Name: Polysome 프로파일 링 포유 동물 세포에 선택적 mRNA의 번역 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: 학습하세요 포유동물 세포에서 폴리솜 프로파일링을 이용한 선택적 mRNA 번역 평가 방법을. 초당회분, RT-qPCR을 활용하여 스트레스 조건에서 번역 효율을 분석하고 세포 적응 메커니즘을 규명합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

폴리솜 프로파일링 프로토콜과 데이터 공유에 대한 비판적인 토론을 해준 과거와 현재의 연구실 구성원들, 특히 Urszula Liwak에게 감사드립니다. 이 작업은 캐나다 보건 연구소, 암 연구 협회 및 캐나다 국립 과학 및 공학 연구 위원회에서 MH에 대한 운영 보조금으로 지원되었습니다. MDF는 Vanier Canada Graduate Scholarship Doctoral Award와 Ontario Graduate Scholarship의 지원을 받았으며 이 작업은 그녀의 박사 학위 논문의 일부를 구성합니다.

<ol><li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+in+stress+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li>
<li>Obrig, T. G., Culp, W. J., McKeehan, W. L., Hardesty, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+by+which+cycloheximide+and+related+glutarimide+antibiotics+inhibit+peptide+synthesis+on+reticulocyte+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The mechanism by which cycloheximide and related glutarimide antibiotics inhibit peptide synthesis on reticulocyte ribosomes.</a> J Biol Chem. 246 (1), 174-181 (1971).</li>
<li>Tscherne, J. S., Pestka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+protein+synthesis+in+intact+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Inhibition of protein synthesis in intact HeLa cells.</a> Antimicrob Agents Chemother. 8 (4), 479-487 (1975).</li>
<li>Damgaard, C. K., Lykke-Andersen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+coregulation+of+5%27TOP+mRNAs+by+TIA-1+and+TIAR%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Translational coregulation of 5'TOP mRNAs by TIA-1 and TIAR.</a> Genes Dev. 25 (19), 2057-2068 (2011).</li>
<li>Thakor, N., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRES-mediated+translation+of+cellular+messenger+RNA+operates+in+eIF2alpha-+independent+manner+during+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress.</a> Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).</li>
<li>McKinney, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+reprogramming+of+the+cellular+translational+landscape+facilitates+cytomegalovirus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Global reprogramming of the cellular translational landscape facilitates cytomegalovirus replication.</a> Cell Rep. 6 (1), 9-17 (2014).</li>
<li>Jivotovskaya, A. V., Valasek, L., Hinnebusch, A. G., Nielsen, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+translation+initiation+factor+3+%28eIF3%29+and+eIF2+can+promote+mRNA+binding+to+40S+subunits+independently+of+eIF4G+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic translation initiation factor 3 (eIF3) and eIF2 can promote mRNA binding to 40S subunits independently of eIF4G in yeast.</a> Mol Cell Biol. 26 (4), 1355-1372 (2006).</li>
<li>Gross, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+Loading+onto+the+mRNA+Cap+Is+Driven+by+Conformational+Coupling+between+eIF4G+and+eIF4E%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ribosome Loading onto the mRNA Cap Is Driven by Conformational Coupling between eIF4G and eIF4E.</a> Cell. 115 (6), 739-750 (2003).</li>
<li>Graber, T. E., Baird, S. D., Kao, P. N., Mathews, M. B., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF45+functions+as+an+IRES+trans-acting+factor+that+is+required+for+translation+of+cIAP1+during+the+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">NF45 functions as an IRES trans-acting factor that is required for translation of cIAP1 during the unfolded protein response.</a> Cell Death Differ. 17 (4), 719-729 (2010).</li>
<li>Spriggs, K. A., Stoneley, M., Bushell, M., Willis, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-programming+of+translation+following+cell+stress+allows+IRES-mediated+translation+to+predominate%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Re-programming of translation following cell stress allows IRES-mediated translation to predominate.</a> Biol Cell. 100 (1), 27-38 (2008).</li>
<li>Uniacke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+oxygen-regulated+switch+in+the+protein+synthesis+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An oxygen-regulated switch in the protein synthesis machinery.</a> Nature. 486 (7401), 126-129 (2012).</li>
<li>Liwak, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+suppressor+PDCD4+represses+internal+ribosome+entry+site-mediated+translation+of+antiapoptotic+proteins+and+is+regulated+by+S6+kinase+2%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2.</a> Mol Cell Biol. 32 (10), 1818-1829 (2012).</li>
<li>Occhi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mutation+in+the+upstream+open+reading+frame+of+the+CDKN1B+gene+causes+a+MEN4+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">A novel mutation in the upstream open reading frame of the CDKN1B gene causes a MEN4 phenotype.</a> PLoS Genet. 9 (3), (2013).</li>
<li>Faye, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+composition+of+cellular+internal+ribosome+entry+sites+defines+dependence+on+NF45+and+predicts+a+posttranscriptional+mitotic+regulon%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nucleotide composition of cellular internal ribosome entry sites defines dependence on NF45 and predicts a posttranscriptional mitotic regulon.</a> Mol Cell Biol. 33 (2), 307-318 (2013).</li>
<li>Zong, Q., Schummer, M., Hood, L., Messenger Morris, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+translation+state%3A+the+second+dimension+of+high-throughput+expression+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">RNA translation state: the second dimension of high-throughput expression screening.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (19), 10632-10636 (1999).</li>
<li>Bunnik, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+profiling+reveals+translational+control+of+gene+expression+in+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> Genome Biol. 14 (11), (2013).</li>
<li>Choudhuri, A., Maitra, U., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+initiation+factor+eIF3h+targets+specific+transcripts+to+polysomes+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Translation initiation factor eIF3h targets specific transcripts to polysomes during embryogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), 9818-9823 (2013).</li>
<li>Corbin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fragile+X+mental+retardation+protein+is+associated+with+poly%28A%29%2B+mRNA+in+actively+translating+polyribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">The fragile X mental retardation protein is associated with poly(A)+ mRNA in actively translating polyribosomes.</a> Hum Mol Genet. 6 (9), 1465-1472 (1997).</li>
<li>Riley, A., Jordan, L. E., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+5%27+UTRs+regulate+XIAP+expression+under+normal+growth+conditions+and+during+cellular+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Distinct 5' UTRs regulate XIAP expression under normal growth conditions and during cellular stress.</a> Nucleic Acids Res. 38 (14), 4665-4674 (2010).</li>
<li>Thermann, R., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+miR2+induces+pseudo-polysomes+and+inhibits+translation+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drosophila miR2 induces pseudo-polysomes and inhibits translation initiation.</a> Nature. 447 (7146), 875-878 (2007).</li>
<li>Darnell, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FMRP+stalls+ribosomal+translocation+on+mRNAs+linked+to+synaptic+function+and+autism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism.</a> Cell. 146 (2), 247-261 (2011).</li>
<li>Graber, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivation+of+stalled+polyribosomes+in+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Reactivation of stalled polyribosomes in synaptic plasticity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (40), 16205-16210 (2013).</li>
<li>Wang, Y., Ringquist, S., Cho, A. H., Rondeau, G., Welsh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+polyribosome+fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">High-throughput polyribosome fractionation.</a> Nucleic Acids Res. 32 (10), (2004).</li>
<li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li>
<li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+profiling%3A+new+views+of+translation%2C+from+single+codons+to+genome+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale.</a> Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).</li>
<li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li>
</ol>

