Name: TIRFM과 pH 민감성 GFP - 프로브는 SH-SY5Y 신경 모세포종 세포에서 신경 전달 물질 소포 역학을 평가하기 : 세포 이미징 및 데이터 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: 학습하세요 TIRFM과 pH 민감성 GFP 프로브를 사용하여 SH-SY5Y 신경 모세포종 세포에서 신경 전달 물질 소포 역학을 평가하는 방법을 배우세요. 이 기법은 시냅스 전달 메커니즘 연구에 필수적인 고해상도 이미징을 제공합니다.

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저자는 엘리 아나 디 카이 라노 (박사후)과 스테파니 모레티 (박사 교제)에 지원 Università 글리 스투 디 밀라노을 인정하고 싶습니다. 이 작품은 CP에 대학 연​​구 프로그램 PUR에 의해 지원되었다 pHluorin가 구성 박사 ​​Dotti 프란체스코 데이터 분석 지원 및 기술 지원에 대한 실비아 Marsicano에 대해 우리는 교수 제레미 M. 헨리, 생화학 학교, 브리스톨, 영국의 대학에 감사의 말씀을 전합니다.

1. 세포 배양 및 형질 <ol><li> SH-SY5Y 세포 배양 주 : 실험 SY5Y 인간 신경 아세포종 SH- (ATCC # CRL-2266) (15)를 사용하여 수행되었다. SH-SY5Y 세포는 부동 클러스터 및 부착 세포의 혼합물로서 성장한다. 단단히 TIRFM 위해 매우 중요 유리 커버에 부착 성장 세포를 가지고 프로토콜 (셀 밀도, 분할 비율, 등.)에보고 된 지시 사항을 따르십시오. <ol><li> 시작하기 전에, 층류 생물 안전성 캐비닛 하에서 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)와 배양 배지의 부피를 좋은 기회. <ol><li> 150 mM의 NaCl을, 24 mM의 인산염 완충액, pH가 7.4의 농도로 PBS 50 ㎖를 확인합니다. 솔루션을 필터링합니다. </li><li> 고 글루코스, 10 % 열 - 불 활성화 된 소 태아 혈청 (FBS), 페니실린 (100 U / ㎖), 스트렙토 마이신 (100 ㎍ / ㎖), L- 글루타민 (가진 둘 베코 변성 이글 배지 (DMEM)에서 세포 배지 50 mL로 2 mM)을하고피루브산 나트륨 (1 mM)을. 솔루션을 필터링합니다. </li></ol></li><li> 완전한 성장 배지를 제거하고 PBS의 3 ㎖로 세포를 씻어. </li><li> 37 ° C에서 5 분 (6cm 페트리 접시)에 0.05 % 트립신 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 2 ㎖ (EDTA)와 세포를 품어 5 % CO 2를 피펫을 사용하여 세포를 분리. </li><li> 2 ml의 DMEM을 첨가함으로써 트립신을 비활성화하고, 5 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 세포를 수집한다. </li><li> 단일 세포 현탁액으로 세포를 분산시키는 것이 충분히 아래로, 상층 액을 제거 펠릿 DMEM 1 ㎖를 추가하고, 용액을 피펫. </li><li> 전체 매체의 3 ㎖를 포함하는 새로운 6cm 직경 페트리 접시에 4 : 그들에게 일을 분할합니다. 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서, 6cm 직경 배양 접시에서 배양 세포를 유지한다. 일주일에 한 번씩 서브 배양 또는 80 덮여 때 - 표면적의 90 %. </li></ol></li><li> 이미징을위한 SH-SY5Y 세포 도금 <ol><li> TIRFM 실험의 경우, 판커버 글래스 상 세포. 고용 유리는 0.17 ± 0.005 mm 두께 1.5255 ± 0.00015 굴절률 다룹니다. 시작하기 전에 다음과 같이 커버 글라스를 준비 : <ol><li> 유리 청소 90 % 에탄올, O / N로 다룹니다. </li><li> 증류수 (증류수 3 번)에 철저히 씻어. 드라이 유리 건조 오븐에서 다룬다. </li><li> 장소는 유리 페트리 접시에서 커버하고 3 시간 동안 200 ° C로 예열 된 오븐에서 소독. </li></ol></li><li> 일 형질 감염 전에, 3.5 cm 페트리 접시에 각 커버 슬립을 배치 배지 1 ㎖를 추가하고, 5 % CO 2 인큐베이터에서 37 ° C에서 배양한다. </li><li> 1.1.5, 완전 배지 1 ㎖로 세포 펠렛을 중단하고 카운트 - 단계 1.1.3에 기재된 바와 같이 세포를 Trypsinize. 잘 / 3 × 10 5 세포를 산출하기 위해 각 페트리 접시에 추가 세포 현탁액의 올바른 볼륨을 계산합니다. 이 밀도는 세포의 최적 성장 및 효율적인 형질 전환에 필요한. 37 ° C에서 품어5 % CO 2 배양기 O / N에서. </li></ol></li><li> 폴리에틸렌 이민으로 SH-SY5Ytransfection (PEI) 참고 : 시냅스 소포 역학을 시각화하려면, synapto - pHluorin를 포함 pCB6 벡터가 사용되었습니다. synapto-pHluorin 녹색 형광 단백질 (GFP) (16)와 구조가 광범위하게 뉴런 (9) 내에서 시냅스 소포 특성을 조사하기 위해 사용 된 2 시냅 토브 기공을 막 단백질의 pH에 민감한 변형의 프레임 융합에 의해 생성되었습니다. <ol><li> 형질 전환을 시작하기 전에 다음과 같은 솔루션을 10 ㎖를 확인합니다. 1개월으로 최대로 솔루션을 유지합니다. <ol><li> 150 mM의 NaCl 용액을 확인합니다. 0.01 N 염산으로 pH 5.5로 조정합니다. </li><li> 150 mM의 NaCl 용액에 10 % 폴리에틸렌 이민 (25 kDa의 선형 PEI)에서 PEI 솔루션을합니다. 