동시 전기 생리 녹화 및 설치류의 뇌에서 억제 에이전트의 마이크로 주사
2015년 7월 7일
여기에서는 약물의 미세 주입에 의한 뇌 심부 구조 억제와 동시 전기 생리학적 기록을 통한 실시간 모니터링이라는 두 가지 기능을 가진 유리 피펫을 제작합니다.
이 절차의 전반적인 목표는 다중 단위 신경 세포 활동을 모니터링하면서 쥐 상구에 신경 전달 물질을 마이크로 주입하기 위한 저렴한 주입 도로를 건설하는 것입니다. 이는 먼저 유리 모세관과 수직 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 유리 피펫을 만들어 수행됩니다. 두 번째 단계는 테이퍼되지 않은 끝에서 튀어나온 와이어 부분이 있는 모세관에 은선을 삽입하는 것입니다.
다음으로 접착제를 사용하여 유리 피펫과 피하 주사 바늘 사이를 단단히 밀봉합니다. 마지막 단계는 미네랄 오일로 채워진 마이크로 주사기에 부착된 시카고 스카이블루 색상의 GABA 용액을 피펫에 채우고 마이크로 인젝터에 고정하는 것입니다. 궁극적으로, 접근 가능하고 저렴한 부품으로 주입하는 이러한 구조는 약물 주입 전, 주입 중 및 주입 후에 비활성화된 영역의 신경 활동을 기록하면서 뇌 심부 구조를 비활성화하는 데 사용할 수 있습니다.
이 기술은 가스 기반 압력 펄스 및 광자 주입 시스템과 같은 다른 기존 방법에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 하나는 약물 전달에 대한 기능 기반 제어가 가능한 비용 효율적인 방법이며, 이는 과도한 주입으로 인한 조직 손상을 제한한다는 것입니다. 이 시스템이 제공하는 또 다른 장점은 신경 비활성화의 시간적 구성 요소를 효율적으로 제어할 수 있는 결합된 녹음 기능입니다.
기록 주입 피펫을 준비하려면 먼저 cop 수직 모델의 경우 외경이 1mm인 7cm 모세관을 당깁니다. 7 20 또는 이와 유사한 단위. 히터를 18로 설정하고 솔레노이드를 다음으로 설정하고 장갑을 착용하고 팁을 수동으로 부수어 구멍을 만들고 현미경으로 내경이 30에서 40 마이크로 미터 사이인지 확인합니다.
뷰파인더 눈금자로 이것을 측정합니다. 0.3-0.6메가옴의 비교적 낮은 임피던스를 생성합니다. 그런 다음 테이퍼되지 않은 끝에서 약 7cm 길이의 피펫에 은색 와이어를 삽입하고 피펫에 1-2cm를 매달아 둡니다.
이 여분의 와이어를 모세관에 직각으로 구부립니다. 다음으로 30게이지 피하 주사 바늘을 잡고 유연한 플라스틱 접착제를 샤프트에 바릅니다. 그런 다음 바늘을 피펫에 천천히 삽입합니다.
가능한 한 멀리. 피펫과 바늘 사이의 접합부에 밀봉을 만들기 위해 더 많은 접착제를 추가합니다. 피펫 팁을 위로 향하게 하여 어셈블리를 약 12시간 동안 건조시킵니다.
쥐를 마취하고 입체 프레임에 넣은 후 안과 연고를 바르고 머리를 깨끗하게 면도합니다. 국소 마취제를 바르고 수술 마취면을 확인한 후 숫자 10 메스 날을 사용하여 중앙을 따라 두피를 절개합니다. 이것은 관상동맥 및 시상 봉합사를 노출시킵니다.
그런 다음 수술용 주걱을 사용하여 Lambda 및 bgma 해부학적 참고 자료를 식별합니다. 이러한 랜드마크가 동일한 수평면에서 수평이 되도록 머리의 위치를 조정합니다. 그런 다음 0, bgma의 유리관과 같은 미세한 단단한 포인터.
다음으로, bgma의 좌표를 사용하여 튜브의 위치를 관심 위치로 조정합니다. 샤피를 사용하여 개두술의 대상 영역 주위에 사각형을 그립니다. 이제 외과용 멸균 드릴을 사용하여 자국을 따라 뼈를 천천히 제거합니다.
뼈가 얇아졌을 때 마찰로 인한 머리 유발 조직 손상을 방지하기 위해 가능한 한 적은 압력을 사용하는 것으로 시작하고 드릴을 계속 움직인 다음 핀셋으로 사각형 부분을 조심스럽게 제거합니다. Dora MA는 주사가 앞으로 관통하므로 제거할 필요가 없습니다. 노출된 피질에 대뇌 척수액을 관개하십시오.
먼저 5-10 마이크로 리터 주사기에 미네랄 오일을 채워 주입을 준비합니다. 다음으로, 생리적 식염수에 염료를 첨가하여 관심 약물을 제조합니다. 여기서 0.5%시카고 스카이블루는 300마이크로몰 가바와 혼합됩니다.
이제 먼저 1ml 주사기에 준비된 용액을 주입한 다음 주사기를 사용하여 주입 피펫을 주입합니다. 주사기를 제거할 때 플런저에 가벼운 압력을 유지하여 진공 청소기가 주입 도로에서 용액을 제거하지 않도록 합니다. 누출 가능한 지점에서 유체가 빠져나오는지 확인하십시오.
과도한 액체를 면봉으로 닦아내고 누출 여부를 다시 확인하십시오. 이제 미네랄 오일이 든 마이크로 주사기를 주입 도로에 부착하십시오. 그런 다음 여분의 용액을 닦아내십시오.