저자는 공개할 것이 없습니다.

Polysom​​al 프로파일은 상이한 처리 조건 하에서 특정 전 사체의 번역의 상태를 정량화 할 수있는 강력한 기술이다. 그것은 원칙적으로 매우 간단한 기술이다 ​​그러나 그것은 좋은 polysom​​e 프로필을 생성에 중요한 일부 실행의 여러 단계가 필요합니다. 1)의 RNase가없는 화학 물질과 plasticware에를 사용, 2) (좋은 자당 그라디언트를 준비하는 우리의 경험에 10-50% 자당 그라디언트를 효율적으로 결합 리보솜 40 / 60S 서브 유닛과의 mRNA)을 해결하기위한 가장 좋은 일, 3 : 다음과 같은 주요 단계는 ) 번역의 최고 속도를 캡처하기 위해 지수 적으로 성장 세포와 더 이상 80 % 합류를 사용. 이러한 유전자 과발현 또는 최저 한 세포 치료제를 수행 할 때 플레이트에 세포의 양이 세포가 엔드 포인트에서 컨 플루 언트 될 정도의 함수일 수 있도록 이러한 후자 단계는, 고려되어야한다. 결과에서 presen와여기 테드, polysome 프로필 분석을 IRES-숨겨의 mRNA XIAP와 Bcl-xL 발현 (12)의 번역 조절에 PDCD4의 역할을 평가하기위한 중요한 도구였다. 우리가 PDCD4 노크 다운 (그림 1B)에 따라 일반 polysome 프로파일의 변화를 관찰하지 않은 사실은 우리가 PDCD4 실험의 조건에서 글로벌 휴대폰 번역을 손상하지 않았다고 결론을 내릴 수있었습니다. 우리는 다음 PDCD4 또는 제어 siRNA를 처리 한 세포에서 XIAP와 Bcl-xL 발현의 mRNA의 분포를 결정하기 위해 RT-qPCR에 분석을 사용 하였다. 이 mRNA의 분포의 정량적보다는 반 정량 분석​​과 치료 사이의 번역 효율에 미묘한 변화의 검출을 허용하기 때문에 qPCR에은, 표준 RT-PCR 또는 노던 블롯 반대로, polysom​​e 프로파일을 분석하기위한 선택 방법이다. 이 기술을 사용하여, 우리는 XIAP와 Bcl-xL 발현의 mRNA의 분포가 (gr에 걸쳐 총 타깃 mRNA를 백분율로 표시 것을 보여줄 수 있었다adient)는 크게, 따라서 이들의 mRNA의 번역의 증가를 나타내는, PDCD4 노크 다운 (그림 1D, E) 후 그와 관련된 리보솜의 큰 숫자)와 함께 무거운 polyribosomes (의 mRNA로 이동했다. 이는 더욱 XIAP 및 Bcl-xL 발현 단백질 수준에서 아니지만 그들의 정상 RNA 수준 (도 1F, G)의 상승에 의해 확인 하였다. 중요한 것은, XIAP의 비 IRES 변이체의 polysome 분포는 처리 및 미처리 세포 (도 1C) 사이에서 불변이었다. 대안으로, 번역 효율은 14 (일반적으로 2-4을 분획) 대 monosomes polysomes mRNA의 함량의 비 (일반적으로 5-10 분획)로 제시 될 수있다. 254 nm에서 흡광도 판독 값에서 피크가 관찰이 독자적으로 리보솜 RNA (세제에 기인 할 수 없기 걸쳐 제어 프로토콜의 사용은 결과를 프로파일 링하는 polysom​​e 검증 중요예컨대 트리톤 X-100 등의 강하게) 스펙트럼의이 영역에서 흡수하고 구배 상단 40 / 60S 피크를 가릴 수있다. 해물없이 및 / 또는 해물 버퍼 빈 그라데이션을 254 nm에서의 흡광도에 버퍼의 상대적 기여도를 결정하기 위해 실행해야합니다. Artefactual 고차 구조는 사실 없음에 (예 : &quot;의사 polysomes&quot;20)가 polysomes의 잘못된 해석으로 이어질 수 있습니다. 마그네슘 금속 이온 봉쇄 2가 양이온의 킬레이트 EDTA와 (80S 리보솜을 안정화하는 절차 전반에 걸쳐 사용은) 큰 (60S를 그 구성 요소 작은 (40S)에 리보솜의 분리를 일으킬 것 해물과 그라데이션 버퍼 (15 분 20 mM의)에 추가 ) 서브 유닛. 260 nm에서 기록 된 흡광도 피크 polysom​​es 실제로 경우 따라서, EDTA 처리를 단일 최대의 mRNA 리보좀 단위를 자유롭게 대응 구배의 상단 부근에 관측 될되도록 프로파일을 축소한다 (데이터는 미도시). 일치하는프로파일의 EDTA에 의한 붕괴, qPCR에 의해 분석 특정 대상의 모든 이제 그라데이션의 맨 위에 있어야합니다. mRNA의 리보솜과 연관된 수는 항상 특정의 mRNA가 번역되는 것을 얼마나 효율적의 지표 아니다. 실제로, polysomes에 활성 번역은 독자가 알아야 할 21, 22 정체가되는 특정 상황이 있습니다. 