형광 DNA를위한 간단한 방법 현장에서 숙청 염색체에 하이브리드

이 절차의 전반적인 목표는 DNA in situ hybridization을 사용하여 이종 염색체 염기서열을 유사분열 염색체에 매핑하는 것입니다. 이것은 먼저 별초파리 유충 또는 다른 관심 조직에서 세 번째의 뇌를 해부함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 커버 슬립에 조직을 고정하는 것입니다.

다음으로, 티슈는 커버 슬립과 슬라이드 사이에 찌그러집니다. 혼성화를 위해 염색체를 준비하기 위한 마지막 단계는 짧게 합성된 올리고 프로브를 찌그러진 조직에 혼성화하는 것입니다. 궁극적으로, 형광 현미경 검사는 염색체의 올리고 프로브를 보완하는 염기서열의 위치를 보여주는 데 사용됩니다.

기존 방법에 비해 이 방법의 주요 장점은 단순성입니다. 대부분의 다른 염색체와 C 2 혼성화 방법에는 비용이 많이 들고 지저분한 형태 아미드가 많이 함유되어 세척하는 것이 포함됩니다. 우리의 방법은 양식 IDE 세척이 필요하지 않으므로 더 저렴하고 깨끗하며 빠른 기술입니다.

이 방법은 초파리 뇌의 체세포 염색체에서 염기서열을 시각적으로 매핑하는 간단한 방법을 제공하지만, 다른 유기체의 다른 조직에서 다른 유형의 염색체에 대한 염기서열을 매핑하는 데에도 사용할 수 있습니다. 슬라이드를 만들 때마다 4-5개의 조직을 준비하되 뇌 해부를 위해 더 많이 준비하지 마십시오. 방황하는 세 번째 instar 유충을 선택하고 XPBS 1방울로 수집하는 것으로 시작합니다.

과밀하지 않은 바이알을 선택하십시오. 해부 범위 아래에서 매우 미세한 핀셋을 사용하여 입 고리를 잡고 다른 쌍을 사용하여 몸 길이의 2/3를 잡습니다. 그런 다음 입 고리를 부드럽게 당겨 뇌, 복부 신경절, 타액선 및 소화관의 일부를 노출시킵니다.

다음으로, 뇌와 복부 신경절(ventral ganglia)을 다른 조직으로부터 분리하여 플라스틱 플레이트에 있는 하나의 XPBT 방울로 옮깁니다. nasia 고환 해부의 경우 수컷 3일 된 puy를 수집합니다. 생후 3일 된 푸이는 몸이 노랗고 눈이 빨갛습니다.

작은 날개 패드를 가진 것은 수컷입니다. 흉부 부위 근처의 복부 상단에 있는 번데기를 한 쌍의 핀셋과 두 번째 핀셋으로 잡습니다. 복부의 가장 말단 끝을 잡고 눈물방울 모양의 고환을 빼냅니다.

그들은 부드럽게 털어낼 수 있는 뚱뚱한 몸체로 둘러싸여 있으며, 고환에서 외부 신체 부위를 분리하여 적절한 찌그러짐을 방지하고 고환을 깨끗한 접시에 한 XPBT 한 방울로 옮길 수 있습니다. 모든 조직이 채취되면 자매 염색분체의 분리를 개선하기 위해 저장성 용액으로 치료합니다. e chromatic 지구에서, 10 분 동안 0.5%sodium citrate의 한 방울에 조직을 옮기십시오.

이 효과를 얻기 위해 콜히친은 염색체 형태학에 인공물을 유발할 수 있으므로 권장하지 않습니다. 이제 초미세 핀셋을 사용하여 조직을 고정합니다. 깨끗한 시그마 코트 처리된 커버 슬립에 45% 아세트산이 함유된 갓 만든 2.5% PFA 20마이크로리터 방울로 옮기고, 고정액에 조직을 고르게 배치하고 실온에서 4분 동안 배양한 다음 커버 슬립을 스쿼시하는 것으로 시작하여 폴리리신 코팅된 슬라이드를 티슈와 커버 슬립에 가볍게 놓습니다.

커버 슬립이 누르지 않고 슬라이드 아래쪽에 달라붙도록 합니다. 치료. 시그마 코트가 있는 커버 슬립은 커버 슬립 제거 후 스쿼시 조직이 슬라이드에 남아 있는지 확인하는 데 도움이 됩니다. 그러나 드물게 조직이 커버 슬립에 부착된 상태로 남아 있을 수 있습니다.

이 단계에서는 복제 조직 스쿼시를 수행하는 것이 좋습니다. 이제 슬라이드를 뒤집어 접힌 두꺼운 종이 조각에 넣습니다. 그런 다음 안정된 표면에서 엄지 손가락을 사용하여 커버 슬립 위를 아주 세게 똑바로 누릅니다.

커버를 미끄러지게 하거나 티슈가 번지도록 누르지 마십시오. 매우 세게 누르면 일반적으로 호박 조직 내에서 잘 분해된 염색체가 생성됩니다. 그러나 때때로 불완전한 염색체, 찌그러짐 또는 조각난 염색체와 같은 염색체 품질의 변동에 직면할 수 있습니다.

따라서 다시 말하지만, 두세 번의 복제 조직 스쿼시를 수행하는 것이 좋습니다. 어셈블리를 얼음 블록에 몇 분 동안 옮긴 다음 질소가 끓는 것을 멈추거나 더 오래 끓일 때까지 액체 질소에 담그십시오.조직이 해동되기 직전에 슬라이드를 제거한 후 새 면도날을 사용하여 커버 슬립의 모서리를 튕깁니다. 따라서 그것을 제거합니다.

