횡단 단백질의 재구성, 현미경 및 패치 클램프 연구 거대한 단일 층 소포에 전압 게이트 이온 채널, KvAP,

다음 실험의 전반적인 목표는 전압 개폐 이온 채널을 거대한 uni lamellar vesicle에 통합하고 패치 클램프 측정으로 그 활성을 특성화하는 것입니다. 이는 먼저 이온 채널 KVAP를 포함하는 작은 소포 용액인 부분 탈수를 통해 달성되어 지질 단백질 필름을 생성합니다. 다음으로, 지질막이 재수화되어 세포 크기의 거대 ALR 소포 또는 채널을 포함하는 GV의 형성 및 성장을 유발합니다.

그런 다음 gvs를 기록 챔버로 옮기고 이온 전류를 측정하기 위해 패치 피펫으로 GUV 멤브레인 조각을 절제합니다. 결과는 전류 기록 분석을 기반으로 GUV 멤브레인의 이온 채널이 멤브레인 전압의 변화에 반응하여 활성화된다는 것을 보여줍니다. 거대 편측성 물리학은 막 단백질 상호 작용과 관련된 생물 물리학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

예를 들어, 막관통 단백질과 지질막의 물리적 특성의 상호 작용이 있습니다. 이 방법은 전압 의존성 철 채널 KVAP의 기능에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 일반적으로 다른 철 채널, 수송체 및 펌프, 멤브레인 관통 단백질에도 적용할 수 있습니다. 이 방법의 시각적 시연은 거대 소포의 조작과 관련된 단계이기 때문에 중요합니다.

읽는 것만으로도 KVAP를 포함하는 용액과 작은 unal 소포를 준비한 후 집는 방법. 텍스트 프로토콜에 따라 먼저 구멍을 통해 와이어를 삽입하고 와이어를 회전 및 닦아 질소 또는 공기의 흐름 아래에서 깨끗하고 햇볕에 잘 타며 건조되도록 하여 전기 형성 챔버를 준비합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 SUV 버퍼에 3밀리리터 SUV 서스펜션 30마이크로리터를 준비하고 용액을 세게 혼합하여 SUV 용액을 증착합니다.

2마이크로리터 피펫 또는 5마이크로리터 유리 주사기를 사용하여 SUV 용액의 작은 방울을 와이어에 놓습니다. 방울이 충분히 작고 닿거나 융합되지 않을 만큼 충분히 멀리 떨어져 있는지 확인하십시오. 퇴적된 SUV를 야외에서 약 30분 동안 건조시킵니다.

액적이 가라앉으면 와이어를 회전시켜 현미경으로 지질 침전물을 더 쉽게 관찰할 수 있습니다. 다음으로, 주사기를 사용하여 3 개의 웰 주변의 챔버 바닥에 진공 그리스를 바르고 40mm x 22mm 커버 슬립을 부드럽게 눌러 챔버 바닥을 밀봉하여 틈없이 접착되도록합니다. 그런 다음 천장 페이스트를 사용하여 챔버의 측면을 밀봉하고 챔버 상단에 세 개의 우물을 설명하는 진공 그리스를 바르십시오.

각 웰이 맨 위까지 채워질 때까지 성장 완충액을 천천히 추가합니다. 이렇게 할 수 있으므로 우물에서 용액의 빠른 이동을 피하십시오. 전극에서 지질 필름을 벗겨냅니다.

상단 덮개 슬라이드를 그리스 위로 부드럽게 눌러 챔버를 닫습니다. 하단 커버 슬립이 빠지지 않도록 주의하십시오. 두 개의 앨리게이터 클립을 사용하여 신호 발생기를 전선에 연결합니다.

사용 중인 버퍼의 염 농도에 따라 주파수를 설정하고 멀티미터로 전선을 가로지르는 전압을 측정하고 조정합니다. 또한 버퍼에 따라 알루미늄 호일을 사용하여 챔버를 덮어 식물군을 빛으로부터 보호하십시오. G UUV를 저염 완충액에서 2-3시간 동안 자라도록 두고, 고염 완충액의 경우 12시간 또는 하룻밤 동안 자라도록 둡니다.

배양 후 발전기에서 챔버를 분리하고 도립 현미경에 조심스럽게 놓습니다. GUV 성장 혈장을 평가하려면 ARO 용액이 잘 펴 바를 수 있도록 커버 슬라이드를 1분 동안 청소합니다. 커버 슬라이드를 청소한 후 15분 이내에 텍스트 프로토콜에 따라 준비된 따뜻한 아로 용액 200마이크로리터를 바르면 전체 표면이 적시

슬라이드를 수직으로 기울이고 티슈의 아래쪽 가장자리를 터치하여 과도한 액체를 제거하면 슬라이드에 얇고 부드러운 아로스 층이 남습니다. 슬라이드를 섭씨 60도의 핫플레이트나 오븐에 놓고 최소 30분 동안 건조시킵니다. 다음으로, AROS 코팅된 커버 슬립을 표준 3.5cm 페트리 접시에 넣습니다.

그런 다음 SUV 용액을 준비한 후 약 15마이크로리터를 약 30개의 아주 작은 방울에 부드럽게 바르십시오. aros 레이어가 너무 왜곡되지 않도록 주의하십시오. 슬라이드를 부드러운 질소 흐름 아래에 약 10-15분 동안 놓고 눈으로 완충액의 증발을 따릅니다.

