형광 DNA를위한 간단한 방법

본 실험 절차의 전체적인 목표는 DNA in situ hybridization을 이용하여 유사염색질 서열을 체세포 분열기 염색체에 매핑하는 것입니다. 이를 위해 우선 3령 Drosophila 유충의 뇌 또는 관심 있는 다른 조직을 해부합니다. 두 번째 단계는 커버슬립 위에 조직을 고정하는 것입니다.

다음으로, 커버 슬립과 슬라이드 사이에서 조직을 압착합니다. 하이브리드화를 위해 염색체를 준비하는 마지막 단계는 압착된 조직에 합성된 짧은 올리고 프로브를 하이브리드화하는 것입니다. 최종적으로, 형광 현미경을 사용하여 염색체 상에서 올리고 프로브와 상보적인 서열의 위치를 확인합니다.

기존 방법들과 비교했을 때 이 방법의 주요 장점은 단순함에 있습니다. 대부분의 다른 염색체 및 C2 하이브리드화 방법은 다량의 form amide를 사용한 세척 과정을 포함하며, 이는 비용이 많이 들고 번거로울 수 있습니다. 본 방법은 form IDE 세척이 필요하지 않으므로 더 저렴하고 깔끔하며 빠른 기술입니다.

이 방법은 초파리 뇌의 체세포 염색체 상에서 서열을 가시적으로 매핑하는 간단한 방법을 제공하지만, 다른 생물체의 다양한 조직에서 유래한 다른 유형의 염색체 상의 서열을 매핑하는 데에도 사용할 수 있습니다. 슬라이드를 제작할 때마다 4~5개의 조직을 준비하되, 뇌 해부의 경우에는 그 이상으로 준비하지 마십시오. 우선 방황기 3령 유충을 선택하여 1X PBS 한 방울에 수집하는 것으로 시작합니다.

과밀하지 않은 바이알을 선택하여 수집하십시오. 해부 현미경 하에서 초미세 핀셋을 사용하여 입 갈고리를 잡고, 다른 핀셋으로 몸길이의 3분의 2 지점을 잡으십시오. 그런 다음 입 갈고리를 조심스럽게 당겨 뇌, 복측 신경절, 타액선 및 소화관 일부를 노출시킵니다.

다음으로, 핀셋을 사용하여 뇌와 복측 신경절을 다른 조직에서 분리한 후 플라스틱 플레이트 위의 1X PBS 한 방울 속으로 옮깁니다. 정소 박리를 위해서는 생후 3일 된 수컷 puy를 수집하십시오. 생후 3일 된 puy는 몸이 노란색이며 눈이 붉은색입니다.

날개집(wing pad)이 더 작은 개체가 수컷입니다. 한 쌍의 핀셋으로 흉부 근처의 복부 상단을 잡고, 다른 한 쌍의 핀셋으로 복부의 최말단 끝부분을 잡은 다음, 눈물방울 모양의 정소(testes)를 끌어냅니다.

정소는 가볍게 흔들어 제거할 수 있는 지방체로 둘러싸여 있습니다. 적절한 압착을 방해할 수 있으므로 정소에서 모든 외부 신체 부위를 분리한 후, 깨끗한 플레이트 위의 XPBT 한 방울로 정소를 옮깁니다. 모든 조직을 수집하면 저장액으로 처리하여 자매 염색분체의 분리를 개선합니다. 염색질 영역의 경우, 조직을 0.5% sodium citrate 한 방울에 10분 동안 옮겨 둡니다.

이러한 효과를 얻기 위해 콜히친(colchicine)은 염색체 형태에 아티팩트를 유발할 수 있으므로 권장되지 않습니다. 이제 초정밀 핀셋을 사용하여 조직을 고정하십시오. 깨끗한 sigma coat 처리된 커버슬립 위에 갓 제조한 45% acetic acid 함유 2.5% PFA 20 µL 방울로 조직을 옮깁니다. 고정액 내에서 조직들이 서로 겹치지 않게 고르게 배치하고 실온에서 4분 동안 배양한 다음, 커버슬립 압착(squashing) 과정을 진행하십시오. 먼저 폴리라이신(polylysine) 코팅된 슬라이드를 조직과 커버슬립 위에 뒤집어 가볍게 놓는 것으로 시작합니다.

커버슬립을 누르지 말고 슬라이드 글라스 하단에 밀착시킵니다. 커버슬립을 sigma coat로 처리하면 커버슬립을 제거한 후에도 압착된 조직이 슬라이드에 남아 있도록 하는 데 도움이 됩니다. 하지만 드물게 조직이 커버슬립에 붙어 있을 수 있습니다.

이 단계에서는 조직 압착(tissue squash)을 반복해서 수행하는 것을 권장합니다. 이제 슬라이드를 뒤집어 두껍게 접은 종이 위에 놓으십시오. 그다음 안정적인 표면 위에서 엄지손가락을 사용하여 커버슬립 위를 수직으로 매우 강하게 누릅니다.

커버가 밀리는 방식으로 누르지 마십시오. 그렇지 않으면 조직이 뭉개질 수 있습니다. 보통 매우 강하게 누르면 압착된 조직 내에서 염색체가 잘 분해되어 나타납니다. 하지만 때로는 불완전하거나, 뭉개지거나, 파편화된 염색체와 같이 염색체 품질에 변동성이 있을 수 있습니다.

따라서 다시 한번, 2~3회의 반복 조직 압착(tissue squash)을 수행할 것을 권장합니다. 조립체를 얼음 블록 위에 몇 분간 놓아둔 다음, 액체 질소의 끓음이 멈출 때까지 또는 그보다 더 오래 액체 질소에 담그십시오. 조직이 해동되기 직전에 슬라이드를 꺼낸 후, 새 면도날을 사용하여 커버슬립의 한쪽 모서리를 튕겨 올려 제거하십시오.

