 (6), 153-1280 (2013).</li>
<li>Wesemann, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+IgH+isotype-switched+B+cells+to+functional-grade+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Reprogramming IgH isotype-switched B cells to functional-grade induced pluripotent stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13745-13750 (2012).</li>
<li>Wesemann, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immature+B+cells+preferentially+switch+to+IgE+with+increased+direct+S%C2%B5+to+S%CE%B5+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Immature B cells preferentially switch to IgE with increased direct Sµ to Sε recombination.</a> The Journal of experimental medicine. 208 (13), 2733-2746 (2011).</li>
<li>Zarrin, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionarily+conserved+target+motif+for+immunoglobulin+class-switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">An evolutionarily conserved target motif for immunoglobulin class-switch recombination.</a> Nature immunology. 5, 1275-1281 (2004).</li>
<li>Fan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+class-specific+polyclonal+antibody-based+indirect+competitive+ELISA+for+detecting+fluoroquinolone+residues+in+milk%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Zhejiang+University.+Science.+B%22%5BJournal%5D)">Development of a class-specific polyclonal antibody-based indirect competitive ELISA for detecting fluoroquinolone residues in milk.</a> Journal of Zhejiang University. Science. B. 13 (7), 545-554 (2012).</li>
<li>Perez, O., Krutzik, P., Nolan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+kinase+signaling+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of kinase signaling cascades.</a> Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 263, Clifton, NJ. 67-94 (2004).</li>
<li>Jamur, M., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fixatives+for+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">Cell fixatives for immunostaining.</a> Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 588, 55-61 (2010).</li>
<li>Ishizaka, T., Ishizaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+passive+sensitization.+IV.+Dissociation+of+IgE+molecules+from+basophil+receptors+at+acid+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology+%28Baltimore%2C+MD.+%3A+1950%29%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of passive sensitization. IV. Dissociation of IgE molecules from basophil receptors at acid pH.</a> Journal of immunology (Baltimore, MD. : 1950). 112 (3), 1078-1084 (1950).</li>
<li>Erazo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+Maturation+Program+of+the+IgE+Response+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Unique Maturation Program of the IgE Response In Vivo.</a> Immunity. 26, 191-203 (2007).</li>
<li>Xiong, H., Dolpady, J., Wabl, M., Curotto de Lafaille, M. A., Lafaille, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+class+switching+is+required+for+the+generation+of+high+affinity+IgE+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Sequential class switching is required for the generation of high affinity IgE antibodies.</a> Journal of Experimental Medicine. 209, 353-364 (2012).</li>
<li>Yang, Z., Sullivan, B., Allen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+in+vivo+detection+reveals+that+IgE%28%2B%29+B+cells+are+restrained+by+an+intrinsic+cell+fate+predisposition%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Fluorescent in vivo detection reveals that IgE(+) B cells are restrained by an intrinsic cell fate predisposition.</a> Immunity. 36 (5), 857-872 (2012).</li>
<li>Berkowska, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+IgE%28%2B%29+B+cells+are+derived+from+T+cell-dependent+and+T+cell-independent+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+allergy+and+clinical+immunology%22%5BJournal%5D)">Human IgE(+) B cells are derived from T cell-dependent and T cell-independent pathways.</a> The Journal of allergy and clinical immunology. , (2014).</li>
<li>He, J. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distinctive+germinal+center+phase+of+IgE%2B+B+lymphocytes+limits+their+contribution+to+the+classical+memory+response%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">The distinctive germinal center phase of IgE+ B lymphocytes limits their contribution to the classical memory response.</a> The Journal of experimental medicine. 210 (12), 2755-2771 (2013).</li>
<li>Keegan, A., Fratazzi, C., Shopes, B., Baird, B., Conrad, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+new+rat+anti-mouse+IgE+monoclonals+and+their+use+along+with+chimeric+IgE+to+further+define+the+site+that+interacts+with+Fc+epsilon+RII+and+Fc+epsilon+RI%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+immunology%22%5BJournal%5D)">Characterization of new rat anti-mouse IgE monoclonals and their use along with chimeric IgE to further define the site that interacts with Fc epsilon RII and Fc epsilon RI.</a> Molecular immunology. 28 (10), 1149-1154 (1991).</li>
</ol>

