Name: 고립 된 관류 척추 동물의 망막에 대한 스트레스 모델로 글루타민산과 저산소증 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: 배우세요 소 눈 망막을 이용한 글루타민산 및 저산소증 스트레스 모델을 통해 신경보호제 효능을 평가하는 방법을. 전기생리학적 기록으로 망막 기능 변화를 정량화하여 전임상 약물 시험에 활용할 수 있습니다.

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이 논문은 사랑하는 아내 마렌과 어린 칼에게 바칩니다.

소 눈의 1. 준비 <ol><li> 동물이 도살 후 바로 소 눈을 얻습니다. </li><li> &quot;Sickel-솔루션&quot;의 보호 눈을 운반 120 mM의 NaCl을, 2 mM의 KCl을, 0.1 mM의의 MgCl 2, 0.15 mM의 염화칼슘 2, 1.5 mM의의 NaH 2 PO 4, 13.5 mM의 나 2 HPO 4, 5 mM의 포도당에 포함 된 특수 매체 RT. </li><li> 희미한 붉은 빛 어두운 적응 상태에서 망막의 준비를 수행합니다. </li><li> 눈의 앞쪽 부분을 제거합니다. 적도 절개 약을 수행 윤부에 4mm 후방. 그 후 한 조각 각막, 홍채, 모양체와 렌즈를 제거합니다. Sickel-솔루션의 망막을 유지합니다. </li><li> 기계적으로 망막 표면에 유리질 첨부 파일을 풀고 열린 눈 컵에서 유리체를 제거합니다. </li><li> 그 후 네 개의 사분면으로 눈을 분할하고 약의 영역 라운드 펀치 아웃 트레 반을 이용하여 직경 7mm. </li><li> 조심스럽게 망막 분리색소 상피 세포에서와 빛으로부터 보호 상자 안에 기록 장치에 놓습니다. 기록 장치는 중간에 메쉬 플라스틱 테이너 이루어져; 메시에 망막을 배치하고 전극에 직접 플라스틱 링으로 고정 후. 주 : 플라스틱 테이너는 매체의 일정한 흐름을 허용하는 두 개의 채널을 보유하고 있습니다. </li></ol> 2. 녹음 전위도 (ERG) <ol><li> 상기 전위도를 기록 망막의 양쪽에 두 실버 / 실버 클로라이드를 사용하여 전극과 CA의 일정한 속도로 관류 망막 관류하기 위해서 1 ml / 분, 37 ° C의 항온. 산소로 포화 &quot;Sickel-솔루션&quot;를 사용합니다. </li><li> 측정을 시작하기 전에, 어두운 망막 (모든 측정시 빛으로부터 보호) 적응과 다섯 분의 자극 간격을 사용합니다. 