성적표 적극적 EDTA 달리 &#39;유거수&#39;적극적 mRNA에 걸쳐 전좌되는 리보솜 발생 퓨로 마이신으로 샘플을 처리)하여 수행 할 수 번역 기계 결합, 또는 b) 샘플을 처리할지 여부를 결정 다시 다운 스트림 전좌 리보솜의 &#39;실행 - 오프&#39;를 일으키는 원인이되는 개시 코돈에서 첫 번째 리보솜의 전위를 억제 homoharringtonine와. qPCR의 분석을위한 제어 사체의 사용은 중요하다. SELEC이러한 XIAP IRES의 비 IRES 변형 일부 가사 유전자 (GAPDH, 액틴, 튜 불린, 뉴 클레), 리보솜의 mRNA (18S, RPL13A) 나이 경우 다른 처리 조건에 의해 영향을받지 않는 성적 증명서의 기는 중요하다 검증 번역에 대한 치료의 효과는 특정 또는 일반화 된 경우. 이러한 제어 사체 여기 행해졌으로 분석의 mRNA의 분포를 정규화하는데 사용될 수있다 (XIAP와 Bcl-xL 발현의 mRNA는 GAPDH의 mRNA로 정규화하고 각 분획의 mRNA 함량의 합으로 표시되는 총 mRNA의 함량의 백분율로 표현 하였다 ) 또는 대안 적으로, 제어 대상의 mRNA가 절대 값으로 표현하고 개별적으로 도시 될 수있다. 입력 용 해물 (총 용적의 통상 10 %)의 qPCR의 분석은 특정의 mRNA 분포를 통제 할 다른 공정이다. 이상적으로는, 입력 용 해물에서 특정 mRNA의 전사의 함유량을 분석 한 10 개의 분획의 mRNA 함량의 합과 비교되어야한다. 최종적으로, 옵션 단계를 페놀 제어 : 클로로포름 추출 단계 (CAT는, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼 라제와 같은) 후속 qPCR에 의해 정량화 될 심지어 사용할 수 정상화 관내 전사 리포터 mRNA를 각각 polysome 분획 스파이크하는 데이터 (14). 어떤 기술과 마찬가지로, polysom​​e 프로파일 링은 몇 가지 제한 사항을 제시한다. 통상 10 분은 최소 좋은 polysom​​e 분포를 갖기 위해 수집 할 필요가 (변환 효율의 미묘한 변화가 20 이상이 필요할 수 있음)이 있다는 사실이 단계 4 샘플 만 최대가 될 수 있다는 점에서, 제한적인 만든다 한 번에 분석하는 것이 편안 한번에 RNA 추출 및 40 샘플 4 입력 컨트롤 qPCR의 분석을 처리 할 수​​ 있어야한다. 샘플 크기는 쉽게 qPCR을 수행하는 복제 얼마나 많은 성적을 분석 할 수 있습니다 얼마나 많은에 추가 할 수 있습니다, 이것은 비용이 많이들 수 있습니다. qPCR에 기반 polysom​​al 프로파일 링의 또 다른 제한nalysis 그것만 (성적이 미리 공지되어 분석 될 수있는)와 번역의 전체 게놈 분석에 적용 할 수없는 후보 기반의 접근법에서 수행 될 수 있다는 것이다. 그러나, 21 세기의 시작 부분에, 연구자들은 DNA를 사용하여 게놈 수준에서 자신의 polysomal의 RNA를 심문하기 시작 차세대 시퀀싱 (16, 17)와 함께 최근에는 15을 마이크로 어레이. 오히려 개별 분수의 qPCR에 분석을 수행하는 것보다 것을 제외하고는이 프로토콜에 설명 된대로이 강력한 접근 방식에서, polysom​​al 프로파일 링을 수행 할 글로벌 번역 분수 (일반적으로 분수 2-4)와 polysom​​es 분수 (일반적으로 분수) 함께 풀링 및 변형 분석 monosomes DNA 마이크로 어레이 또는 전체 게놈 RNA 서열 분석에 의해. 따라서이 방법, 그것을 평가하기 위해 가능한 모든 누구의 분포 변화 polysom​​es에서 monosomes에 (번역 감소) 또는 반대 (번역 증가) 특정 치료시의 mRNA, 표준. 특정 mRNA의 polysom​​es 분포의 확인 및 정량화는 다음 qPCR을 수행 할 수 있습니다. polysom​​al 프로파일 원리의 더 강력한 사용 리보솜 프로파일입니다. 이 기술의 더 높은 처리량 확장 polysome 분수 (23)의 수백을 동시에 모니터링 할 수가 최근에보고되었다. 돌연변이의 수집 또는 대규모의 RNAi 화면에서 병진 효율 프로빙 때 명확한 이점을 제공한다. 리보솜 프로파일은 단백질 합성에 관여 24,25 리보솜 (리보솜 발자국)에 의해 보호 RNA 단편을 매핑 차세대 시퀀싱을 활용하는 기술이다. 이 기술에서, 리보솜 전좌는 사이클로 헥시 미드 (양면) 또는 emetine (돌이킬 수없는) 리보솜 발자국의 인구를 산출하기 위해 세포 용해 및 RNA 분해 효소 소화 다음으로 억제 할 수있다. 리보솜은 충실 총 RNA는 고립되고, 오염 리보솜과 미토콘드리아 리보솜 RNA가 제거됩니다.약 26 ~ 28 뉴클레오티드 RNA 발자국이 절연되어, cDNA 라이브러리로 변환, 전사 26 염기 서열을 리버스. 표준 polysom​​e 프로파일과는 달리,이 방법뿐만 아니라 병진 규제 특정의 mRNA를 식별뿐만 아니라, 특정 성적 증명서를 따라 정확한 직업과 리보솜의 밀도 코돈 해상도에서 mRNA의 관련 정보를 얻을 수 있습니다. 이 발생하는 경우 성적 증명서 리보좀 모집에 대한 자세한 정보를 제공 할 수 있기 때문에 이것은, 특히 IRES-숨겨의 mRNA로 번역의 특정 모드와의 mRNA에 대한 관심이다.