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항 CD40 및 IL-4와 문화에 마우스 비장 B 세포의 자극의 IgG1과 IgE의 5 T 도우미 2 형 (T H 2) 상호 작용을 격려 클래스 전환을 시뮬레이션합니다. B 세포는 비장 세포 총 12 또는 정제 된 비장의 B 세포 (11)의 맥락에서 CSR을 위해 활성화 될 수있다. 프로토콜 (단계 2.3)에서 설명한 바와 같이, B 세포 농축은 선택 사항이며, 그것은 유익 할 것이다 있는지 확인 실험자의 판단이다. CD45R (B220)를 사용하여 B 세포의 양성 자성 비드 분리가 여기에 사용된다 -labeled. 분리 후, B 세포 농도를 적절한 항체 및 사이토킨 자극에 1.0 × 106 세포 / ml로 조절 될 수 있도록하여 FACS 세포 순도를 확인할 것을 권장한다. 또한이 냉동 / 해동 사이클을 거쳤다 IL-4 단백질 활성을 감소 수도 있음에 유의해야한다. 이전의 고정 ...

마우스와 인간 면역 글로불린 중쇄 (IGH) 클래스 스위치 재조합 (CSR) 중, 고등학교의는 일정한 지역 엑손 (Cμ가) 삭제 및 다운 스트림 일정한 지역 엑손의 여러 세트 중 하나 (C의 H s의) (예를 들어 Cγ로 대체 μ IG 다른 클래스 (예를 들면 IgG를, IgE 항체, 또는 적 IgA)의 제조에 대한 IgM 항체의 생산에서 발생 Cε 스위치 및 Cα). CSR은 C H의 1의 각 세트 5 &#39;위치 1-10킬로바이트 시퀀스는 스위치 (S) 지역 내에서 발생합니다. 활성화 - 유도 시티 딘 데 아미나 제 (AID) 효소는 시티 딘의 탈 아미노 활동을 통해 CSR을 시작합니다. IgE 항체는 알레르기 질환 2의 주요 중재자 및 IgE의 생산 및 아토피 질환에 대한 새로운 치료 방법으로 문을 열 수 있습니다 규제 방법에 대한 이해이다. 마우스와 인간에서의 IgE는 가장 엄격하게 규제 IG 이소 타입이다. IgE 항체는 일반적으로 팀의 수준 수천에서 감지ES 다른 IGH 미만 3 아이소 타입이지만 높은 질환 상태 4에서 증가 될 수있다. 그러나 IgE 항체에 CSR은 불완전하게 이해된다. B 세포의 체외 활성화는 IL-4 항 CD40 또는 LPS 중 하나와 조합은, 모두의 IgG1과 IgE의 5 CSR을 유도하여. 활성화 된 B 세포를 용해 IgE 항체가 CSR 후 문화 분비 결합 선호도가 낮은의 IgE 수용체 FcεRII / CD23 2,6-을 표현한다. 유동 세포 계측법으로 분석 할 때 따라서, 수용체에 결합 된 IgE의 얼룩 B 세포는 유사 내생 적 IgE 항체 (7)를 발현하는 세포를 B로. 그것은 그 마우스 B를 알려져 있지만 세포는의 IgG1에 클래스 전환의 측정에 방해가 나타나지 않는 우리의 경험에서 선호도가 낮은 IgG의 수용체 FcγRIIB1 (CD32) 8을 표현한다. 배양에서 B 세포 활성화 후 IgE의 전환을 측정하는 경우에는, 표면 - 결합 특이성 IgE 항체는 분석을 가릴 수있다. 공통 염색 방법과 비 IgE 항체 발현 세포가 IgE에 대해 긍정적으로 염색. 여기에 설명 된 마우스 (9)로부터 참의 IgE 발현 B 세포를 CSR 세이를 수행하고 검출하는데 이용 된 전략 - 11. 트립신으로 활성화 된 B 세포의 치료는 일반적인 실험실 시약은 단백질을 소화, 세포 친화 및 막 모두 결합 된 표면의 IgE는 제거합니다. 세포질 IgE에 대한 후속 투과성으로 염색 따라서 진정한 IgE 항체 생산 세포를 보여준다.