SUV가 건조되자마자 물방울이 건조되면 슬라이드 표면을 덮기 위해 약 1ml의 성장 완충액을 추가합니다. 붓기가 약 30분 동안 진행되도록 한 다음 위상차 또는 DIC가 있는 도립 현미경을 사용하여 성장 챔버에서 GU UUV의 성장을 검사하여 클램프 gu UUV를 패치하기 위해 Gu UUV가 Gus가 부착하는 것을 방지하는 밀리리터당 5밀리그램 베타 케인 용액을 첨가하여 챔버를 먹었습니다. 퍼지고 파열됩니다. 5분 동안 배양하고 헹구고 접지 전극을 삽입하고 관찰 버퍼를 사용하여 챔버를 채웁니다.

다음으로, G UUV를 전기 성형 GU UUV를 위한 관찰 챔버로 옮깁니다. 상단 커버 슬립을 부드럽게 제거하여 성장 챔버를 엽니다. 피펫 팁을 각 와이어 바로 위에 놓고 GU UUV를 분리하려면 약 10마이크로리터를 천천히 흡입하면서 젤 보조 팽창 GU UUV를 위해 와이어를 따라 피펫 팁을 이동합니다.

먼저 페트리 접시의 측면을 몇 번 두드려 커버 슬립 표면에서 GU UUV를 분리합니다. 피펫 팁을 커버 슬립 바로 위에 놓고 10마이크로리터를 흡입하면서 팁을 표면 위로 뒤로 당겨 수확된 GVS를 관찰 챔버로 직접 옮깁니다. 거스가 바닥에 가라앉을 때까지 몇 분 정도 기다립니다.amp GVS.

관찰 버퍼를 사용하여 새 패치 피펫을 채우고 패치 cl에 장착합니다.amp 헤드 스테이지. 챔버를 통해 결함이 없는 GUV를 찾고 형광 단백질이 포함되어 있는지 확인합니다. 패치 피펫 내부를 깨끗하게 유지하기 위해 100파스칼 이상의 일정한 양압을 가하고 패치 피펫을 챔버에 삽입합니다.

패치 피펫을 시야로 가져오고 테스트 펄스를 적용하여 피펫 전압 오프셋 및 저항을 측정하거나 보상합니다. 그런 다음 형광등 조명 아래에서 피펫을 검사하여 팁이 깨끗한지 확인합니다. 패치 피펫을 GUV 쪽으로 가져오고 필요한 경우 동시에 양압을 줄여 패치 피펫의 바깥쪽으로 흐르는 흐름으로 인해 GUV가 빠져나가지 않도록 합니다.

패치 피펫이 GUV에 가까우면 음압을 가하여 GUV를 패치 피펫에 대고 당깁니다. GUV 멤브레인의 텅(tongue)이 패치 피펫으로 들어가고 기가 씰(giga seal)이 형성될 때 저항을 모니터링합니다. GUV에서 인사이드 아웃 멤브레인 패치가 절제되고 기가 씰이 안정되면 테스트 펄스를 끄고 텍스트에 설명된 대로 전압 프로토콜을 적용합니다.

이 그림은 결함이 없는 GUV의 DIC 및 epi 형광 이미지를 보여줍니다. GUV 막의 균일한 단백질 형광은 KVAP가 지질막에 남아 있지 않고 GUV에 통합되었으며 세 가지 방법을 사용하여 생성된 Gus의 응집체를 형성하지 않았음을 확인합니다. 단백질 밀도가 낮거나 높은 g UUV는 오버레이 이미지에서 자홍색 또는 녹색 음영을 나타내는 반면 평균 단백질 밀도를 가진 GVS는 흰색이 되도록 형광 지질 및 단백질 신호는 동일한 평균 밀도로 조정되었습니다.

분리된 결함이 없는 G UUV가 확인되었으며 GUV 크기 분포가 여기에 나와 있습니다. 일반적으로 전기 형성은 겔 보조 팽창보다 결함이 없는 G UUV를 더 많이 생성하지만 전기 형성에 의해 생성되는 GUS는 더 작습니다. 다음은 GUV 형광에서 추론된 단백질 밀도 분포입니다.

높은 염 완충액을 사용한 전기 형성은 다양한 단백질 밀도를 가진 GU UUV를 생성합니다. 밀도는 저염 완충액으로 전기 형성에 대해 훨씬 덜 변하며 겔 보조 팽창에 의해 생성된 GU UUV의 단백질 밀도는 절제된 패치의 단백질 농도에 따라 매우 균일합니다. 현재 추적은 단일 채널 또는 채널 앙상블을 표시합니다.

KVAP는 전압 의존 개방을 보여줍니다. 이 절차를 시도하는 동안 깎아지른 듯한 삼투압 스트레스에 저항하지 않는 깨지기 쉬운 물체의 거대한 소포를 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 단백질의 곡률 감지와 같은 추가 질문에 답하기 위해 지질 나노 튜브를 당기는 것과 같은 방법을 수행할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 기능적으로 재구성된 단백질을 포함하는 GVS를 생산하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.