조직이 긁히지 않도록 주의하십시오. 그런 다음 100% 에탄올로 채워진 코플린 병에 슬라이드를 빠르게 넣고 최소 5분 동안 담가둡니다. 티슈를 건드리지 않고 과도한 에탄올을 제거하고 슬라이드 공기를 한 시간 동안 건조시킵니다.

그런 다음 슬라이드를 건조 챔버에 몇 주에서 몇 달까지 보관할 수 있습니다. 1 x 혼성화 완충액 20마이크로리터에 각 프로브 100나노그램을 추가하여 1 x 혼성화 완충액 22마이크로리터 용액을 만드는 것으로 시작합니다. 그런 다음 혼합물을 고정 된 조직에 피펫으로 넣고 조직을 손대지 않고 커버 슬립을 부드럽게 적용합니다.

작은 기포가 조직에 닿지 않으면 문제가 발생하지 않지만 더 이상 기포가 있으면 커버 슬립을 다시 도포해야 합니다. 슬라이드를 섭씨 95도의 열 블록의 평평한 면에 놓고 호일로 덮습니다. 팁 상자에 젖은 종이 타월을 추가하여 습도 챔버를 준비 할 수 있도록 5 분 정도 기다립니다.

그런 다음 슬라이드를 제거합니다. 스트레치 파라폼으로 슬라이드를 조심스럽게 감싸고 촉촉한 수건으로 구성된 가습 챔버로 옮기고 팁 상자에 넣어 챔버의 슬라이드를 섭씨 30도에서 하룻밤까지 4시간 동안 배양합니다. 이 온도는 GC 함량이 낮은 프로브에 적합하지만 GC 함량이 높은 프로브의 경우 혼성화 온도에 대한 몇 가지 문제 해결이 필요할 수 있습니다.

배양 후 파라 필름을 조심스럽게 제거하고 커버 슬립을 한쪽 모서리로 천천히 들어 올립니다. 그런 다음 0.1 XSSC 버퍼로 슬라이드를 세척당 15분 동안 세 번 세척합니다. 빛 노출을 최소화하기 위해 세탁하는 동안 항아리를 호일로 덮으십시오.

긴 비오틴화 프로브의 경우, 진행하기 전에 rod domine avadon을 첨가하고 세척하십시오. 먼저 조직 주변을 건조시키고 100마이크로리터의 차단 용액으로 조직을 덮습니다. 그런 다음 거품이 갇히지 않도록 새 커버 슬립을 부드럽게 적용합니다.

다시 param으로 슬라이드를 래핑합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 30분 동안 슬라이드를 배양합니다. 둘째, 배양 후 커버 슬립을 제거하고 물티슈로 조직 주위를 닦아냅니다.

그런 다음 조직에 SBT에 희석 된 1000 루민 아바돈 100 마이크로 리터를 바릅니다. 블록과 함께 한 것처럼 슬라이드를 덮고, 감싸고, 배양하여 후속 조치를 취합니다. 마지막으로 커버 슬립을 조심스럽게 제거하고 슬라이드를 세척합니다.

4 x SSC T에서 3회 세척한 다음 0.1 XSSC에서 3회 세척합니다. 각 세척 단계는 최소 5분 이상이어야 합니다. 프로토콜을 진행하면서 조직을 건드리지 않고 초과 버퍼를 불어내어 슬라이드를 건조시킵니다.

그런 다음 슬라이드 티슈 면이 위로 향하게 하여 10-15분 동안 또는 수분이 완전히 사라질 때까지 어두운 곳에 놓습니다. 이제 DPI가 있는 11마이크로리터의 벡터 쉴드를 사용하여 슬라이드를 장착하고 비 시그마 코트 커버 슬립을 조심스럽게 내립니다. 매체가 모든 가장자리에 도달하지 않으면 가장자리에서 몇 마이크로리터의 매체를 더 바르고 초과분을 닦아냅니다.

그런 다음 매니큐어로 커버 슬립을 밀봉하고 매니큐어가 마르는 동안 슬라이드를 어두운 곳에 똑바로 세워 보관합니다(보통 최소 30분 소요). 그런 다음 슬라이드를 섭씨 영하 20도에서 최대 일주일 동안 보관하고 가능한 한 빨리 조직을 이미지화합니다. 형광 접합체를 가진 상업적으로 합성된 작은 올리고 세트와 Nick Translation이 만든 더 긴 비오틴화 프로브는 모두 여러 다른 조직 유형의 염색체에 혼성화되었습니다.

설명된 방법론을 사용하여 Drosophila Melanogaster 359 염기쌍 위성 반복에 대한 프로브는 x에서 큰 다중 메가염기쌍 블록과 염색체 3에서 훨씬 더 작은 영역을 인식했습니다. 응답자 위성에 대한 더 긴 탐사선은 약 700의 상대적으로 낮은 반복 복제 수로 구성된 반복 블록을 감지했습니다. 따라서 이 방법을 사용하면 매우 작은 위성 블록을 시각화할 수 있습니다.

저장성 용액 처리 단계가 10분으로 두 배로 증가했을 때, 자매 염색체의 분리가 동쪽으로 증가했습니다. 이 절차는 특정 염기서열에 국한된 특정 염색질 단백질과 같은 질문에 답하기 위해 항체 염색과 같은 다른 방법과 결합할 수 있습니다.