단백질 합성 (번역)의 규정은 밀접하게 세포의 생존에 연결된 키 세포 과정이다. 번역은 세포의 에너지의 50 % 이상을 소비하는 감안할 때, 그것은 번역이 밀접하게 규제되어 있고 번역의 동요가 잘 용납하지 않는 것은 놀라운 일이 아니다. 반대로, 많은 비정상적인 세포 과정은 번역 기계 및 변환 출력 (즉, 프로테옴)을 수정해야 할 것을 요구하고 있습니다. 이것은 종종 다양한 스트레스 반응 및 질병 상태에있는 경우, 그리고 아마도 가장 좋은 암을들 수있다. 병진 제어의 주요 이점은 빠르게 다양한 내부 및 외부 트리거에 응답하여 단백질 출력을 재 프로그래밍하는 세포의 능력하여 미세 조정기구 인 것을 조언 세포 생존 및 사망 한 간의 균형. 번역 제어의 두 가지 측면이 특히 재미있다; 규제 MEC의 본질에 대한 이해처음에 선택적 번역을 유발하는 특정 트리거에 대한 세포 반응에 참여 hanism (들) 및 제어 특정 번역을 허용 요소, 특정의 mRNA의 식별과 단백질 제품. Polysom​​e 프로파일 링은 두 프로세스의 효과적인 학습을 할 수있는 기술이다. polysom​​e 프로파일 링 기술의 전반적인 목표는 공부하고 다른 세포 조건에서 특정의 mRNA의 번역 상태를 정량화하는 것입니다. 기술의 원리에 따라서, 수 크로스 구배에서 초 원심 분리에 의해 얻어진 polyribosomes를 &#39;동결&#39;다른 사체에 적극적 번역 리보솜과 분리 &#39;(몇 리보솜에 의해 결합) 높은 변환 전 사체 사이의 구별을 허용함으로써 mRNA의 번역을 캡처하는 것 가난 (하나 또는 두 개의 리보솜에 의해 구속) 사람들을 번역했다. 이 특정 프로토콜에서, 항생제 사이클로 헥시 미드는 결합이60S 리보솜 아 단위 및 블록 리보솜 E 사이트 2에서 탈 아세틸 화의 tRNA의 출시는, 리보솜 전좌를 억제하고 번역의 mRNA에 리보솜 실속하는 데 사용됩니다. 그러나, 블록 변환 신도 3, 사용될 수있다 emetine 다른 차단제. 웨스턴 블 롯팅 및 번역 처리의 최종 출력을 측정 35 S-메티오닌 표지 기술과는 달리, 따라서 다른 조건 하에서 번역 메커니즘의보다 상세한 연구를 허용 프로파일 적극적 번역의 mRNA와 리보솜 연계를 측정하는 장점을 갖는다 polysome. 따라서,이 기술을 쉽게 구체적 번역 4-6의 다양한 모드를 연구하기에 적합 할 수있는, 단백질 인자 번역 조절 7-9, 단백질 합성 1,10,11 또는 상류 IRES 또는 mRNA의 구조의 효과에 영향을 미치는 스트레스 조건에 관여 단백질 신디사이저에 개방 판독 프레임ESIS 12-14. 요즘, polysome 프로파일 응용 프로그램도 넓은 polysomes 관련의 mRNA를 분석 할 수있는 DNA 마이크로 어레이 (15) 또는 차세대 시퀀싱 16, 17의 사용에 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Gradient Master 108 자동 그라디언트 메이커</td><td>BIOCOMP</td><td>107-201M</td><td></td></tr><tr><td>Auto Densi-Flow 투챔버 그라디언트 메이커</td><td>LABCONCO</td><td>4517000</td><td></td></tr><tr><td>Beckman 초원심분리기&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>모델 # L-100-XP</td><td></td></tr><tr><td>밀도 그라디언트 분획기</td><td>TELEDYNE ISCO</td><td>69-3873-246</td><td>구성: 튜브 피어싱 시스템,&nbsp; 연동 펌프, UA-6 검출기와 254 및 280 nm 필터 및 Foxy R1 분획 수집기</td></tr><tr><td>WinDaq 데이터 수집 소프트웨어</td><td>DATAQ INSTRUMENTS</td><td>WINDAQ/LITE</td><td></td></tr> <tr><td>http://www.dataq.com/products/software/acquisition.htm폴리알로머 초원심분리기 튜브(SW41용, 14 x 89 mm)</td><td>벡크만쿨터</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>뉴클레아제가 없는 2ml 원심분리기 튜브(돌고래 코)</td><td>DiaMed</td><td>PRE1900-N</td><td></td></tr><tr><td>뉴클레아제가 없는 2ml 원심분리기 튜브(평평한 바닥)</td><td>SafeSeal</td><td>12000</td><td></td></tr><tr><td>수크로스(뉴클레아제 없음)</td><td>Calbiochem</td><td>573113</td><td>MW = 342.3 g/mol</td></tr><tr><td>시클로헥시미드</td><td>SIGMA</td><td>C7698</td><td>MW = 281.4 g/mol. DMSO에서 재현탁하고 장기간 sotrage를 위해 -80C로 유지하십시오. 주의: 독성! 호흡기 및 피부 자극을 유발할 수 있습니다. 체중을 잴 때 마스크를 착용하십시오.</td></tr><tr><td>염화나트륨 (뉴클레아제 없음)</td><td>OmniPur</td><td>7710</td><td>MW = 58.44 g/mol</td></tr><tr><td>MgCl2.6H2O (뉴클레아제 없음)</td><td>OmniPur</td><td>5980</td><td>MW = 203.3 g/mol</td></tr><tr><td>트리스 염기(뉴클레아제 없음)</td><td>J.T. Baker</td><td>4109-01</td><td>MW = 121.14 g/mol</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>OmniPur</td><td>9400</td><td>주의: 독성! 호흡기 및 피부 자극을 유발할 수 있음</td></tr><tr><td>재조합 RNasin Ribonuclease Inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2515</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap Rnase 불활성화 용액</td><td>Ambion, Life Technologies</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/ml)</td><td>Invitrogen, Life Technologies</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td><td>Ambion, Life Technologies</td><td>AM9722</td><td>주의: 독성이 있습니다! 호흡기 자극뿐만 아니라 피부 자극 및 부식을 유발할 수 있습니다.</td></tr></tbody></table>