<table><tbody><tr><td>안티 마우스 IgE FITC</td><td>BD Pharmingen 553415</td><td></td><td>클론 R35-72</td></tr><tr><td>쥐 안티 마우스 IgG1 PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>550083</td><td>클론 A85-1</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>BDH</td><td>BDH1135-4LP</td><td>-20 &deg에서 유지; C</td></tr><tr><td>팔콘 셀 스트레이너 40 &마이크로; m 나일론</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>팔콘 셀 스트레이너 70 &마이크로; m 나일론</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Hu/Mo CD45R(B220) PerCP-Cy5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-4052-82</td><td>클론 RA3-6B2</td></tr><tr><td>안티 마우스/쥐 CD40</td><td>eBioscience</td><td>16-0402-85</td><td>클론 HM40-3</td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>MEM-NEAA (100x)</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 (10x)</td><td>Lifetechnologies (Corning)</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>MACS CD45R (B220) 마이크로비즈&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-049-501</td><td></td></tr><tr><td>MACS 정제 컬럼</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>IL-4</td><td>PeproTech</td><td>214-14</td><td>물 또는 0.1% BSA</td></tr><tr><td>포르말린 용액, 중성 완충, 10%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>트립신-EDTA 용액(10x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4174-100 ml</td><td>5.0 g 트립신, 2.0 g EDTA&#8226; 0.9% NaCl</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td> 리터당 4Na <td>시그마 알드리치</td><td>P0781-100 ml</td><td>10,000 U 페니실린; 10 mg/ml 스트렙토마이신(100x</td></tr><tr><td>)L-글루타민 200 mM</td><td>시그마 알드리치</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올(99%)</td><td>시그마 알드리치</td><td>M6250-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>적혈구 용해 완충액</td><td>시그마 알드리치</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>쥐 안티 마우스 IgM RPE/Cy7</td><td>SouthernBiotech</td><td>1140-17</td><td>클론 1B4B1</td></tr><tr><td>HyClone 태아 송아지 혈청</td><td>Thermo</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>B 세포 자극 매체</td><td></td><td></td><td>B 세포 자극 매체는 RPMI와 태아 송아지 혈청 (15%), 20 mM HEPES, 1x MEM-NEAA, 2.0 mM L-글루타민,&nbsp; 1x 페니실린-스트렙토마이신 (페니실린: 100 U/ml, 스트렙토마이신: 100 &마이크로; g/ml), 베타-메르캅토에탄올(7 &micro; L/L), IL-4 (20 ng/ml) 및 anti-CD40 (1 &micro; g/ml)</td></tr></tbody></table>

진정한 검출 마우스 b 리니지 세포를 ige 항체가 발현

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

B 림프구 면역 글로불린 중쇄 (IGH) 클래스 스위치 재조합 (CSR)은 처음에 IgM 항체 등의 IgA, IgE 항체와 IgG의 다른 고등학교의 이소 타입으로 전환 표현 된 것을 특징으로하는 과정이다. 시험 관내 IGH CSR의 측정은 분자 세포 면역학의 측면 DNA 재조합 및 수리에 이르기까지 생물학적 공정 수의 연구를위한 중요한 방법이다. 관내 CSR 분석은 활성화 된 B 세포에 대한 유세포 측정면 IG 표현식을 수반한다. 의 IgA와 IgG의 서브 클래스의 측정이 간단하지만,이 방법으로 IgE 항체의 측정으로 인해 용해 IgE 항체가 FcεRII에 결합에 문제가있다 / CD23 활성화 B 세포의 표면에 발현. 여기에서 우리는 문화에 CSR을받은 마우스 B 세포를 IgE 항체가 생산의 정확한 측정을위한 고유 한 절차를 설명합니다. 방법 B에 의해 CY 계통 세포의 IgE가 생산의 검출을 허용 세포 표면에 대한 IgE CD23 복합체 트립신 - 매개 절단에 기초toplasmic 염색. 이 절차에 대한 IgE의 CSR 유세포 분석을위한 편리한 해결책을 제공한다.