용액의 pH는 8.8로 상승한다. 0.01 N HCl로 7.8 산도를 조정합니다. </li></ol></li><li> 도금 후 24 시간, 배지를 제거하고 1.5 ml의 새로완전 배지. 5 % CO 2 인큐베이터에서 37 ℃에서 세포를 유지. </li><li> 층류 생물 안전성 캐비닛에서 1.5ml의 미세 원심 분리 튜브에, 150 mM의 NaCl 용액 25 μL 및 3.5 cm 페트리 접시 당 PEI 용액 100 ㎕로 플라스미드 DNA 3㎍을 추가. </li><li> 와동 10 초 후, RT에서 30 분 동안 DNA / PEI 혼합물을 배양한다. </li><li> 조심스럽게 세포와 커버 슬립을 함유하는 페트리 접시로 DNA / PEI 혼합물을 추가하고 부드럽게 동일 배양 접시에서 시약을 분배 흔들어. </li><li> 4 시간 후에 배지를 변경하고, 5 % CO 2 인큐베이터에서 37 ° C에서 세포 O / N을 배양한다. 형질 전환 후 48 시간 - 이미징 실험 24을 수행합니다. </li></ol></li></ol> 총 내부 반사 형광 현미경 2. 세포 이미징 (TIRFM) <ol><li> 영상 설정 <ol><li> 그림 1에 설명 된 셋업과 TIRF 이미징을 수행합니다. 그것은 거꾸로 모터 구성현미경 (도 1, 인셋), 레이저 소스 (도 1, 인셋 B) 및 TIRF-슬라이더 (도 1, 인셋 C). 높은 개구 수 (NA 1.45 - 알파 플랜 Fluar) 100X 오일, 침지 대물 통해 TIRFM 조명에 도달한다. </li><li> TIRFM 조명용, 멀티 라인 (458/488/514 ㎚) 100 mW의 아르곤 이온 레이저를 이용한다. 모노 모드 광섬유를 사용 TIRF 슬라이더를 통해, 빔 경로에 직선 편광의 레이저 광을 소개한다. 반사 된 빛의 빔 경로의 발광 필드 격막면에 TIRF 슬라이더를 삽입합니다. <ol><li> 넓은 필드 조명의 경우, 기존의 수은 쇼트 아크 램프 HBO 흰색 빛에 현미경을 연결합니다. 슬라이더의 편파 유지 이중 프리즘 TIRF 조명과 백색광의 동시 결합을 보장한다. </li></ol></li><li> 여기 필터 (밴드 폭 10분의 488 ㎚)와 레이저 광 필터 레이저 경로에 도입 필터 휠에 탑재. 고용고속, 소프트웨어 제어, 셔터는 레이저 조명의 빠른 제어를 가능하게합니다. pHluorin 분석을 위해, 밴드 50분의 525 nm의 방출 필터를 통과 마운트합니다. 이미지 PROPLUS 소프트웨어 냉각 고속 CCD 카메라에 디지털 이미지 (512 X 512 픽셀)를 캡처합니다. </li></ol></li><li> TIRF 조명을 달성 (그림 2) <ol><li> 레이저, 컴퓨터, 카메라, 필터 휠, 셔터 컨트롤러를 켭니다; 다음, 레이저는 따뜻하게하고 안정을 필요로하는 실험을 시작하기 전에 20 분을 기다립니다. </li><li> 촬영하기 전에 다음과 같은 솔루션의 좋은 기회 볼륨을 확인합니다. <ol><li> 1.2 mM의 KH 2 PO 4, 25 mM의 4- (2- 히드 록시 에틸) 피페 라진 -1- 에탄 술폰산 (HEPES) (완충액을 125 mM의 염화나트륨, 5 mM의 KCl을, 1.2 mM의 MgSO4로에서 크렙스 (KRH) 용액 50 mL로 하여 pH 7.4), 2 mM의 CaCl2를, 6 mM의 포도당. </li><li> 80 mM의 염화나트륨, 50 mM의 KCl을, 1.2 mM의 황산, 1.2 mM의 KH 2 PO 4에서의 KCl-KRH 솔루션 (PH 7.4) 10 mL로25 mM의 HEPES는, 2 mM의 CaCl2를, 6 mM의 포도당 (7.4의 pH로 완충). </li></ol></li><li> 형질 세포와 유리 커버를 제거하고 적절한 영상 실에 삽입합니다. 챔버를 조립하고 유리의 중앙에 KRH 용액 500 μL를 추가한다. </li><li> 목표를 통해 오일을 추가합니다. 현미경의 무대에 영상 실을 놓고 유리 커버 슬립 아래의 목적을 놓습니다. 샘플을 통해 안전 커버를 배치합니다. </li><li> 표면 형광 모드에서, 커버 슬립 (상면)에 초점을 실 중앙에 배치 형질 감염된 세포를 선택합니다. 그의 형광 신호 분명히 80 밀리 초 미만의 노출 시간을 사용하여 기록 될 수있는 셀을 선택. </li><li> 소프트웨어 제어, 라이브 모드에서 TIRF 조명으로 전환합니다. </li><li> TIRF 구성을 설정하려면, 샘플 커버 (그림 2B)에, 목적에서 나오는 빔의 위치를 확인합니다. t는 빔의 중심에 위치 할 때그 대물 렌즈 (좌측도 2a)은, 스폿 (왼쪽,도 2B) TIRF 샘플 커버의 중앙에 표시되고 셀 표면 형광 모드에 이미징된다 (몇몇 포커스 평면, 높은 배경 형광도 2C, 왼쪽) . </li><li> 임계각에 도달하기 위해, Y 방향으로 집광 스폿을 이동 (전방 또는 후방도 2B, 중앙) TIRF 슬라이더 (도 1C)에 각도 조절 나사를 이용. 빔 (우측도 2a) 임계각보다 큰 각도로 시료면에 집광함으로써, 스폿은 사라지고 직선, 얇은 초점 선 (우측도 2B) 샘플 덮개의 중앙에 분명하다. </li><li> 미세 조정하려면 TIRF 각도는 세포 샘플 (그림 2C)를 사용합니다. 이 단계에서, 표면 형광 같은 이미지가 여전히 표시, 비디오의 형광 이미지를보세요. 부드럽게, TIRF 콘 때까지 나사를 이동dition 달성된다 : 셀의 단지 하나의 광학면은 포커스 (즉, 커버 슬립에 접하는 플라즈마 막),이 (오른쪽,도 2C) 콘트라스트가 높은 평면 화상 결과이다. </li></ol></li><li> 샘플 영상 <ol><li> 단일 채널 시간 경과 실험을 설정합니다. photobleaching에 최소화하기 위해, 낮은 노출 시간 및 높은 이득을 이용하여 이미지를 캡처. 80 밀리 초 - 적절한 노출 시간은 40 사이입니다. 2 Hz의 샘플링 주파수 - 1에서 이미지를 획득. 소포 반응 속도는 더 높은 주파수 (10 Hz에서)에서 더 극명하게 샘플링 할 수있다. 관찰 일정한 시간은 통상 2 분이다. </li><li> TIRFM 모드에서 KRH 솔루션 및 기록 세포의 500 μl를 추가합니다. 이 휴식 상태이다. 시간 순차 이미지를 저장합니다. </li><li> 휴식의 동일한 조건 (레이저 파워, 노출 시간, 프레임 번호)에서 동일한 셀 기록에 초점을 맞 춥니 다. 다섯 프레임 후, KCl을-KRH 솔루션의 500 μl를 추가하고 챔버에서의 KCl을 유지합니다.이것은 자극 된 상태이고; 시간 순차 이미지를 저장합니다. </li></ol></li></ol> 3. 