망막 표면에서 6.3 MLX로 설정 강도로 자극에 대한 1 Hz에서 단일 흰색 제논 플래시를 사용합니다. </리&gt; <li> 사용 감광 필터와 최적의 응답을 갖기 위해, 타이머에 의해 제어되는 마이크로 초 (10)의 광 자극을 교정. </li><li> 측정 데이터를 처리, ERG를 필터링하고 잔디 RPS312RM 증폭기를 사용하여 (100 Hz에서 고역 통과 필터, 50 Hz에서 노치 필터, 증폭 X 100,000)를 증폭하도록. 신호를 방해 할 수있다 가능 교란 주파수를 필터링보십시오. 데이터를 처리하기 위해서는, 데스크탑 컴퓨터 (PC 호환)에 아날로그 - 디지털 데이터 수집 보드를 사용한다. </li><li> 안정적인 B 파 진폭이 기록 될 때까지 일정한 관류하에 어두운 적응 기간 후, 전기 신호의 진폭을 측정한다. 주 : 다섯 번의 측정이 평균값에 도달하고 10 % 미만을 벗어나는 경우, 진폭은 안정된 것으로 간주된다. 단일 측정의 좋은 예는 그림 1에 제시되어있다. </li><li> 테스트를 시작하려면, 하나 순수한 질소로 순수한 산소를 대체 (단일 실험의 수, N = 5) 저산소증을 테스트250 μm의 글루타메이트 (N = 5). </li><li> 전기 응답 45 분 동안 5 분마다 기록합니다. </li><li> 시험 기간 후, 75 분 동안 산소로 포화 표준 매체와 망막을 관류하고 B 파의 진폭의 변화를 봐주세요. 이는 세척 단계이다. B 파의 피크에 파의 저점에서 B 파의 진폭을 측정합니다. </li><li> 암순응 조건 감광체 전위에 글루타메이트 또는 저산소증의 효과를 조사하기 위해, 양액이 1mm에 추가하여 B 파를 억제. </li><li> 30 분 동안 안정적인 감광체 전위를 기록한 후, 1 mM의 아스파라긴산과 상이한 관개 솔루션 망막 45 분 노출, 이전의 절차를 수행한다. 앞서 언급 한 것과 같은 세척 기간 (단계 2.8)를 사용합니다. </li></ol> 3. 데이터 분석 <ol><li> 통계적 데이터를 평가하기 위해, 콜 모고 로프 - 스 미르 노프 등을 사용하는 모든 데이터에 대한 정규 분포 보장테스트 (15). </li><li> 폭발 전에 마지막 측정에 비해 노광 단계 이후 백분율에서 A- 및 B- 파 진폭의 감소를 계산한다. 45 분 후, ERG - 진폭의 감소를 비교 - ERG 칠하기 전에 측정 - 박람회 기간 말. </li><li> 회복 가능성을 조사하기 전에 해당 박람회 진폭 세척 단계의 끝에 A- 및 B- 파 비교. </li><li> 통계 분석은 소프트웨어 또는 JMP 통계 소프트웨어 SPSS 소프트웨어를 사용한다. 표준 편차 평균 ± 등 전반에 걸쳐 데이터를 계산합니다. 해당 통계 테스트에 의해 의미를 추정. 참고 :이 테스트는 실험 범위에 따라 다를 수 있습니다. 이 설정에서 학생의 쌍 t-test를 사용합니다. </li></ol>