이 절차가 성공적으로 마우스 B 세포에서 IgE 항체에 CSR을 연구하기 위해 구현되었습니다. 앞서 설명한 바와 같이 11 CSR 측정에서 효율을 입증하기 위해, 우리는 항 CD40 및 IL-4와 마우스 비장 B 세포를 자극. 자극 5 일 후, 세포를 수거하고, 프로토콜 형광 표지 IgM이, IgG1에, IgE 항체, 및 B220 (CD45R) 항체 상술과 염색을 이용하여 처리 하였다. (도 1), + 세포의 IgE에 명확한 인구 깔끔하게 트립신 처리 (도 2a)없이 판별 될 수 블라스팅 림프구 게이트. 그러나, 고정 및 투과성으로 이전에 세포의 트립신으로 인해 표면 바인딩 IgE 항체의 제거에 IgE 항체 생산 세포 (그림 2b)의 분리를 할 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/fi...

B 세포 표면의 Fc 수용체에 결합된 세포구성 IgE 분자로 인해 마우스의 클래스 스위치 재조합에 대한 체외 분석은 어렵습니다. 세포질 형광 염색을 위한 고정 및 투과화 전에 표면 결합 IgE의 트립신 매개 절단을 사용하여 IgE를 검출하는 방법을 설명합니다.