이미지 분석 및 데이터 처리 주 : 이미지를 분석하기가 매크로 이미지 분석 소프트웨어 기존의 기능에 기초하여, 실험실에서 개발되었다; 비슷한 매크로 온라인 (재료 및 장비의 표에서 제공하는 URL)를 사용할 수 있습니다. <ol><li> 형광 강도 정량화 <ol><li> 동영상의 과정을 통해, 이미지 관심 영역 (ROI)의 영역에서 형광 강도 정량화 &quot;시퀀스 형광 강도&quot;매크로를 사용. </li><li> 시간 순차 이미지를 엽니 다. 매크로 메뉴로 가서 &#39;시퀀스 형광 강도&#39;를 선택합니다. &#39;분석&#39;창에서 &quot;투자 수익 (ROI)을 선택합니다&quot;가 나타납니다. </li><li> 투자 수익 (ROI)을 생성하기 위해 메뉴에서 선택 도구 중 하나를 선택합니다. 관광 명​​소 (배경 ROI)없이 세포막의 지역에서 3 ROI를 배치합니다. 생을 고용S &quot;배경 ROI&quot;광표백을 평가하고 융합 이벤트 분석 (도 3A)에 대한 임계 값을 설정. </li></ol></li><li> 광표백 수정 및 임계 값 결정 (그림 3B) <ol><li> 광표백을 평가하기 위해 형광 강도 행 &quot;배경 ROI를&quot;, (그림도 3B)을 엽니 다. 초기 강도 값 (F0) (F / F0) (도 3BB) 각 프레임에서 형광 강도 값을 정규화한다. 값을 평균. </li><li> 평균 데이터를 선택하고 차트 메뉴 옵션을 사용하여 선 그림을 만듭니다. </li><li> 데이터 분석 메뉴에서 플롯 분석 대화 상자를 엽니 다 &quot;추세선&quot;를 선택합니다. 회귀의 유형을 선택합니다. 설정 &quot;지수&quot;회귀. 그런 다음 &quot;차트에 표시 방정식&quot;을 선택합니다. 그래프 창에서, 지수 방정식이 나타나고 매개 변수 값이 자동으로 (그림 3BC 할당 </strong&gt;). </li><li> 다음과 같이 각각의 프레임의 휘도 값으로 보정 지수 적용 : FN은 (수정) FN / 애 썼는데 = (α *) FN = 프레임 N에서 측정 실험 형광 강도; N = 프레임 수; photobleaching에 의한 강도로 손실율을 발현 = 표백 계수 (정수; &#160; 그림 3BD). </li><li> 임계 값을 설정하려면, 정규화 및 수정 &quot;배경 투자 수익 (ROI)을&quot;열기 평균 형광 신호 및 표준 편차 (SD)를 계산한다. 3 SD 플러스 평균값은 임계 값 (도 3Be)을 나타낸다. 데이터 분석이 임계 값을 사용합니다. </li></ol></li><li> 반자동 절차를 이용하여 융합 이벤트의 선택 <ol><li> 이미지 분석 소프트웨어와 시계열 화상을 연다. 활성 이미지 시퀀스에 가우시안 필터를 적용합니다. </li><li> 을 선택할 수 있습니다 도구 &quot;개체를 계산&quot;또는 매크로를 사용하여 이미지를 분석픽셀들이 정의 된 범위 내에서의 평균 형광 강도를 가지고 개체. 수동 임계 함수를 사용 범위 설정 강도 (바 메뉴로 이동을, 계수 설정 → 임계치는 관심 영역을 강조하기 위해). 적절한 임계 값은 로컬 형광 배경 시그널이 30 % 이상이다. </li><li> 매크로는 다음과 같은 기준을 충족 객체 만 선택 &quot;개체를 필터&quot;적용 : <ol><li> 측면에 대한 범위 옵션 (최소 및 최대 포함)를 적용합니다. 양태는 장축과 객체 타원 상당의 보조 축 간의 비율을보고한다. 화면은 항상 ≥1. 적절한 값은 분 = 1, 최대 = 3이다. </li><li> 직경에 대한 범위를 적용합니다. 두 직경도 구간 두 윤곽 점 접합과 물체의 중심을 통과하는 직경 측정의 평균 길이를보고한다. 픽셀 범위를 설정 (또는 μm의에서, 보정 시스템을 사용하는 경우). </li><li> prelimin에서 최적의 범위를 정의진 실험 수동 관심 지점을 선택하고 플롯 프로파일 함수를 사용하여 직경을 측정한다. </li></ol></li><li> &quot;표시 객체&quot;를 선택 : 선택된 개체가 TIRFM 이미지 (그림 4B)에 중첩되어 나타납니다. </li><li> 분석 만 짧은 (1-3 프레임) 표시 스폿 즉시 신호 (과도 스폿)의 현저한 손실이어서 형광 강도 일시적인 증가를 포함한다. 선택한 소포 ​​/ 스팟 (실험의 ROI) 주위에 약 한 스폿 직경 반경 투자 수익 (ROI)을 생성하기 위해 원형 선택을 사용한다. 수동으로이 단계를 수행합니다. </li><li> ROI 영역을 선택하면, 영화에 걸쳐 각 ROI의 평균 형광 강도를 계산한다. </li></ol></li><li> 데이터 분석 (도 3C-D) <ol><li> 스프레드 시트에 각 &quot;실험적인 투자 수익 (ROI)&quot;에서 측정 된 형광 변화의 시간 코스를 보냅니다; (그림 3DA). 초기 형광 강도 (F / F0) (도에서 3dB)에 대한 각 프레임의 강도 값을 정규화한다. </li><li> 단계 3.2.4 (도 3DC)에보고 된 각 프레임의 강도 값의 지수에 보정을 적용한다. </li><li> 융합 이벤트들의 총 수 (피크 수), 각각의 융합이 발생 시간 (피크 폭)와 형광 피크 (피크 높이 및 AUC)의 진폭을 계산하기 위해 스프레드 시트 또는 수학 패키지를 사용하여 논리 함수를 적용한다. 논리식을 사용하여 융합 이벤트 분석의 일례가도 3Dd 및 3DE에보고된다. </li><li> 원형질막 소포 융합과 같은 임계 값 (평균 ± 3SD 배경 형광 강도)를 초과 형광 강도의 증가와 융합 이벤트로 인한 피크를 가정한다. </li><li> 마지막으로 각 피크의 제 x 값의 차이로서 피크 폭을 계산한다. 1 / (샘플링 주파수)이 값을 곱합니다. 이 값을 고려소포 다시 산성화 및 재활용 (도 3Dd) 전에 세포막에서 소포 융합 및 부착 시간이야. </li><li> 임계 값 이상의 값의 합으로 전체 세포 AUC를 계산합니다. 때문에 자연 (휴식)에 녹화 시간 동안 순 형광 변화 또는 유발 (자극) 시냅스 활동이 값을 고려하십시오. </li><li> 각 피크 및 임계치 Y의 최대 값 사이의 차이로서 피크 높이를 계산한다. 융합 형 (대 단일 동시 / 순차 융합 또는 과도 대 전체 퓨전)의이 값으로 나타내는 것이 좋습니다. </li></ol></li></ol>