polysom​​e 프로파일 링 포유 동물 세포에 선택적 mrna의 번역 평가

Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

단백질 합성의 규정은 스트레스에 대한 세포 반응의 핵심 제어 지점을 나타냅니다. 특히 신중한 RNA 조절 요소는 전형적 특정 스트레스 반응에 필요한 단백질 인코딩 특정 mRNA를, 선택적으로 번역 할 수 있도록 도시 하였다. 이들의 mRNA뿐만 아니라 선택적 번역에 대한 책임을 규제 메커니즘의 특성의 확인은 시간에 대한 분자 생물학의 최전선에있다. Polysom​​e 프로파일 링은이 연구의 초석 방법이다. polysom​​e 프로파일의 목적은 서로 다른 사체에 적극적 번역 변이를 고정화함으로써 mRNA의 번역을 캡처하고, 따라서 높은 번역 사체 저​​조한 번역들 사이의 구별을 허용 자당 구배 초 원심 분리에 의해 얻어진 polyribosomes를 분리하는 것. 이것들은 추가의 전통적인 생화학 및 분자 생물학 방법을 특징으로 할 수있다. 중요한 것은, 결합 P높은 처리량 게놈 접근 방식과 olysom​​e 프로파일 링은 번역 규제의 대규모 분석을 할 수 있습니다.