진정한 검출 마우스 B 리니지 세포를 IgE 항체가 발현

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

다음 실험의 전반적인 목표는 B 세포를 발현하는 실제 IgE와 IgE를 분비하는 다른 IgE 동형을 발현하는 B 세포를 구별하는 것입니다. in vitro class switching assay는 B cell surface protein에 결합하여 IgE로의 class switching을 측정할 수 있는 능력을 모호하게 만듭니다. 이 목표는 내인성으로 생성된 세포 내 면역글로불린 분자를 그대로 유지하면서 세포 표면 단백질을 특이적으로 절단하지 않는 트립신을 사용하여 분석하기 전에 수용체 결합 IgE 분자를 먼저 제거함으로써 달성됩니다.둘째, 세포 내 단백질은 B 세포를 포르민으로 고정하고 세포를 메탄올로 퍼메하여 노출됩니다. 다음으로, 세포는 형광 표지된 항체로 염색되어 세포 내 면역글로불린을 드러냅니다. 그 결과, 뚜렷한 IgE 양성 B세포 집단이 나타났습니다.유세포 분석을 기반으로 트립신을 사용하는 경우, IgE 생성 세포를 검출하기 어렵기 때문에 IgE 생물학에 대한 연구가 제한적이었습니다. 이 방법은 실험실에서 이 흥미로운 분자에 대한 이해를 가속화하기 위해 쉽게 채택할 수 있는 접근 가능한 솔루션을 제공합니다. 이 기술은 수용체 결합 IgE의 영향을 제거하는 기존 방법보다 유리합니다.예를 들어, 항 IgE 항체로 표면 IgE를 차단하는 것보다 비용이 적게 들고 산성 세척 처리보다 관대합니다. 이 방법은 마우스 B 세포 클래스 분석에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 사실 염색 전에 트립신을 사용한 IgE 처리로 전환하는 것은 갓 채취한 마우스 비장에서 표면 단백질을 제거해야 하는 다른 프로토콜에도 적용될 수 있습니다. 단일 세포 현탁액을 준비합니다.3밀리리터 주사기의 플런저를 사용하여 70미크론 세포 여과기를 통해 장기를 부드럽게 누릅니다. 10mL의 XPBS 1개가 들어 있는 15ml 원뿔형 원심분리기 튜브에 세포를 수집합니다. 다음으로 300Gs에서 섭씨 4도에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다.supra natant를 디캔팅하고 펠릿을 1ml의 적혈구 용해 완충액에 다시 현탁시킵니다. 용해 반응을 5분 동안 그대로 두었다가 13.5ml의 XPBS로 중화합니다. 그런 다음 300Gs에서 5분 동안 세포를 다시 원심분리하고 펠릿을 잔류 부피에 다시 현탁시킵니다.이제 IL 4 및 anti CD 40을 포함하는 따뜻한 B세포 자극 배지를 세포에 추가합니다. 6웰 배양판의 2웰로 나누어진 8ml 배양으로 시작하여 5일 동안 섭씨 37도에서 세포를 자극합니다. 세포를 밀리리터당 100만 개로 유지하기 위해 매일 배양액을 확인하십시오.배양액을 다른 웰로 분할하고 B 세포 자극으로 희석하여 농도를 조정합니다. 신선한 IL 4 및 안티 CD 40을 포함하는 미디어. 15ml 원뿔형 튜브에 자극된 B 세포를 최대 1,000만 개까지 수집하는 것으로 시작합니다.그런 다음 300Gs에서 5분 동안 원심분리하고 상등액을 디캔팅하여 세포 수집 배지에서 잔류 단백질을 제거합니다. B 세포를 10 밀리리터의 PBS로 세척 한 다음 또 다른 원심 분리 및 스내트의 경사 제거를 수행합니다.디캔팅 후, 약 100 마이크로 리터의 잔류 부피에 세포 펠렛을 다시 현탁시키고 EDTA에 800 마이크로 리터의 실온 0.1 % 트립을 조심스럽게 첨가합니다. 튜브의 측벽을 따라 용액을 천천히 추가합니다.경사를 추가한 다음 튜브에 캡을 씌우고 튜브의 길이를 따라 액체를 부드럽게 섞습니다. 5-6 번 끈적끈적한 흰색 침전물이 1 분 이내에 용액에 형성 될 수 있습니다. 1ml의 차가운 FCS로 반응을 담금질합니다.세포를 얼음 위에 두십시오. 이제 그들은 여전히 살아 있으며 새로운 표면 단백질을 발현할 수 있습니다. 즉시 10ml의 차가운 PBS를 첨가하여 FCS를 희석하십시오.피펫으로 떠다니는 파편을 제거하십시오. 섭씨 4도에서 셀을 스핀다운합니다. 즉시 스내트를 디캔팅하고 잔류 부피에 세포를 다시 현탁시킵니다.필요한 경우, 차가운 PBS로 부피를 최대 100 마이크로 리터까지 가져 오고, 800 마이크로 리터의 10 % 중성 완충 포르민 피펫에서 흄 후드에서 빠르게 진행하고, 혼합물이 튜브를 위아래로 가열하면 혼합물이 예열되기 시작합니다. 한편, 부드러운 쉐이킹 속도로 벤치탑 와류 믹서를 설정하고 메탄올을 섭씨 영하 20도까지 냉각하여 사용할 수 있도록 준비합니다. 세포가 배양이 완료되면.9ml의 메탄올을 혈청학적 피펫에 주입합니다. 그런 다음 뚜껑을 풀고 메탄올을 적음으로 추가하면서 튜브를 부드럽게 소용돌이칩니다. 2 밀리리터의 메탄올을 분배 한 후 느린 스트림으로 속도를 높입니다.이제 튜브를 얼음 위에 30분 동안 두어 세포를 침투시킵니다. 또는 셀을 최대 한 달 동안 섭씨 영하 20도에서 보관할 수 있습니다. 먼저 퍼메 세포를 원심분리하고 메탄올을 디캔팅하여 염색 절차를 시작합니다.흰색 침전물은 세포와 함께 펠릿 할 수 있습니다. 그런 다음 10ml의 실온에서 XPBS 원심분리 및 디캔팅을 혼합하여 세포를 세척합니다. 이 세척 단계를 두 번 수행하십시오.그런 다음 10ml의 2%FCS 팩스로 추가 세척을 수행하고 버퍼링하고 다시 일시 중단합니다. 잔류 부피의 펠릿은 샘플을 96웰 원형 바닥 플레이트의 한 웰에 로드하여 진행됩니다. 많은 샘플은 일반적으로 병렬로 처리됩니다.플레이트 스피너를 사용하여 20-50 마이크로 리터를 로드하고 300Gs에서 5 분 동안 셀을 원심 분리하십시오. 그런 다음 스내트의 디캔팅을 하고 접시를 얼음 위에 놓습니다. 이제 세포를 각 웰에 염색하고 4개의 서로 다른 항체를 포함하는 60마이크로리터의 2%FCS 팩스 버퍼를 추가합니다.염색 후 5분 동안 세포가 염색 부위에서 배양하도록 합니다. 150마이크로리터의 2%FCS 팩스 버퍼 털을 추가하여 세포를 세척합니다. 그런 다음 이전과 같이 플레이트를 원심분리한 다음 용액을 디캔팅하고 세포를 현탁액으로 재생합니다.400마이크로리터의 2%FCS 팩스 버퍼를 사용합니다. 이제 40미크론 나일론 셀 스트레이너를 통해 셀을 파이펫으로 연결하여 팩스 게이트용 5밀리리터 팩스 튜브에 넣습니다. 세포는 먼저 F-S-C-S-S-C 플롯에서 블라스팅 림프구 집단에서 2 개의 20 양성 세포로도 알려진 CD 45 R 양성 세포를 분리 한 다음 B에서 2 개의 20 양성 세포를 분리한다.이 절차를 통해 IgE 및 IgG 1 플롯을 사용하여 해당 모집단을 표시합니다. IgE에 대한 클래스 스위치 재조합은 블라스팅 림프구를 기반으로 한 게이팅 전략을 사용하여 마우스 B 세포에서 연구되었습니다. IgE 양성 세포의 명확한 집단은 고정 및 투과 전에 세포의 트립신이 없으면 명확하게 구별할 수 없었으며, 표면 결합 IgE의 제거로 인해 IgE 생성 세포를 분리할 수 있었습니다.이 염색 기술은 적절하게 수행되면 약 한 시간 안에 완료 할 수 있습니다. 포르말린과 메탄올을 사용하는 것은 위험할 수 있습니다. 따라서 이 절차를 수행하는 동안 항상 fuma를 사용해야 하며 적절한 개인 보호 장비를 항상 사용해야 합니다.