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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

이 논문은 이미지에 프로토콜을 제시하고, 형광 cDNA를 인코딩 벡터와 TIRFM를 사용하여, 분비 세포에서 소포 역학을 분석 할 수 있습니다. TIRFM에 의해 성공적으로 영상의 핵심 요소 소포 자료 및 재활용의 유전자 인코딩 광학 지표와 셀룰러 모델과 세포 형질의 선택입니다. TIRFM는 이상적으로 유리 커버에 부착 성장과 세포막과 융합 이벤트의 안정적인 시각화를 허용하기에 충분히 평평한 세포에 적합합니다. 그들의 매매, 융합 및 엔도 시토 시스는 묘화 소포 및 단일 레벨에서 정량화 될 수 있도록 소체 이상적 셀에 분산되어야한다. 불행하게도, 신경 세포는 이러한 기준을 충족하지 않는 : 그들은 서로 자주 건너 불규칙한 모양, 신경 돌기가 있고, 융합이 prevalently 작은 지역 (활성 영역)에 집중되어 소포. 이 지역은 뉴런의 차 문화에 TIRFM에 의해 소포 역학을 연구하는 것은 매우 어렵다. <p클래스 = &quot;jove_content는&quot;&gt...

신경 세포 사이의 화학 시냅스 전달은 신경 시스템의 통신의 주요 메커니즘이다. 이 시냅스 사이트에서 소포 융합 및 검색의 동적 사이클을 통해 신경 전달 물질의 방출에 의존한다. 소포 역학에 관여하는 단백질의 대부분은 확인되었다; 그러나, 현상에 특정 공헌 1 명확히 남아있다. 이해 부분적 엑소 / 엔도 사이토 시스에 가장 널리 사용되는 분석은 항상 가장 적합하지 않은 사실에 의해 제한된다. 여러 소포 융합 관련 연구와 역학 전기 생리 기술에 의존하고있다. 이 기술은 최적의 시간 해상도를 제공하며 세포막에 소포 초기 융합을 조사하는 우수하지만 연접 기능을 지원하는 기본 분자 많은 이벤트를 감지 할 수있다. 전자 현미경은, 다른 측면에서, 최고의 morphologica을 제공합니다시료를 분석하기 위해 고정되어야하기 때문에 각 스텝 단수이지만 이벤트의 동적 양태의 설명은 L, 포착 할 수 없다. 형광 분자 프로브 개발 4-6의 발전과 함께 새로운 광 기록 기술 2,3의 출현, 따라서 시냅스 구조 및 기능에 대한 정보를 제공하는 새로운 수준, 생균의 exocytic 프로세스 시각화 할 수있다. 초기 연구 악용 활동에 의존 스티 릴 염료 (FM1 - 43 및 관련 유기 염료) 7,8. 최첨단 영상 기술은 내강 소포 단백질 9 닿는 녹색 형광 단백질 (GFP) (pHluorin)의 pH 민감성 변종을 사용합니다. 이 프로브는 일반적으로 낮기 때문에 내강의 pH의 소포에 존재하는 경우 꺼져 있습니다. 세포막과 융합 후, 소포 내부는 중성 세포 외 공간에 노출된다 산도<html> 갑자기, 증가 pHluorin의 양성자에 의존 담금질을 완화하고, 형광 신호가 빠르게 나타납니다. pHluorin 변화 형광 증가를 모니터링함으로써, 융합 이벤트보다 빠르기 때문, 막과 소포 융합 측정하고 분석 할 수있다. 표면 pHluorin 태깅 분자 endocytosed되므로 형광 신호는 이후, 따라서 동일한 구조가 소포 9 재활용을 모니터링하도록 또한 사용될 수있다, 기저 레벨로 되돌아 간다. 베지 태그 pH의 센서 만 실제로 세포막과 융합 그 소포 시각화을 보장하면서, 높은 시공간 해상도 이미징은 상세 엑소 / 이입 과정에 관련된 단계를 설명하는 데 필요하다. 필요한 시공간 해상도를 제공하는 광학 기술은 전반사 형광 현미경 (TIRFM), 형광 현미경 (10)의 애플리케이션이다. &quot;&gt; 내부 전반사가 광 통로가 임계각보다 큰 입사각으로 유리 커버 슬립에 도달 유리 커버 슬립 샘플. 사이의 계면에서 발생 된 여기 광은 샘플에 송신되지만되지 않는다 완전히 다시 반영. 이러한 조건, 계면에서의 에바 네 센트 광 웨이브 형태 및 아래 산장의 강도의 침투 깊이 (계면으로부터의 거리와 함께 지수 함수 적으로 감소있다. 이하의 광학 밀도 (샘플)과 매질에서 전파 멀리 경계로부터 사람들은 GFP-제물로 형질 세포에서.없는 동안 약 100㎚) 커버 슬립에 가장 가까운 근방에만 형광체가 여기 될 수 있으며, 이러한 깊이는 세포막에 발현 된 단백질 또는 소포 성 구조에 대응 셀 내부에 형광 물질이 여기 될 수 없기 때문에, 배경 형광을 최소화하고, 화상이 매우 높은 신호 / 배경 쥐된다. 그것에 접근IO (11)을 형성한다. 몇 가지 특성은 소포 역학 모니터링을위한 선택의 TIRFM 기술을합니다. 완벽한 콘트라스트 및 높은 신호 대 잡음비는 단일 소체로부터 도출 매우 낮은 신호들의 검출을 허용한다. 각 프레임에 칩 기반 이미지 획득은 매우 동적 인 프로세스를 검출 할 필요 시간 해상도를 제공한다. 마지막으로, 샘플의 다른면에서 빛 세포의 최소한의 노출은 강하게 광독성을 줄이고 오래 지속 시간 경과 기록 (12)을 수 있습니다. 데이터 분석이 기술의 가장 도전적이고 중요한 측면 남아있다. 소포 융합을 모니터링하는 간단한 방법은 13 시간 동안, 세포 표면에 형광 리포터 단백질의 축적을 측정하는 것이다. 물론 융합 증가 순 형광 신호가 증가함에. 그러나,이 방법은 특히 큰 셀에서 및 휴식 조건에서, 공정을 과소 수도엔도 시토 시스와 광표백 프로세스 인해 엑소 사이토 시스 소포로 형광 강도의 증가를 상쇄하기 때문이다. 다른 방법은 각각의 단일 융합 이벤트 (14)을 따르는 것입니다. 이 후자의 방법은 매우 민감하고 융합 메커니즘에 대한 중요한 세부 사항을 공개 할 수 있습니다. 완전히 자동화 된 절차는 소포를 따라 자신의 형광 신호의 변동을 등록 항상 사용할 수 없기 때문에 그러나, 하나의 이벤트의 수동 선택이 필요합니다. 소포 역학 관측은 높은 주파수에서 샘플링 세포가 필요합니다. 이것은 거의 직접 분석 할 수없는 대량의 데이터를 생성한다. 이 논문의 제안은 모두, 실험실에서 개발 된 절차는 데이터를 분석하기 위해 SH-5YSY 신경 아세포종 세포주에서 기저 및 자극을 신경 전달 물질 방출을 모니터링 TIRFM 영상 법을 최적화하고 설명하는 단계별이고 전체 셀 및 단일 소포 수준.