우리는 최근 세포 사멸 억제제 XIAP와 Bcl-xL 발현 (12) 인코딩의 mRNA을 IRES이-은닉의 선택 번역 억제제로 종양 억제 PDCD4위한 새로운 역할을 설명했다. Polysom​​e 프로파일 링은 IRES 매개 번역 PDCD4의 구체적인 참여 방법을 설명하기 위해 핵심 기술이었다. HEK293 세포는 일시적 PDCD4 (도 1a)의 내인성 수준을 고갈 형질 다음 프로파일 분석 polysome 행 하였다. 우리는 siCTRL 및 siPDCD4 처리 된 세포 (도 1B)를 비교 polysome 프로파일의 변화의 부족 것으로 판단 PDCD4의 감소 수준, 글로벌 셀룰러 번역을 저해하지 않은 것이 관찰. 마찬가지로, XIAP (19)의 비 IRES 변형의 polysome 분포는 치료 및 치료 세포 (그림 1C) 사이의 변화는 없었다. 대조적으로, 두 IRES-은닉의 mRNA polysom​​e 분포, XIAP 및 Bcl-xL 발현이 유의하게 변경 하였다. P가없는DCD4 이들 두개의 mRNA의 분포가 무거운 ribopolysomes (도 1D, E)로 이동된다. 이것이 XIAP와 Bcl-xL 발현 mRNA에 (도 1F)이 결과의 정상 상태 수준의 변화를 수반하지 않기 때문에 더 웨스턴 블 롯팅 (도에 의해 확인 하였다 감소 PDCD4 수준으로 세포에서 XIAP와 Bcl-xL 발현의 번역을 향상을 보여줍니다 1G). <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52295/52295fig1highres.jpg" /> 그림 1 :. Polysome 프로파일 링 XIAP와 Bcl-xL 발현 번역의 선택적 억제제로 PDCD4를 식별 (A) HEK293 세포 PDCD4의 siRNA 또는 컨트롤 (CTRL)로 처리하고, 안티 PDCD4에 용해 및 웨스턴 블롯 분석을의 siRNA를, 비 대상 안티 뉴 클레 항체는. PDCD4 노크 다운의 정도를 확인 (B) PDCD4가 (A)에서와 같이 무너 뜨렸다하고합니다세포 용 해물은 프로파일 polysom​​e 행 하였다. 대표 polysom​​e 프로필은 상단 패널에 표시됩니다; XIAP 비 IRES (C)의 분포는, GAPDH의 상대적인 Bcl-xL 발현 (D), 및 XIAP IRES (E)의 mRNA 각 분획 총 mRNA를 백분율 (%의 mRNA)로 표시된다. (F) 정상 -state mRNA 수준은 PDCD4의 siRNA 또는 제어 (CTRL) siRNA를 처리 한 세포의 RT-qPCR에 의해 측정 하였다. (G)로부터의 용 해물 (A)과 같은 항 - XIAP, 안티 Bcl-xL 발현과 함께 웨스턴 블롯 분석을 실시 안티 뉴 클레 항체. (NB. 데이터는 원래 12 년에 출판 된 그림 1에 제시) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52295/52295fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

스트레스에 적응하는 세포의 능력은 세포의 생존에 매우 중요합니다. mRNA 번역의 조절은 그러한 적응 전략 중 하나로, 단백질체의 빠른 조절을 제공합니다. 여기에서는 스트레스 조건에서 선택적으로 번역되는 특정 mRNA를 식별하기 위해 표준화된 폴리솜 프로파일링 프로토콜을 제공합니다.

Polysom​​e 프로파일 링 포유 동물 세포에 선택적 mRNA의 번역 평가

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...