detection-of-true-ige-expressing-mouse-b-lineage-cells

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 절차를 자극시 IL - 17 분비 적극적으로 마우스 TH17의 leukocytes의 탐지 및 격리에 대해 설명합니다.

가능한 마우스 IL - 17 - Secreting의 T 세포 탐지 및 격리

피부염의 herpetiformis (DH)는 이가와 표피 transglutaminase (eTG) 사이의 면역 반응을 특징으로 만성 염증성 조건입니다. DH는 글루텐에 민감한 및 / 또는 복강 환자의 아주 작은 부분에 개발하고 있습니다. 본 연구의 결과는 DH도 idiopatic 피부염의 증상으로 붉은 털원숭이 원숭이 호스트에서 개발할 수 있음을 나타냅니다.

의 드문 경우에 이가와 조직 Transglutaminase이 항체에 의해 표피 Transglutaminase의 인식 붉은 털원숭이 피부염

이 비디오는 쥐의 비장에서 IFN-γ(in situ interferon-gamma) 분비를 시각화하는 이미징 방법을 보여줍니다. 세균 감염 및 T 세포 및 자연 살해 세포 내부에 IFN-γ 축적 유도 후 비장은 마우스에서 채취됩니다. 조직 절편을 얻으면 세포 내부의 IFN-γ을 시각화하기 위해 면역염색을 수행합니다.