<table><tbody><tr><td colspan="4">장비</td></tr><tr><td>Axio Observer Z1</td><td><a href="http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/light-microscopes/axio-observer-for-biology.html#introduction" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Zeiss</a></td><td>491912-9850-000</td><td>도립현미경</td></tr><tr><td>다중 파장 아르곤 레이저 Lasos 77</td><td><a href="http://www.lasos.com/products/argon-ion-laser" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> 라소스</a></td><td>00000-1312-752</td><td>다중 파장(458/488/514 nm), 100&amp;nbsp;mW 아르곤 이온 레이저</td></tr><tr><td>레이저 TIRF 슬라이더</td><td><a href="http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/imaging-systems/single-molecular-imaging-laser-tirf-3.html" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Zeiss</a></td><td>423681-9901-000</td><td></td></tr><tr><td>100배율 대물렌즈</td><td><a href="https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&amp;amp;p=us&amp;amp;f=o&amp;amp;a=v&amp;amp;m=a&amp;amp;id=421190-9900-000&amp;amp;ss=1" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Zeiss</a></td><td>421190-9900-000</td><td>오일, NA 1.45 Alpha-Plan</td></tr><tr><td>CCD 카메라 RetigaSRV Fast 1394</td><td><a href="http://www.qimaging.com/products/datasheets/Retiga-SRV.pdf" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> QImaging</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SmartShutter가 탑재된 LAMBDA 10-3 광학 필터 교체 장치</td><td><a href="http://www.sutter.com/IMAGING/lambda103.html" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sutter Instrument Company</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">소프트웨어</td></tr><tr><td>Image ProPlus 6.3 소프트웨어</td><td><a href="http://www.mediacy.com/index.aspx?page=IPP" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> 미디어 사이버네틱스</a></td><td></td><td>스팟 선택, ROI 선택, 형광 강도 측정</td></tr><tr><td>엑셀</td><td><a href="http://office.microsoft.com/it-it/excel/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Microsoft</a></td><td></td><td>광퇴색 보정, 전세포 및 단일 소낭 분석</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 4.00</td><td><a href="http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> GraphPad Software, Inc.</a></td><td></td><td>통계 분석</td></tr></tbody></table>

tirfm과 ph 민감성 gfp - 프로브는 sh-sy5y 신경 모세포종 세포에서 신경 전달 물질 소포 역학을 평가하기 : 세포 이미징 및 데이터 분석

TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

시냅스 소포가 융합 및 검색의 동적 사이클을 화학적 시냅스에서 신경 전달 물질을 방출. 실시간 시냅스 활성을 모니터링하고 단일 소포 수준에서 엑소 엔도 시토 시스의 여러 단계를 해부하면 건강과 질환에서 시냅스 기능을 이해하는데 중요하다. 직접 시냅스 소포 및 총 내부 반사 형광 현미경 (TIRFM)을 대상으로 pH 민감성 프로브 소포 역학을 수행하는 데 필요한 공간 - 시간 해상도를 제공을 유전자 인코딩. 내부 전반사에 의해 생성 산장은 엑소 엔도 시토 시스의 과정이 일어나는 정확한 위치, 세포가 접착 된 커버 유리 위에 박층 (&lt;150 ㎚)에 배치 된 형광체를 여기 할 수있다. 얻어진 높은 콘트라스트 이미지는 이상적으로 추적 소포 융합 이벤트의 정량 분석​​에 적합하다. 이 프로토콜에서는, SH-SY5Y 인간의 Neuroblastoma 세포 때문에 평평한 표면, TIRFM에 의해 단일 ​​소포 수준에서 신경 전달 물질 방출을 연구하기위한 귀중한 모델과 분산 된 소포의 존재로 제안된다. 부착 세포로 SH-SY5Y 성장과 synapto-pHluorin로 형질 감염에 대한 방법은 TIRFM 및 이미징을 수행 할 수있는 기술뿐만 아니라, 제공됩니다. 마지막으로, 개수를 선택하고, 전체 셀 및 단일 소포 수준에서 융합 이벤트를 분석하는 것을 목표로 전략을 제시한다. 이미지를 만드는 절차 및 데이터 분석 방법의 유효성을 검사하기 위해, pHluorin 태그가 소포의 역학은 휴식에서 분석하고 조건 (칼륨 농도 탈분극) 자극. 막 탈분극 융합 이벤트의 빈도를 증가시키고, 전체 셀 내에 기록 순 형광 신호의 병렬 인상을 야기한다. 단일 소포 분석 융합 이벤트 동작 (증가 피크의 높이와 폭)의 수정을 보여준다. 이 자료는 제 제안칼륨 탈분극에 엄청난 신경 전달 물질 방출을 유도뿐만 아니라 소포 융합 및 재활용의 메커니즘을 수정 아닙니다. 적절한 형광 프로브,이 기술은 항시 분비 자극 메커니즘을 해부 다른 셀룰러 시스템들에서 사용될 수있다.

설명 TIRF 이미징 및 데이터 분석 절차는 셀룰러 시스템에서 소포 역학을 연구하기 위해 설계되었습니다. 이 기술은 융합 이벤트 및 신경 전달 물질 소포 (17) 상에 분자 역학 및 약물 시그널링의 효과를 결정하기 위해 사용될 수있다. GFP 표지 된 세포막 단백질 사용 TIRFM 분석 교세포에서 GFP 표지 된 글루타메이트 수송 상피 세포 (18,19)의 구성 적 특징을 거래하기 위해 사용되어왔다. 보고 이미지를 만드는 절차 및 데이터 분석 전략의 유효성을 확인하기 위해, 융합 이벤트는 기초에서 기록되고 synapto-pHluorin로 형질 SH-SY5Y 신경 모세포종 세포에서, (칼륨에 의한 탈분극) 조건을 자극. (비디오를 각각 1, 2). 두 개의 서로 다른 분석이 수행됩니다 : 전 세포 (그림 4) 및 단일 소포 분석 (그림...