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</ol>

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본 연구에서는, 45 분의 저산소증 후에 B 파 진폭에 큰 영향이 발견되었다. 이러한 감소는 여전히 세척 단계 후 유의 하였다. 광 수용체 잠재력에 비슷한 효과가 관찰 될 수있다. 결과는 다른 게시 된 데이터 (16) 우리에게 저산소증 후 가능한 신경 보호 효과를 연구 할 수있는 기회를 제공하여 지원됩니다. 250 μM 글루타메이트의 45 분의 박람회 후, 우리는 세척주기의 끝에서 완전히 가역적 B 파의 진폭에 통계적으로 유의 한 영향을 찾을 수 없었다. 광 수용체 전위는 250 μM 글루타메이트에 의해 영향을하지 않았다. 단지 내부 망막 저산소증에 의해 영향을받은 사실은 변경, 따라서 매우 미묘하고 우리는 가능한 신경에 대해 아주 민감하고 표준화 된 지표를 가지고 있음을 나타냅니다. 아스 파르 테이트는 호​​에 구체적으로 감광체로부터 송신 억제따라서 알 또는 바이폴라 세포는 B 파를 억제한다. <...

신경은 지난 수십 년 동안 안과 연구 조사의 강력한 필드있다. 망막은 산소에 크게 의존와 그 주변 세포의 신진 대사에 의해 강하게 영향을 매우 민감한 신경 세포의 네트워크입니다. 신경 세포 손상과 관련된 주요 안구 병변은 망막 혈관 폐색, 녹내장, 망막 박리 있습니다. 망막 동맥 폐색증, 망막 혈관 폐쇄에 대한 예로서, 내측으로 인해 망막 저산소증 (1)의 시야에의 갑작스런 손실을 이끈다. 그것은 종종 시력이 크게 일을 복구하는 환자의 8 %만이으로, 지속적인 시력 저하 한 일반적인 혈관 병변 2 리드와 연결되어 있습니다. 동맥이 혈전 용해 치료 방법으로 제시되었지만, 이점은 무작위 임상 시험 3에 도시되지 않을 수있다. 녹내장 및 망막 박리모두 4-6 글루타메이트 농도의 증가가있다. 생리적 조건 하에서 글루타메이트는 중추 신경계 전체에 걸쳐 흥분성 송신기 및 내측 망막 7,8로서 발생된다. 상승 된 수준은 글루타메이트 아니라 망막 박리, 녹내장 및 5,6- 에서뿐만 아니라 증식 당뇨 망막 병증 9에서 발견되었다. 글루타메이트의 증가는 아마도, 따라서, 신경 세포의 흥분성을 열 손상에 이르게하고. 망막 박리와 망막 (유리체 절제술)에 증식 당뇨 망막 병증 수술의 경우에 대부분의 경우에 필요하다. 유리체 절제술 기계 조작 동안, 광섬유 또는 긴 작업 중에 관개 솔루션의 높은 유속에 의해 가해지는 전단 응력의 ​​밝은 빛이 망막 (11, 12)에 추가로 스트레스를 발휘. 모든 언급 한 질병 병리 레틴로 지역화되어 공통점혼자는 감각 신경 시스템으로 망막을 보호 할 수있는 방법을 찾기 위해 도전 안과 커뮤니티 포즈. 전위도 (ERG)은 생체 기능 감광체 (표면파) 및 내측 망막 (B 파장)의 함수의 평가를위한 표준 방법이다. ERG는 각막 도입은 전극에 의해 측정되고, 눈은 막대 또는 원뿔 또는 내측 망막 내의 결함을 검출하는 광의 레벨 증가에 의해 자극되고있다. 망막에 다른 결함은 진폭 (응답의 강도) 또는 ERG의 대기 시간 (타임 투 응답 간격)의 변화에​​ 의해 검출 될 수있다. 다른 ERG 프로토콜 및 측정 방법 (패턴 ERG는, 다 초점 망막 전위 또는 시야 ERG)는 결함의 더 차별화 할 수 있습니다. 망막의 격리 기술은 가능한 연구 동물의 예에서 간섭없이 망막에 대한 영향을 평가하기 위해, 최근에 도입 한일반적인 반응 13, 14. 평가 및 superfused 고립 된 망막에 저산소증과 글루타민산 염 스트레스에 대한 정의 및 표준화 된 스트레스 모델을 소개하는이 연구의 목적이었다. 따라서, 우리는 특정 에이전트 또는 인공 관개 솔루션의 신경 보호 효과에 대한 미래 연구를위한 기초를 마련하기를 바라고있다.

<table><tbody><tr><td>120 mM NaCl&nbsp;</td><td>Merck Pharma, 독일</td><td>1,064,041,000</td><td></td></tr><tr><td>2 mM KCl,&nbsp; &nbsp;</td><td>Merck Pharma, 독일</td><td>1,050,010,250</td><td></td></tr><tr><td>0.1 mM MgCl2,&nbsp;</td><td>Merck Pharma, 독일</td><td>58,330,250</td><td></td></tr><tr><td>0.15 mM CaCl2</td><td>Merck Pharma, 독일</td><td>111 TA106282</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mM NaH2PO4/13.5 mM Na2HPO4&nbsp; &nbsp;</td><td>Merck Pharma, 독일</td><td>1,065,860,500</td><td></td></tr><tr><td>5 mM 포도</td><td>당 Merck Pharma, 독일</td><td>40,741,000</td><td></td></tr></tbody></table>

고립 된 관류 척추 동물의 망막에 대한 스트레스 모델로 글루타민산과 저산소증

Glutamate and Hypoxia as a Stress Model for the Isolated Perfused Vertebrate Retina