거즈로. 주입 팁을 확인하십시오. 작은 용액 방울이 이를 통해 흐를 수 있어야 하며, 그렇지 않으면 인젝터가 막히거나 이제 인사기를 마이크로 펌프 시스템에 단단히 장착합니다.
그런 다음 주입 도로의 위치를 목표 좌표로 이동하고 전극을 시각적 유발 전위의 기록을 통해 식별할 수 있는 상대장으로 내립니다. 전극이 내려가는 동안 막힘을 방지하기 위해 낮은 주입 속도를 적용하여 작은 양압을 가하십시오. 구조체에 도달하면 주입을 중단합니다.
주사를 삽입한 후 노출된 피질을 따뜻한 한천으로 덮어 건조를 방지합니다. 전극의 최종 배치 후 전극을 둘러싼 조직이 안정화될 때까지 30분 동안 기다립니다. 그런 다음 상골에서 신경 활동이 활성화될 때까지 분당 40나노리터의 속도로 용액 400-800나노리터를 주입하면 전극은 억제 용액을 주입하는 동안 스파이크가 감소해야 합니다.
시각적으로 유발된 전위는 상관절(superior colus)에서 얻어졌다. 가바 주사 시 반대쪽 눈에 300밀리초 동안 섬광이 번쩍인 후, 섬광 자극에 대한 반응으로 스파이크 활동이 45분에서 60분 동안 억제되었습니다. 이 절차를 수행하는 동안 로딩 중 누출을 확인하고 약물 용액이 주입 팁을 통해 자유롭게 흐르는지 확인하는 것이 중요합니다.
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개요
이 기사는 심부 뇌 구조를 억제하기 위한 약물 전달 및 전기생리학적 기록을 통한 신경 활동 모니터링이라는 이중 목적을 위해 설계된 유리 피펫의 구성에 대해 설명합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 전기생리학
- 신경약리학
배경
- 심부 뇌 구조를 이해하는 것은 신경과학 연구에 매우 중요합니다.
- 미세 주사를 통해 표적화된 약물 전달이 가능합니다.
- 신경 활동의 동시 모니터링은 데이터 정확성을 향상시킵니다.
- 경제적인 도구는 더 넓은 연구 응용을 촉진할 수 있습니다.
연구 목적
- 신경전달물질 미세 주사를 위한 경제적인 방법을 만드는 것.
- 약물 투여 중 다중 유닛 신경 활동을 모니터링하는 것.
- 신경과학에서 실험 기술의 접근성을 개선하는 것.
사용된 방법
- 유리 모세관을 사용하여 유리 피펫을 구성합니다.
- 전기 기록을 위한 은선의 삽입.
- 접착제로 피펫을 저피하 주사기에 밀봉합니다.
- 미세 주사를 위해 피펫을 GABA 용액으로 채웁니다.
주요 결과
- 구성된 피펫은 백서의 상위 콜리쿨루스에 약물을 효과적으로 전달했습니다.
- 신경 활동의 동시 기록을 성공적으로 얻었습니다.
- 이 방법은 표적 뇌 구조를 비활성화하는 데 신뢰성을 보였습니다.
- 결과는 신경과학 연구에서 더 넓은 응용 가능성을 시사했습니다.
결론
- 이중 기능 피펫은 신경과학 연구를 위한 귀중한 도구입니다.
- 약물 전달과 신경 활동의 실시간 모니터링을 모두 가능하게 합니다.
- 이 접근법은 신경약리학에서 실험 결과를 향상시킬 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
This method enables real-time functional validation of drug effects on neuronal circuits, supporting target de-risking in early neuropharmacology discovery. By combining microinjection with electrophysiological readout, it provides mechanistic confidence for inhibitory compound screening. The approach offers a low-cost, adaptable platform for probing brain region-specific pharmacodynamics prior to lead optimization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of therapeutic targets through site-specific drug delivery and concurrent neuronal activity monitoring.
- Operational Value: Supports hypothesis-driven validation of neuronal pathway involvement in disease models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, real-time electrophysiological readouts as functional biomarkers of drug engagement.
- Operational Value: Facilitates assay standardization through reproducible microinjection and recording parameters.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Bridges in vitro findings to intact circuit function by validating drug effects in disease-relevant neuronal systems.
- Operational Value: Supports go/no-go decisions by linking target inhibition to measurable changes in neural network activity.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where target engagement and functional consequence must be established before compound advancement.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by confirming that target modulation produces expected electrophysiological outcomes.
- Screening: Enables primary screening of inhibitory agents using neuronal silencing as a functional readout.
- Analytics: Provides spike suppression metrics and latency-to-effect measurements for compound comparison.
- Translational Research: Aligns with preclinical validation by demonstrating target-mediated effects in vivo.
- Enterprise Reuse: The injectrode design is adaptable across brain regions and chemical compounds, supporting broad reuse in discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by linking pharmacological intervention to functional neural output.
- Operational Value: Reduces reliance on separate injection and recording systems, improving workflow efficiency and data synchronization.
- Strategic Value: Enhances capital efficiency by minimizing false positives through functional target confirmation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on dose-dependent electrophysiological responses.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgery, electrophysiology, and stereotaxic targeting.
- Depends on access to microinjectors, amplifiers, and signal acquisition systems capable of multi-unit recording.
- Necessitates standardization of injection volumes, rates, and post-injection stabilization periods across studies.
- Adaptation to different brain regions may require recalibration of coordinates and electrode positioning.
- Potential limitations include tissue damage from repeated insertions and variability in seal integrity affecting drug delivery accuracy.