이 논문은 synaptobrevin2-pHluorin 구조체 및 전반사 형광 현미경을 사용하여 신경모세포종 세포의 신경전달물질 소포 역학을 조사하는 방법을 제공합니다. 이미지 처리 및 데이터 분석을 위해 개발된 전략도 보고됩니다.

TIRFM과 pH 민감성 GFP - 프로브는 SH-SY5Y 신경 모세포종 세포에서 신경 전달 물질 소포 역학을 평가하기 : 세포 이미징 및 데이터 분석

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real ...

이 절차의 전반적인 목표는 pH 민감성 프로브와 전반사 형광 현미경 또는 잔디를 사용하여 신경모세포종 세포의 신경전달물질 소포 역학을 조사하는 것입니다. 이는 먼저 세포를 유리 커버 슬립에 도금하고 시냅스 소포를 선택적으로 표적으로 하는 소포 융합 및 재활용의 유전적으로 암호화된 pH 민감성 형광 프로브로 세포를 transection함으로써 수행됩니다. 단백질 발현은 24-48시간 이내에 나타날 것으로 예상됩니다.두 번째 단계는 전반사(total internal reflection) 현미경으로 소포 역학을 기록하는 것입니다. 이 단계는 실험의 성공에 특히 중요하며 잔디 구성을 달성하는 방법에 대한 단계별 설명이 제공됩니다. 다음. 올바른 잔디 구성에 도달하면 기저 조건 또는 자극 조건에서 소프트웨어에 의해 순차적 이미지를 자동으로 기록할 수 있습니다.마지막 단계는 상용 소프트웨어 또는 수제 알고리즘을 사용하여 이미지를 처리하고 비디오에서 데이터를 추출하는 것입니다. 궁극적으로는 잔디 현미경을 사용하여 소포 융합에서 원형질막으로의 형광 신호에서 파생되는 형광 신호의 변화를 기록합니다. 융합 이벤트의 빈도와 소포 융합 모드에 대한 정보를 얻을 수 있습니다.예를 들어 전기 현미경 및 전기 생리학과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 소포 역학을 감지하는 데 필요한 특수 및 임시 솔루션을 모두 제공한다는 것입니다. 실제로, 이 기법으로 얻은 고대비 이미지를 통해 단일 소포에서 오는 신호를 감지할 수 있습니다. 저렴한 기본 이미지 획득 분석은 역학을 감지하는 데 필요한 임시 솔루션을 제공합니다.이 방법은 자전거 역학에 대한 특정 시냅스 단백질의 역할 또는 시냅스 전달에 작용하는 약물의 작용 메커니즘을 이해하는 것과 같은 신경 과학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 일반적으로 이 문제를 처음 접하는 개인은 소포를 추적하고 PROE 신호의 변동을 등록하는 완전 자동 절차가 항상 사용할 수 있는 것은 아니기 때문에 해당 분석에 어려움을 겪습니다. 먼저, 이 방법에 대한 아이디어는 병원성 돌연변이 또는 시냅스 단백질이 Nevo 전달물질 소포 방출에 미치는 영향을 조사하기로 결정했을 때 떠올랐습니다.기존 방법은 충분히 포괄적이지 않았기 때문에 적절한 솔루션에 도달하기 위해 신경모세포종 세포주 SH SY five one에 이 기술을 설정하기로 결정했습니다. Tier 4 구성을 달성하는 방법 및 비디오에서 정량적 데이터를 추출하는 방법과 같은 몇 가지 핵심 단계는 더 이해하기 쉽고 설득력 있는 단어를 사용하여 설명하는 것이 중요하기 때문에 이 방법의 시각적 시연은 매우 중요합니다. 시각화된 경우.잔디 이미징을 수행하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 전동 도립 현미경, 레이저 소스 및 잔디 슬라이더를 설정합니다. 잔디 조명을 달성하기 위해. 형질 주입된 세포가 있는 유리 덮개를 제거하고 적절한 이미징 챔버에 삽입합니다.챔버를 조립하고 유리 중앙에 500마이크로리터의 크렙스 링거 용액을 추가합니다. 그런 다음 대물렌즈 위에 기름을 추가합니다. 이미징 챔버를 스테이지에 놓습니다.tage 현미경의 및 유리 커버 슬립 아래에 대물렌즈를 배치합니다.에피 형광 모드에서 샘플 위에 안전 덮개를 배치합니다. 커버 슬립에 초점을 맞추고 소프트웨어 제어 하에 챔버 중앙에 배치된 형질 주입된 세포를 선택합니다. 라이브 모드에서 잔디 조명으로 전환합니다.잔디 구성을 설정하려면 샘플 커버의 대물렌즈에서 나오는 빔의 위치를 확인하십시오. 빔이 대물 렌즈의 중앙에 위치하면 잔디 샘플 커버 중앙에 반점이 보이고 세포는 에피 형광 모드에서 이미지화됩니다. 임계각에 도달하려면 잔디 슬라이더의 각도 조정 나사를 사용하여 초점이 맞춰진 지점을 Y 방향으로 이동합니다.빔이 임계각보다 큰 각도로 샘플 평면에 수렴하면 스폿이 사라지고 샘플 커버 중간에 직선의 얇은 초점이 맞춰진 선이 분명해집니다. 잔디 각도를 미세 조정하려면 세포 샘플을 사용합니다. 비디오에서 형광 이미지를 시청하십시오.이 단계에서는 이미지와 같은 epi 형광이 여전히 보입니다. 잔디 상태가 될 때까지 나사를 부드럽게 움직입니다. 여기서는 셀의 광학 평면 하나만 초점이 맞춰져 있어 대비가 높은 평면 이미지를 얻을 수 있습니다.샘플 이미징을 수행하려면 단일 채널 타임랩스 실험을 적절한 노출 시간으로 설정하여 40밀리초에서 80밀리초 사이로 설정합니다. 1헤르츠 또는 2헤르츠 샘플링 주파수에서 이미지를 획득합니다. 500마이크로리터의 Krebs 링거 용액을 추가하고 잔디 현미경 모드에서 세포를 기록합니다.휴식 상태의 시간 순차 이미지를 저장합니다. 같은 세포에 초점을 맞추고 동일한 휴식 조건에서 기록합니다. 5 프레임 후에 5 마이크로 리터의 염화칼륨 Krebs 링거 용액을 넣고 챔버에 염화칼륨을 유지합니다.시간을 절약하십시오. 자극된 상태의 순차적 이미지. sequence fluorescence intensity 매크로를 사용하여 형광 강도, 관심 영역에서의 정량화 또는 영화 전반에 걸친 이미지의 ROI를 수행할 수 있습니다.이렇게 하려면 먼저 시간 순차 영상을 엽니다. 매크로 메뉴로 이동하여 sequence fluorescence intensity를 선택합니다. 분석 창에서 이동합니다.ROI를 선택하려면 메뉴에서 선택 도구 중 하나를 선택합니다. ROI를 생성하려면 반점이 없는 세포막 영역에 세 개의 ROI를 배치합니다. 