다음 실험의 전반적인 목표는 폴리리보솜의 고정 및 분리를 통해 번역 효율이 높은 mRNA와 낮은 mRNA를 구분하는 것입니다. 이를 위해 먼저 세포에 cyclo heximide를 첨가하여 리보솜의 전위와 RNA 번역을 억제합니다. 두 번째 단계로, 처리된 세포의 용해물을 수크로스 밀도 구배에 로딩하고 초원심분리를 수행하여 저장된 폴리리보솜을 질량에 따라 분리합니다.다음으로, 마지막 단계에서 번역 효율이 높은 전사체와 낮은 전사체를 분리하기 위해 그래디언트를 동일한 분획으로 나눕니다. 각 분획 내에 목적 mRNA가 존재하는지 확인하기 위해 R-T-Q-P-C-R을 사용합니다. 궁극적으로 리보솜 프로파일링을 통해 다양한 생리적 및 병리적 스트레스에 반응하여 mRNA의 전반적인 번역 및 특정 번역의 변화를 검출할 수 있습니다.PolyOne 프로파일링은 S 스트레스 동안 어떤 mRNA가 선택되고 번역되는지, 그리고 이를 통해 세포가 이러한 조건에 어떻게 적응하는지와 같은 분자 및 세포 생물학 분야의 핵심 질문에 답할 수 있습니다. 이 절차의 시연은 실험실 대학원생에 의해 진행됩니다. 자동 농도 구배 제조기를 사용하여 수크로스 구배를 준비하려면, 먼저 구배 제조기의 전원을 켜고 구배를 담을 플레이트의 수평을 맞춘 후, 플레이트 수평이 맞춰지면 완료를 클릭하십시오.그 다음 그래디언트 프로그램을 선택하려면, grad 메뉴를 열고 리스트를 선택하십시오. SW 41을 클릭한 후, 10~50% 그래디언트 11단계 프로그램이 보일 때까지 리스트를 스크롤하고 Use를 누르십시오. 다음으로 SW 41 원추형 초원심분리 튜브를 마커 블록에 넣고, 제공된 정밀 튜브 마커를 사용하여 블록의 상단 단계에 맞춰 튜브에 선을 그으십시오.튜브를 안정적인 표면의 적절한 랙에 배치한 다음, 제공된 두 개의 캐뉼라를 10 milliliter 시린지 두 개에 연결합니다. 활성화 용액 내의 RNA가 포함된 따뜻한 증류수를 시린지로 몇 번 빨아들였다가 내뱉으며 세척합니다. 그 후 물의 흔적을 모두 제거하고, 시린지 하나에 10% sucrose와 cyclo heide를 혼합하여 채운 뒤, 초원심분리 튜브 바닥에 캐뉼라를 삽입합니다.기포가 생기지 않도록 주의하면서, 튜브에 표시된 선을 살짝 넘을 때까지 용액을 천천히 분주합니다. 그런 다음 다른 시린지에 50% sucrose와 cyclo heximide 혼합액을 채우고, 와이프로 튜브에 묻은 여분의 액체를 닦아냅니다.캐뉼라를 사용하여 50% sucrose 용액을 튜브에 천천히 주입하고, 용액이 표시선과 일치하면 멈춘 뒤 캐뉼라를 빠르고 부드럽게 제거하십시오. 10% sucrose 용액이 상승하여 튜브 상단에 메니스커스를 형성해야 합니다. 다음으로, 초원심분리 튜브를 약간 기울여 기포를 제거하고 캡을 씌운 후, 마이크로 피펫을 사용하여 캡의 리저버에 남아있는 과잉 액체를 제거하십시오.튜브를 그라디언트 메이커 위에 놓고 실행 버튼을 누릅니다. 이때 플레이트가 지정된 각도로 기울어지게 됩니다. 5초 동안 일시 정지한 후, 그라디언트를 형성하기 위한 회전이 시작됩니다.약 2분 후, 기기에서 비프음이 울리면 구배 형성이 완료되었음을 나타냅니다. 튜브를 랙으로 조심스럽게 옮기고, 구배가 흐트러지지 않도록 위쪽 방향으로 빠르게 캡을 제거하십시오. 그다음, 미리 준비한 세포 용해물을 각 sucrose 구배에 260 units씩 동일하게 조심스럽게 로딩하고, 초원심분리기로 260, 343 times G 및 4°C에서 1시간 30분 동안 원심분리하십시오.구배 분획 시스템 장치를 설정하려면 먼저 분광광도계를 켭니다. 그다음 폴더 아이콘을 두 번 누르고 리턴 화살표를 두 번 눌러 홈 화면으로 돌아간 후, 분획 수집기의 밸브가 폐기물로 설정되도록 분획 수집기를 PolyZone 방법으로 설정합니다. 휴지통 아이콘을 가리키는 화살표를 클릭한 다음, 증류수가 담긴 250 milliliter MIA 플라스크를 폐기물 수집 튜브 아래에 놓습니다.이제 차트 기록기에서 다음과 같은 설정을 선택하십시오. 감도 다이얼을 램프 및 광학계 설정으로 맞추고, 노이즈 필터 스위치를 1.5로 설정합니다. 피크 분리 다이얼은 off로, 차트 속도 다이얼은 30 centimeters per hour로 설정하고, 분광광도계 본체 상단의 베이스라인 조정 다이얼을 max open으로 맞춥니다. 그런 다음 펌프에 시린지와 배럴을 장착하고, 제공된 나사와 육각 렌치를 사용하여 단단히 고정하십시오.rev 명령어를 빠른 속도로 사용하여 시린지를 chase 용액으로 채웁니다. 그런 다음 펌프를 수직 위치로 두고 forward 명령어를 사용하여 튜빙 내의 공기를 밀어냅니다. 다음으로 RNAs free water가 채워진 초원심분리 튜브를 홀더에 장착한 후, 두 개의 검은색 표시선이 보일 때까지 캐뉼라로 튜브를 관통합니다.분주 구멍은 두 표시 사이에 있습니다. 