신경은 지난 수십 년 동안 안과 연구 조사의 강한 필드 왔으며 녹내장, 망막 혈관 폐쇄, 망막 박리, 당뇨 망막 병증과 같은 질병에 영향을하고있다. 그것은 미래의 임상 치료 테스트를 위해 표준화 된 스트레스 모델을 소개하는이 연구의 목적이었다. 소 망막을 제조하여, 산소 포화 된 표준 용액으로 관류하고, ERG를 기록하고 있었다. 안정된 B-파도, 저산소증 (순수한 N 2) 또는 글루타민산 염 스트레스 (250 μm의 글루타메이트)을 기록 후 45 분 동안 발휘했다. 단독 감광체 기능에 미치는 영향을 조사하기 위해, 1 mM의 아스파라긴산은 파를 수득 하였다. ERG 복구 75 분 동안 모니터 하였다. 저산소증 들어, 87.0 %의 파 진폭의 감소는 45 분 (p = 휴약 0.03 종료 후 36.5 %의 감소)의 폭발 시간 후에 (p &lt;0.01)를 기록 하였다. 또한, 초기 DECR통계적 유의성에 도달하는, 87.23 %를 기록 하였다 B 파의 진폭에 완화 (페이지 &lt;0.01, 세척의 끝, P = 0.03에서 25.5 %의 감소). 250 μm의 글루탐산, 1.9 % (p&gt; 0.05) 감소 하였다 파 진폭 (p&gt; 0.05) 초기 7.8 % 감축. B 파의 진폭 (P &lt;0.01) 관찰되었다의 83.7 %의 감소; 75 분의 세척 후에 감소는 2.3 % (p = 0.62)이었다. 본 연구에서 표준화 된 응력 모델은 장래에 가능한 신경 보호 효과를 확인하는 데에 유용 할 수도있을 것으로 제시된다.

산소 포화 표준 용액 (도 1A 및 B)와 망막 관류 제제의 1 시간 후 ERG-진폭 안정화 및 단일 진폭 측정 사이의 편차를 적게 보였다. 의 pH, 삼투압, 온도, (저산소증 테스트 제외) PO 2는 모든 시험 일정하게 유지되었다. 망막의 내부 신호로부터 감광체 신호를 분리하려면, 1mM의 아스파라긴산은 B 파장 (도 1a)을 억제 표준 용액에 첨가 하였다. 저산소증의 효과를 테스트하는 동안, 87.0 %의 파 진폭의 저하를 45 분의 시간이 경과 박람회 (p &lt;0.01)를 기록 하였다. 유실의 끝에서, 36.5 %의 감소 (P = 0.03,도 2a)이 통계적으로 유의 한 관찰되었다. 또한, 87.23 %의 B 파 진폭의 초기 감소는 그 동등하게 도달 통계적으로 유의 한 (P &lt;0.01)를 기록했다. 이 25.5 %의 감소를 설정유명했다, 그 (P = 0.03, 그림 2B) 통계적...

이 연구로, 우리는 미래의 임상 치료 테스트를위한 격리 superfused 소 망막을위한 표준화 된 스트레스 모델을 소개합니다. A- 및 B- 파의 진폭에 의해 표현 망막 함수에 어느 저산소증 (순수한 N 2) 응력 또는 글루타메이트 (250 μM 글루타메이트)의 효과를 평가 하였다.

Neuroprotection has been a strong field of investigation in ophthalmological research in the past decades and affects diseases such as glaucoma, retinal ...

