동시 전기 생리 녹화 및 설치류의 뇌에서 억제 에이전트의 마이크로 주사

본 절차의 전반적인 목표는 다단위 신경세포 활동을 모니터링하는 동시에 쥐의 상구(superior colliculus)에 신경전달물질을 미세 주입할 수 있는 저비용의 주입 도로를 구축하는 것입니다. 이는 먼저 유리 모세관과 수직 마이크로 피펫 풀러(vertical micro pipette puller)를 사용하여 유리 피펫을 제작함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 은선을 모세관에 삽입하여, 테이퍼 처리가 되지 않은 끝단 밖으로 은선 일부가 돌출되도록 하는 것입니다.

다음으로 유리 피펫과 피하 주사침 사이에 기밀한 밀봉을 형성하기 위해 접착제를 사용합니다. 마지막 단계는 마이크로 인젝터에 고정되고 미네랄 오일이 채워진 마이크로 시린지에 연결된 피펫에 시카고 스카이 블루 색상의 GABA 용액을 채우는 것입니다. 결과적으로, 구하기 쉽고 저렴한 부품으로 제작된 이 주입 장치를 통해 약물을 주입하기 전, 중, 후에 비활성화된 영역의 뉴런 활동을 기록하면서 뇌 심부 구조를 비활성화할 수 있습니다.

이 기술은 가스 기반 압력 펄스 및 광주입 시스템과 같은 기존의 다른 방법들에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 우선, 약물 전달에 대해 기능 기반 제어가 가능한 비용 효율적인 방법으로, 과잉 주입으로 인해 발생하는 조직 손상을 제한할 수 있습니다. 또한 이 시스템이 제공하는 또 다른 장점은 통합 기록 능력이 있어, 신경 비활성화의 시간적 요소에 대한 효율적인 제어가 가능하다는 점입니다.

기록용 주입 피펫을 준비하려면, 먼저 Cop vertical 모델 7-20 또는 유사 장치를 사용하여 외경 1 mm, 길이 7 cm의 모세관을 뽑아냅니다. 가열기는 18로, 솔레노이드는 1로 설정하십시오. 다음으로, 장갑을 착용한 상태에서 팁을 수동으로 부러뜨려 개구부를 만들고, 현미경 하에서 내경이 30 µm에서 40 µm 사이인지 확인하십시오.

뷰파인더의 자를 사용하여 이를 측정하십시오. 그러면 0.3에서 0.6 mega ohms의 상대적으로 낮은 임피던스가 생성됩니다. 그런 다음 테이퍼지지 않은 끝단에서 약 7cm 길이의 은선을 피펫에 삽입하고, 1~2cm 정도가 피펫 밖으로 나오게 둡니다.

이 여분의 와이어를 모세관과 직각이 되도록 굽힙니다. 다음으로, 30 gauge 하이포더믹 바늘을 준비하여 바늘 축에 유연한 플라스틱 접착제를 도포합니다. 그런 다음, 바늘을 피펫 안에 천천히 삽입합니다.

가능한 한 최대한 밀착시키십시오. 피펫과 바늘의 접합부에 접착제를 더 추가하여 밀봉합니다. 피펫 팁을 위로 향하게 한 상태에서 조립체가 약 12시간 동안 건조되도록 둡니다.

쥐를 마취하여 정위 고정 틀에 고정한 후, 안연고를 도포하고 머리 부분을 깨끗이 면도합니다. 국소 마취제를 투여하고 수술 가능한 수준의 마취 상태임을 확인한 뒤, 10번 메스 날을 사용하여 정중선을 따라 두피를 절개합니다. 이를 통해 관상 봉합선과 시상 봉합선이 노출됩니다.

그런 다음 외과용 스패튤라를 사용하여 Lambda와 bgma 해부학적 기준점을 확인합니다. 이 기준점들이 동일한 수평면상에 놓이도록 머리의 위치를 조정합니다. 그 후 유리관과 같이 가늘고 단단한 포인터를 bgma에 맞추어 영점을 조절합니다.

다음으로, bgma의 좌표를 사용하여 튜브의 위치를 관심 영역으로 조정합니다. 네임펜을 사용하여 두개골 절개술을 위한 표적 영역 주변에 사각형을 그립니다. 이제 외과적으로 멸균된 드릴을 사용하여 표시선을 따라 천천히 뼈를 제거합니다.

최대한 낮은 압력을 가하며 드릴을 계속 움직여, 뼈가 얇아졌을 때 마찰로 인해 발생하는 두부 유도 조직 손상을 방지하십시오. 핀셋을 사용하여 사각형 구획을 조심스럽게 제거합니다. 주입물이 향후 이를 관통하므로 Dora MA는 제거할 필요가 없습니다. 노출된 피질은 뇌척수액으로 계속 세척하십시오.

먼저 5~10 µL 시린지에 미네랄 오일을 채워 주입물을 준비합니다. 다음으로, 생리식염수에 염료를 섞어 대상 약물을 준비합니다. 여기서는 0.5% Chicago sky blue를 300 µM GABA와 혼합합니다.

먼저 1 mL 주사기에 준비된 용액을 채운 다음, 이 주사기를 사용하여 인젝션 피펫을 채웁니다. 주사기를 제거할 때 플런저를 가볍게 누른 상태로 유지하여 진공으로 인해 인젝션 로드에서 용액이 빠져나오지 않도록 합니다. 누출 가능성이 있는 지점에서 액체가 새어 나오는지 확인하십시오.

여분의 액체를 닦아내고 누출 여부를 다시 확인하십시오. 이제 미네랄 오일이 담긴 마이크로 시린지를 주입 로드에 연결하십시오. 그런 다음 여분의 용액을 닦아내십시오.

거즈를 사용합니다. 주입 팁을 확인하십시오. 소량의 용액 방울이 흘러나와야 하며, 그렇지 않을 경우 팁이 막힌 것입니다. 이후 인젝터를 마이크로 펌프 시스템에 단단히 장착하십시오.

그다음 주입 경로의 위치를 목표 좌표로 이동시키고, 시각 유발 전위(visual evoked potentials) 기록을 통해 확인할 수 있는 상구(superior colliculus)까지 전극을 내립니다. 전극을 내리는 동안, 막힘을 방지하기 위해 낮은 속도로 주입하여 소량의 양압을 가합니다. 목표 구조에 도달하면 주입을 중단합니다.

주입기를 삽입한 후, 건조를 방지하기 위해 노출된 피질을 따뜻한 한천(agar)으로 덮습니다. 전극을 최종적으로 배치한 후, 전극 주변 조직이 안정화될 때까지 30분 동안 기다립니다. 그 다음, 상교구(superior colliculus)에서 신경 활동의 활성화가 나타날 때까지 분당 40 nanoliters의 속도로 400 내지 800 nanoliters의 용액을 주입하며, 억제성 용액을 주입하는 동안 전극에서 스파이크(spike)의 감소가 관찰되어야 합니다.

상구(superior colliculus)에서 시각 유발 전위를 측정하였습니다. GABA를 주입한 후 반대측 눈에 300 millisecond 동안 플래시를 조사한 결과, 플래시 자극에 대한 스파이킹 활성이 45분에서 60분 동안 억제되었습니다. 이 절차를 수행하는 동안, 로딩 중 누출 여부를 확인하고 약물 용액이 주입 팁을 통해 원활하게 흐르는지 검증하는 것이 중요합니다.