배경 RO의 경우 이 배경 ROI를 사용하여 사진 표백을 평가하고 융합 이벤트 분석을 위한 임계값을 설정합니다.ROIs를 선택한 상태에서 확인을 클릭합니다. 영화가 진행되는 동안 각 ROI의 평균 형광 강도를 자동으로 계산하고 추가 분석을 위해 데이터를 스프레드시트 프로그램으로 내보냅니다. 사진 표백을 평가하기 위해 형광 강도가 상승했습니다.Background ROI는 각 프레임의 형광 강도 값을 초기 강도 값으로 정규화하고 값의 평균을 구합니다. 평균 데이터를 강조 표시하고 차트 메뉴 옵션을 사용하여 선 플롯을 만듭니다. 데이터 분석 메뉴에서 추세선을 선택하여 플롯 분석 대화 상자를 엽니다.회귀 유형을 지수 회귀로 설정합니다. 그런 다음 차트에 수식 표시를 선택합니다. 그래프 창에 지수 방정식이 나타나고 매개변수 값이 자동으로 할당됩니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 intensity 값에 지수 보정을 적용한 후 정규화되고 수정된 배경을 열어 임계값을 설정합니다. 그런 다음 ROI는 평균 형광 신호와 표준 편차를 계산합니다. 평균값에 3개의 표준 편차 단위를 더한 값이 임계값을 나타냅니다.융합 이벤트를 선택합니다. 먼저 이미지 분석 소프트웨어로 시간 순차 이미지를 열고 활성 이미지 시퀀스에 가우스 필터를 적용합니다. 도구 카운트 개체 또는 매크로를 사용하여 이미지를 분석하면 픽셀이 정의된 범위 내에서 평균 형광 강도를 가진 개체를 선택할 수 있습니다.임계값 기능을 사용하여 강도 범위를 수동으로 설정하고, 매크로를 적용하고, 개체를 필터링하여 특정 기준을 충족하는 개체만 선택합니다. 먼저 측면에 대한 범위 옵션을 적용합니다. Aspect는 개체에 해당하는 타원의 장축과 단축 사이의 비율을 보고합니다.aspect에 대한 적절한 값은 최소 1에서 최대 2.3입니다. 그런 다음 지름 기준에 대한 범위를 적용합니다: 픽셀 단위: 지름은 2도 간격으로 측정된 지름의 평균 길이를 보고하며, 윤곽이 표시된 두 점을 결합하고 물체의 OID를 통과합니다. 그런 다음 표시 객체를 선택합니다.선택한 물체는 잔디 현미경 이미지 단서에 겹쳐진 것처럼 보이며, 분석에서는 형광 강도의 짧은 일시적인 증가를 보인 점만 나타나고 그 직후에는 현저한 신호 손실이 나타납니다. 원형 선택을 수동으로 사용하여 선택한 소포 주위에 방사상으로 약 1개의 스폿 직경의 ROI를 생성합니다. ROI를 선택한 상태에서 영화가 진행되는 동안 각 ROI의 평균 형광 강도를 계산합니다.각 실험 ROI에서 측정된 형광 변화의 시간 경과를 스프레드시트로 내보내고, 각 프레임의 강도 값을 초기 형광 강도로 정규화합니다. 이전과 마찬가지로 각 프레임의 intensity 값에 지수 보정을 적용한 후 스프레드시트 또는 수학 패키지를 사용하여 논리 함수를 적용하여 총 융합 이벤트 수, 각 융합이 발생하는 시간 및 형광 피크의 진폭을 계산합니다. 임계값을 초과하는 형광 강도의 증가를 원형질막에 대한 소포 융합으로 가정하고 그 결과 피크를 융합 이벤트로 가정합니다.피크 너비를 각 피크의 마지막 X 값과 첫 번째 X 값 간의 차이로 계산합니다. 그런 다음 이 값에 샘플링 주파수에 1을 곱합니다. 이 값을 소포 융합 및 원형질막에서의 접착 시간, 소포 재산성화 및 재활용 전으로 간주하십시오.다음으로, 곡선 아래의 전체 셀 영역을 임계값을 초과하는 값의 합으로 계산합니다. 이 값을 순 형광 변화로 간주 자발적 또는 유발된 시냅스 활동으로 인한 기록 시간 동안 피크 높이를 각 피크의 최대 y 값과 임계값 간의 차이로 계산하고 이 값을 융합 유형을 나타내는 것으로 간주합니다. 전체 세포 분석에서는 세포에서 발생하는 융합 이벤트의 총 수와 빈도를 휴지 상태에서 분석합니다.소포는 때때로 원형질막에 접근하여 형광 강도 플롯에서 원형질막과 융합합니다. 이것은 장관 자극제의 적용 후 역치를 넘는 형광 강도의 갑작스러운 변화에 의해 반영됩니다. 다양한 형광 강도의 다른 피크가 형광 강도 프로파일 플롯에 갑자기 나타납니다.칼륨 자극 후 피크 수와 높이의 증가에 주목하십시오. 단일 피크 분석에서는 모든 단일 핵융합 이벤트가 분석됩니다. 두 개의 매개변수가 측정됩니다.피크 너비는 원형질막에 대한 소포, 접착 및 융합 시간에 해당하며, 피크 높이는 피크 융합의 메커니즘을 반영합니다. 칼륨 탈분극 하에서는 피크 높이와 너비가 증가하며, 이는 원형질막에 대한 운동 소포 융합의 변화를 반영합니다. 이 절차를 수행하는 동안 이 캔 기술은 원형질막에서 발생하거나 이 절차 직후에 발생하는 이벤트의 시각화만 허용할 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.풍부한 현미경 검사와 같은 다른 방법은 내재화 된 자전거의 운명, 발달 후 세포 내 단백질과 같은 추가 질문에 답하기 위해 수행 할 수 있습니다. 이 기술은 세포 생물학 및 생리학 분야의 연구자들이 방광 외포작용(vesical Exocytosis), 세포 매트릭스 에디션(cell matrix edition) 및 이온 플럭스(ion fluxes)와 같은 개인 막에서 발생하는 동적 이벤트를 연구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 Tier 4 구성을 달성하고, 수직 역학을 기록하고, 데이터를 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

tirfm-ph-sensitive-gfp-probes-to-evaluate-neurotransmitter-vesicle

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

태그를 추가하여 superecliptic pHluorin와 막 수용체의 세포 외 도메인, 및 이미징에 의해 배양 된 마우스 뉴런에서 이러한 퓨전 수용체, 우리는 직접 플라즈마 막에 수용체의 개별 기공을 갖는 삽입 이벤트를 시각화 할 수 있습니다. 이 기술은 플라즈마 막에 수용체 삽입에 관한 분자 메커니즘을 elucidating에 도움 될 것입니다.