다음 실험의 전체적인 목표는 신경 보호제의 효능을 테스트하기 위한 잠재적 모델로서 글루타메이트 또는 저산소 스트레스를 도입하는 것입니다. 이는 먼저 갓 적출한 소의 안구를 확보하고, 신속하지만 외상성이 있는 망막 적출술을 수행함으로써 이루어집니다. 다음으로, 특수 영양액을 사용하여 망막을 고정시킨 후, 전극을 이용해 일련의 안정적인 기저선 망막전위도(electroretinogram) 또는 ERG를 기록합니다.그 후 영양액에 글루타메이트(glutamate)를 첨가하거나, 산소 대신 100% 질소를 주입하여 저산소증을 유도합니다. 마지막으로, 글루타메이트 스트레스 또는 저산소증이 A파와 B파의 진폭에 미치는 영향을 확인하기 위해 ERG를 기록합니다. 분석 결과, ERG 기록을 통해 저산소증 또는 글루타메이트 스트레스에 노출되었을 때 망막 기능의 변화가 나타남을 알 수 있습니다.이 기술의 기존 세포 배양 또는 in vivo ERG 기록 방식 대비 주요 장점은, 세포 배양과 달리 기능적 테스트가 가능하며, in vivo 실험과 비교했을 때 전극 배치나 전신 마취로 인한 변동성이 없다는 점입니다. 이 방법은 신경 보호제 테스트와 같은 약리학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 활용 범위는 급성 또는 만성 질환의 치료나 진단으로까지 확장됩니다.이제 이 스트레스 모델을 통해 잠재적인 신경 보호 제제를 테스트할 수 있습니다. 이 방법은 안과학 분야의 신경 보호에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 신경 퇴행성 질환과 같은 다른 의학 분야에도 적용될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 준비 과정의 기술적인 어려움으로 인해 시행착오를 겪을 수 있습니다.이 모델은 콜론의 훌륭한 신경생리학자인 Sickle 교수에 의해 개발되었습니다. 도축된 동물로부터 소의 안구를 확보한 후, 암적색광을 이용한 암적응 상태에서 실험실로 운반하기 위해 실온의 sickle 용액에 담급니다. 안구의 전면부를 제거한 다음, 각막연에서 후방으로 약 4mm 지점에서 적도 절개를 수행하고, 각막, 홍채 모양체 및 수정체를 한 조각으로 한꺼번에 제거합니다.망막을 sickle 용액에 보관하십시오. 다음으로, 망막 표면에 부착된 유리체를 기계적으로 분리하고 개방된 안구 컵에서 유리체를 제거합니다. 그런 다음 안구를 4분면으로 나누고, TR refine 펀치를 사용하여 직경 약 7mm의 원형 영역을 펀칭하여

glutamate-hypoxia-as-stress-model-for-isolated-perfused-vertebrate

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의학

쥐의 망막은 오랫동안 뇌에 접근 창으로 인정을 받고있다. 이 기술 문서에서 우리는 허혈성 손상 후 중추 신경계 내에서 혈관 재생의 실패로 이어질 메커니즘을 연구하는 산소에 의한 망막 병증의 마우스 모델을 사용하는 프로토콜을 제공합니다. 기술 시스템은 망막과 중추 신경계 내에서 기능 혈관의 재성장을 촉진하는 전략을 탐구하는 무력화 할 수 있습니다.

마우스 망막을 사용하여 중추 신경계의 혈관 재생의 평가

허혈성 뇌 손상의 여러 측면을 재생할 수 있습니다 entorhino - 해마의 Organotypic 슬라이스 문화에 대한 프로토콜은 제공됩니다. 신경 세포의 변화에​​ 더하여 neurovasculature의 변화를 연구함으로써,이 프로토콜은 손상 후 신경 조직 플라스틱 변화를 연구하는 다양한 도구입니다.

에서 신경 혈관 리모델링의 분석 Entorhino - 해마 Organotypic 슬라이스 문화

Ischemia-Reperfusion (IR) 손상은 높은 이환율 및 사망률과 관련이 있습니다. 여기에 설명된 산소-포도당 결핍 및 재산소화(OGD-R)의 체외 모델의 목표는 다양한 세포, 특히 혈액-뇌 장벽(BBB) 내피 세포에 대한 허혈 재관류 손상의 영향을 평가하는 것입니다.

같은 산소 포도당 박탈과 재산 소화<em&gt; 체외</em&gt; 허혈 - 재관류 손상 모델 공부 뇌 혈관 장벽 부전

이 문서에서는 마우스에서 안압 상승으로 망막 허혈 - 재관류 손상을 유도하는 절차를 설명합니다. 안압 상승으로 망막 허혈 - 재관류 손상은 망막 신경 혈관 기기의 인간 질병에 대한 잠재적 인 세포 메커니즘과 치료를 조사하는 연구를 가능하게 망막에 손상 산소와 영양 공급에 의해 특징 인간의 병리를 모델링하는 역할을한다.