조직에 흠집이 나지 않도록 주의하십시오. 그 다음 슬라이드를 100% ethanol이 채워진 coplin jar에 빠르게 넣고 최소 5분 동안 담가둡니다. 슬라이드를 꺼내 조직에 닿지 않게 과잉 ethanol을 닦아내고, 슬라이드를 1시간 동안 자연 건조시킵니다.

이후 슬라이드는 건조 챔버에 수주에서 수개월 동안 보관할 수 있습니다. 먼저 각 프로브 100 nanograms를 1.1 x 하이브리드화 완충액 20 microliters에 첨가하여 1 x 하이브리드화 완충액 용액 22 microliters를 만듭니다. 그다음 혼합액을 고정된 조직 위에 피펫으로 분주하고, 조직을 건드리지 않은 상태에서 커버슬립을 조심스럽게 덮습니다.

조직에 닿지 않는 작은 기포 하나 정도는 문제가 되지 않으나, 그 이상의 기포가 발생했다면 커버슬립을 다시 덮어야 합니다. 슬라이드를 95 °C 히팅 블록의 평평한 면에 놓은 뒤 호일로 덮습니다. 5분 동안 대기하며, 그동안 팁 박스에 젖은 종이 타월을 넣어 습윤 챔버를 준비합니다.

그런 다음 슬라이드를 꺼냅니다. 슬라이드를 파라필름(paraform)으로 조심스럽게 감싸고, 젖은 수건을 넣은 팁 박스로 구성된 습윤 챔버로 옮깁니다. 슬라이드를 챔버 내에서 30 °C로 4시간에서 하룻밤 동안 배양합니다. 이 온도는 GC 함량이 낮은 프로브에 적합하지만, GC 함량이 높은 프로브의 경우 하이브리다이제이션 온도의 최적화 과정이 필요할 수 있습니다.

배양 후, 파라필름을 조심스럽게 제거하고 커버슬립의 한쪽 모서리를 천천히 들어 올립니다. 그런 다음 0.1 XSSC 버퍼에서 15분씩 3회 슬라이드를 세척합니다. 세척하는 동안 빛 노출을 최소화하기 위해 용기를 알루미늄 호일로 덮어줍니다.

길이가 긴 비오틴화 프로브를 사용하는 경우, 다음 단계를 진행하기 전에 rod domine avadon을 첨가하고 세척하십시오. 우선, 조직 주변의 수분을 건조시킨 후 100 µL의 블로킹 용액으로 조직을 덮습니다. 그런 다음 기포가 생기지 않도록 주의하며 새로운 커버슬립을 조심스럽게 덮어줍니다.

다시 슬라이드를 파라필름으로 감쌉니다. 그 후 슬라이드를 37 °C에서 30분 동안 배양합니다. 둘째로, 배양이 끝나면 커버슬립을 제거하고 조직 주변을 와이프로 닦아냅니다.

그런 다음 조직 위에 SBT로 희석한 1:1000 rumine avadon 100 µL를 처리합니다. 블록과 동일하게 슬라이드를 덮고, 감싸서 배양합니다. 마지막으로 커버슬립을 조심스럽게 제거하고 슬라이드를 세척합니다.

4 x SSCs T로 3회 세척한 후, 0.1 XSSC로 3회 세척하십시오. 각 세척 단계는 최소 5분 동안 수행해야 합니다. 프로토콜을 계속하여, 조직에 닿지 않도록 주의하며 과량의 버퍼를 닦아내어 슬라이드를 건조시키십시오.

그 다음, 슬라이드의 조직 면이 위로 향하게 하여 어두운 곳에 10~15분 동안 또는 수분이 완전히 사라질 때까지 둡니다. 이제 DPI가 포함된 vector shield 11 µL를 사용하여 슬라이드를 마운팅하고, sigma coat 처리가 되지 않은 커버 슬립을 조심스럽게 덮습니다. 만약 매질이 모든 가장자리에 닿지 않았다면, 가장자리에서 매질을 몇 µL 더 추가하고 과잉분은 닦아냅니다.

그 다음 커버 슬립을 매니큐어로 밀봉하고, 매니큐어가 마를 때까지(보통 최소 30분 소요) 슬라이드를 어두운 곳에 세워서 보관하십시오. 이후 슬라이드를 -20 °C에서 최대 일주일 동안 보관하고 가능한 한 빨리 조직을 이미지화하십시오. 형광 접합체가 포함된 상용 합성 소형 올리고 세트와 Nick Translation으로 제작된 더 긴 비오틴화 프로브를 여러 서로 다른 조직 유형의 염색체에 모두 하이브리드화하였습니다.

설명된 방법론을 사용하여 Drosophila Melanogaster 359 base pair 위성 반복 서열에 대한 프로브를 통해 X 염색체의 거대한 multi megabase pair 블록과 3번 염색체의 훨씬 작은 영역을 확인하였습니다. 응답자(responder) 위성 서열에 대한 더 긴 프로브는 약 700회의 상대적으로 낮은 반복 횟수로 구성된 반복 블록을 검출하였습니다. 따라서, 이 방법은 매우 작은 위성 블록의 시각화를 가능하게 합니다.

저장액 처리 단계를 10분으로 두 배 늘렸을 때, 자매 염색분체의 분리가 더 증가했습니다. 이 절차는 특정 염색질 단백질이 특정 서열에 위치하는지와 같은 질문에 답하기 위해 항체 염색과 같은 다른 방법들과 결합하여 사용할 수 있습니다.