쥐 림프구 기관에서 인터페론-감마 분비 식별을 위한 분석

여기서는 서로 다른 마우스 조직 내에서 IL-22 생성 세포를 시각화하기 위한 형질전환 리포터 마우스 모델을 설명합니다. 이 방법은 마우스에서 다른 사이토카인 또는 비서 단백질의 위치를 추적하는 데 사용할 수 있습니다.

기자 마우스를 사용하여 IL-22 발현 림프구의 시각화

이 종이에 우리는 ELISA를 사용 하 여 마우스에서 T-종속 및 T-독립 면역 글로불린 (Ig) isotype 응답 하는 프로토콜을 설명 합니다. 이 방법은 단독으로 사용 하거나 흐름 함께에서 cytometry 쥐 T-종속 및 T 독립적인 항 원 면역 다음에 Ig 중재 하는 B 세포 isotype 응답 차이 식별 하는 연구를 수 있게 됩니다.

Thymus 종속 및 독립 Thymus 면역 글로불린 Isotype 반응 효소 연결 된 Immunosorbent 분석 결과 사용 하 여 마우스의 특성

이 연구에서는 선물이 고 림프 톨의 격리에 대 한 효율적인 프로토콜 Peyer의 패치 (PPs), 사용할 수 있습니다 이후 follicular T의 흐름 cytometric 학문 뿐만 아니라 vivo에서 그리고 생체 외에서 기능적 분석 실험에서 도우미 고 어린 싹 센터 B 세포입니다.

체액 성 면역의 해결 핵심 선수: 고급 및 Murine 파이어의 패치에서 림프 구 격리 프로토콜 최적화

여기서, 우리는 뮤린 이차 림프기관에서 사이토카인 인터페론 감마를 분비하는 세포의 내부 국소화를 가시화하는 간단한 공초점 이미징 방법을 기술한다. 이 프로토콜은 다양한 조직에서 다른 사이토카인의 시각화를 위해 확장될 수 있다.

리스테리아 단세포 유전자 감염 다음 마우스 비장에서 시투 인터페론 감마 생산의 이미징

우리는 거꾸로 회전 디스크 공초점 현미경 검사법에 의해 뮤린 소장의 내장 영상을 사용하여 GFP 표지된 γδ IELs를 구상하는 방법을 기술합니다. 이 기술은 최대 4 시간 동안 점막 내의 살아있는 세포의 추적을 가능하게하고 장 내 면역 상피 상호 작용의 다양한 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

뮤린 소장에서 상피 내 림프구의 활력 영상

이 논문은 인플루엔자 바이러스 감염의 마우스 모형에 있는 Tfh 및 GC B 반응을 평가하는 프로토콜을 기술합니다.

인플루엔자 A 바이러스 감염 중 T 여포 도우미 세포 및 발아 센터 반응 평가

제2형 염증과 관련된 그룹 2 선천성 림프 세포(ILC2s)는 주로 기생충 감염, 알레르기 질환, 대사 항상성 및 조직 복구에 대한 반응에 참여합니다. 이 연구에서는 쥐의 코 점막에서 ILC2를 분리하고 CD226의 발현을 감지하는 절차를 입증합니다.

CD226의 발현을 검출하기 위해 마우스 비강 점막에서 그룹 2 선천성 림프 세포 분리

배우세요 마우스 B 세포에서 IgE 항체를 발현하는 진정한 IgE 생성 세포를 트립신 처리와 세포내 염색을 통해 정확하게 검출하는 방법을. 이 프로토콜은 IgE 생물학 연구에 필수적인 기술입니다.

진정한 검출 마우스 B 리니지 세포를 IgE 항체가 발현

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