안압 상승을 통해 망막 허혈 - 재관류 손상의 마우스 모델

낮은 - 비용, 사용하기 쉽고 강력한 시스템은 히스타민에 의해 유도 된 혈액 망막 장벽 위반을 개선 할 수 잠재적 인 치료를 평가하기 위해 설립된다. 혈관 누수, 뮐러 세포 활성화 및 신경 프로세스의 연속성 잠재적 약물 폭신 (lipoxin) A4를 갖는 손상 응답 및 역전을 평가하기 위해 이용된다.

치료를 위해 혈액 망막 장벽 위반 및 잠재적 인 마약을 평가하는 급성 망막 모델

허 혈 성 뇌졸중 공부 하기 어려운 어떤 영향을 받는 뇌 영역에 이다의 구체적인 기여 산소 포도 당 부족 (지도부)에 노출 하는 복잡 한 이벤트입니다. 이 문서는 고립 된 이다 그들의 반응성 및 확산 지도부 조건 하에서 연구 하는 방법론을 소개 합니다.

사이토 반응성 및 확산에서 체 외에 허 혈 성 같은 조건 모니터링

이 프로토콜 wholemount 쥐 망막에서 생체 외에서 신경 전달 물질 글루타민 산 염의 화학 신경의 형태를 조사 하는 새로운 방법을 설명 합니다. 화학 신경 망막의 포토 리셉터 퇴행 성 질환으로 인 한 돌이킬 수 없는 실명을 치료에 대 한 기존의 전기 통제에 유망한 대안 이다.

쥐 망막 신경 전달 물질 글루타민 산 염에 체 외에서 의 생체 모방 화학 Neuromodulation 위한 방법론

여기서, 우리는 간단한 봉합사 및 클램프를 사용하여 일시적인 양측 공통 경동맥 폐색에 의한 망막 허혈의 마우스 모델을 설명합니다. 이 모델은 심혈관 비정상으로 인한 망막 허혈의 병리학적 메커니즘을 이해하는 데 유용할 수 있습니다.

과도 양측 공통 경동맥 폐색에 의해 유도된 허혈성 망막 손상의 뮤린 모델

이 프로토콜은 성인 마우스로부터 수득한 망막 외식편의 분리, 해부, 배양 및 염색을 위한 단계를 제시하고 설명한다. 이 방법은 당뇨병 성 망막증과 같은 다양한 망막 신경 혈관 질환을 연구하기위한 생체 외 모델로서 유익합니다.

망막 신경혈관 질환 연구를 위한 생체 외 모델로서의 성인 마우스 망막의 망막 외 이식편

이 프로토콜은 전방삽관 삽입 및 안압 상승을 통해 망막 허혈을 유도한 다음 안압 정상화를 통해 재관류를 시작하여 마우스 눈의 망막 허혈-재관류 손상을 모델링합니다.

Induction of Retinal Ischemia-Reperfusion Injury in a Mouse Eye Model

여기에서는 확장된 생체 외 실험을 위해 쥐의 눈에서 망막을 분리하는 자세한 방법론을 제공합니다. 이 프로토콜은 살아있는 조직에서 망막 신경교세포를 제자리 로 유지함으로써 제공되는 연구 방법을 활용하고자 하는 연구자가 기술적으로 까다로운 접근 방식에 접근할 수 있도록 하는 것을 강조합니다.

마우스 망막의 신경교세포(glial interactions)를 연구하기 위한 생체 외 이식 모델(Ex vivo Explant Model for Study Glial Interactions in the Mouse Retina)

배우세요 소 눈 망막을 이용한 글루타민산 및 저산소증 스트레스 모델을 통해 신경보호제 효능을 평가하는 방법을. 전기생리학적 기록으로 망막 기능 변화를 정량화하여 전임상 약물 시험에 활용할 수 있습니다.

고립 된 관류 척추 동물의 망막에 대한 스트레스 모델로 글루타민산과 저산소증

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