이미징은 기본 양식 마우스 뉴런의 플라즈마 막에 수용체 삽입을 pHluorin 태그

이 동영상은 신경 소포의 움직임을 시각화하기 위해 특정 형광 단백질로 표지하는 방법을 보여줍니다. 먼저, 형광 단백질에 대한 플라스미드 코딩을 형질주입(transfection)제와 함께 배양한 다음 뉴런 배양액에 도입합니다. 그 후, 뉴런의 이미지를 획득하고 분석하여 소포의 움직임을 추적합니다.

Visualization of Vesicle Motilities in Neurons Using Fluorescence Imaging(형광 이미징을 사용한 뉴런의 소포 운동성 시각화)

출처: Daniele, F., et. SH-SY5Y 신경모세포종 세포의 신경전달물질 소포 역학을 평가하기 위한 al TIRFM 및 pH 민감성 GFP 프로브: 세포 이미징 및 데이터 분석. J. Vis. 특급. (2015). 이 동영상은 TIRF(Total Internal Reflection Fluorescence) 현미경을 사용하여 형광단 태그가 지정된 시냅스 소포를 시각화하는 인간 신경모세포종 세포의 이미징을 보여줍니다. 세포는 먼저 형광 모드에서 초점을 맞춥니다. 그런 다음 내부 전반사를 달성하기 위해 조정이 이루어지며, 멤브레인 근처의 형광단을 선택적으로 여기시키는 소멸파를 생성합니다. TIRF 이미징 전에 획득 매개변수가 구성되고 샘플링 주파수가 설정됩니다.

전반사(Total Internal Reflection) 형광 현미경을 사용한 세포 이미징

출처: Lacin, E., et al. 생체 내 신경 전달 물질의 광학 검출을 위한 세포 기반 신경 전달 물질 형광 공학 리포터(CNiFER)의 구성. J. Vis. 경험. (2016년)이 비디오는 마우스 피질에 사전 주입된 특수 리포터 세포인 세포 기반 신경 전달 물질 형광 공학 리포터(CNiFER)를 사용하여 생체 내 신경 전달 물질 방출을 이미징하는 기술을 보여줍니다. 2광자 현미경 아래에 위치한 마우스는 형광 방출을 통해 신경 전달 물질 유도 칼슘 신호를 시각화할 수 있습니다. 이 방법은 CNiFER의 G-단백질 결합 수용체에 대한 신경 전달 물질 결합을 활용하여 칼슘 방출 및 형광을 유발하여 신경 전달 물질 활성을 실시간으로 감지합니다.

세포 기반 신경 전달 물질 형광 조작 리포터를 사용한 이미징 신경 전달 물질 방출

pH가 민감한 형광으로 막 단백질의 세포 외 도메인에 레이블, superecliptic pHluorin (-9 월), 세포 내 현지화, 표현, 인신 매매를 결정할 수 있습니다. 촬상 전반사 형광 현미경 (TIRFM)으로 단백질을 -9 월 표지 주연 ER 및 세포막에서 단백질 농도의 정량 분석을 가능하게한다.

pHluorin 태그가 수용체를 활용하여하는 세포 현지화 및 인신 매매를 모니터링하기

막 인신 매매에 대한 조사는 신경 기능을 이해하는 데 중요합니다. 여기서는 뉴런에서 소포 운동성을 정량화하는 방법을 소개합니다. 이것은 신경계에서 막 인신 매매의 정량화에 적용 할 수있는 편리한 방법입니다.

형광 프로브를 이용한 배양 된 뉴런의 엔도 좀과 리소좀 기능의 정량화

시 냅 스 소포 endocytosis pHluorin 시 냅 스 소포 단백질 융합의 가벼운 현미경에 의해 및 소포 통풍 관의 전자 현미경 검사 법에 의해 검출 된다.

교양된 Hippocampal 신경에 시 냅 스 소포 Endocytosis를 측정

우리는 교양된 뉴런에 재활용 시 냅 스 소포 (SV)에 대 한 광학 분석 결과 설명 합니다. 더블 transfection는 연 접 마커 관심사의 단백질을 표현 하는이 프로토콜을 결합 연 접 사이트를 그들의 시 냅 스 소포 용량, 재활용 찾아서 관심사의 단백질의 역할을 결정할 수 있습니다.

시 냅 스 소포 교양된 신경 연 접 단백질 Overexpressing에 있는 재활용에 대 한 광학 분석 결과

신경 퇴행성 질환은 dysregulated 마이크로글리아 기능과 관련이 있습니다. 이 문서는 iPSC-대식세포에 의한 신경 모세포종 세포의 phagocytosis의 체외 분석방법을 설명합니다. 정량현미경 판독은 살아있는 세포 시간 경과 화상 진찰 과 고정 세포 고함량 화상 진찰을 위해 기술됩니다.

iPSC-대식세포에 의한 죽은 신경 모세포종 세포의 식증에 대한 체외 정량적 이미징 분석

시냅스 전달에 필요한 세포하 이벤트를 시각화하기 위해 두 가지 관련 방법이 설명된다. 이들 프로토콜은 시험관내 배양된 뉴런의 라이브 세포 이미징을 사용하여 시냅스 전 칼슘 유입 및 시냅스 소포막 융합의 역학의 실시간 모니터링을 가능하게 한다.

근위축성 측삭 경화증 모델에서 시냅스 기능의 실시간 형광 측정

제브라피시 유충 신경근 접합부(jebrafish larval neuromuscular junction)는 시냅스 생리학을 연구하기 위한 매력적인 모델입니다. 전기 생리학 및 광학 이미징을 포함한 많은 실험 기술에 적용할 수 있습니다. 여기에서는 정립 형광 현미경 하에서 pHluorin 기반 프로브를 사용하여 시냅스 전달을 이미징하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

절개된 유충 제브라피쉬의 신경근 접합부에서 시냅스 소포 재활용의 라이브 이미징

학습하세요 TIRFM과 pH 민감성 GFP 프로브를 사용하여 SH-SY5Y 신경 모세포종 세포에서 신경 전달 물질 소포 역학을 평가하는 방법을 배우세요. 이 기법은 시냅스 전달 메커니즘 연구에 필수적인 고해상도 이미징을 제공합니다.

TIRFM과 pH 민감성 GFP - 프로브는 SH-SY5Y 신경 모세포종 세포에서 신경 전달 물질 소포 역학을 평가하기 : 세포 이미징 및 데이터 분석

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