시린지 펌프를 전진 수동 모드로 설정하여 6.0 milliliters per minute의 속도로 작동시킵니다. 체이스 용액이 튜브의 1/3을 채우면, 유속을 1.0 milliliters per minute의 가변 속도로 전환하십시오.이제 분광광도계의 베이스라인 조정 다이얼을 돌려 차트의 전압이 0이 되도록 합니다. 그러면 물이 폐액 튜브를 통해 el Mya 플라스크로 배출되기 시작합니다. 그 다음, 원하는 감도를 1.0 au로 설정하십시오.감도가 조정되면 baseline 버튼을 누르고 레코더의 offset 다이얼을 돌려 차트 레코더의 10% 표시선에 맞게 베이스라인 설정을 조정합니다. 베이스라인이 안정되면 펌프 스위치와 차트 속도 다이얼을 off로 돌립니다. 펌프가 꺼지면, chase 용액이 천자 캐뉼라의 첫 번째 표시선에 도달할 때까지 회수하기 위해 스위치를 rev 위치로 전환합니다.그 후 원심분리관을 제거하고, 소량의 체이스 용액(chase solution)으로 캐뉼라 내의 기포를 분산시킨 다음, 그라디언트를 분획하는 동안 플로우 셀에서 누출되었을 수 있는 잔류수를 닦아냅니다. 다음으로, sucrose 그라디언트가 들어 있는 원심분리관을 홀더에 설치하고 캐뉼라로 관을 관통시킵니다. 그런 다음 2 mL 마이크로 원심분리관 10개를 분획 수집기 트레이의 2번부터 11번 위치에 배치하고, 캡이 위로 튀어나오지 않도록 1번 위치에 웨이스트 튜브(waist tube)를 배치합니다.펌프 제어 다이얼을 수동으로 설정하고 시린지 펌프의 유속을 6.0 milliliters per minute로 설정하십시오. 그 다음, 암(arm)이 첫 번째 튜브에 도달하는 즉시 분획 수집기의 재생 버튼을 누르십시오. 일시 정지 버튼을 눌러 암의 위치를 잡고 분획 분주 밸브를 여십시오.그런 다음 정방향(forward) 명령을 사용하여 펌프를 가동하고 차트 기록계 펜을 모니터링합니다. 펜이 위쪽으로 굴절되기 시작하여 시료가 플로우 셀을 통과하고 있음이 확인되면, 폐액 튜브를 1번 튜브로 빠르게 교체하십시오. 첫 번째 방울이 수집되면 즉시 명령을 원격 시작(remote start), 정지(stop), 그리고 분당 1.0 milliliters로 전환하고 재생(play) 버튼을 눌러 분획 수집기 인터페이스가 매 분마다 1 milliliter 분획을 수집하도록 합니다.마지막으로, 파란색 추적 용액이 마지막 튜브에 들어가면 정지 버튼을 누릅니다. PolyZone 프로파일링은 IRA 매개 번역에서 PDCD4의 특이적 관여를 입증하는 핵심 기술입니다. 예를 들어, 본 실험에서는 HEC 2 93 세포를 일시적으로 형질전환시켜 내인성 PDCD4 수준을 고갈시킨 후 PolyZone 프로파일 분석을 수행하였습니다.PolyZone 프로파일에 변화가 없었다는 점에서 알 수 있듯이, PDC D four의 수준을 낮추어도 해당 유전자의 전반적인 번역은 저해되지 않았습니다. SI 대조군과 IPD CD four 처리 세포를 비교했을 때, 비-IRAs 변이체인 XIAP의 폴리솜 분포는 처리 여부와 상관없이 동일했습니다. 이와 대조적으로, IS를 보유한 두 mRNA인 XIAP와 BCL XL의 폴리솜 분포는 유의미하게 변화되었습니다.PD CD4가 없을 때, 이 두 mRNA의 분포는 무거운 리보솜 쪽으로 이동했습니다. 이는 XIAP 및 BCL XL mRNA의 정상 상태 수준 변화를 동반하지 않았으므로, 이러한 결과는 Western blotting으로 추가 확인한 바와 같이 PDC D four 수준이 감소한 세포에서 XIAP 및 BCL XL의 번역이 강화되었음을 입증합니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 Sucrose 구배를 준비하고 초원심분리를 통해 폴리솜을 분리하여 mRNA 번역을 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

assessment-selective-mrna-translation-mammalian-cells-polysome

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 문서는 진핵 세포의 변이를 번역의 추출을위한 프로토콜을 설명합니다. 일단 추출된, 리보솜은 다른 ribosomal 인구가 분석 수 있도록 자당 기울기 분별 (분리)에 의해 monosomes 및 polyribosomes로 구분됩니다. 따라서이 방법은 번역의 규정을 조사를위한 황금 표준입니다.

진핵세포 Polyribosome 프로필 분석

여기, 우리는 조건을 강조하는 응답 진핵 세포의 mRNA의 번역 개시의 변화를 분석하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 비 번역 리보솜에서 리보솜을 번역 자당 기울기의 속도 분리에 근거한다.

Polysom​​e 프로파일에 의한 스트레스 조건에서 번역 개시 분석

리보솜은 단백질 합성에 중요한 역할을한다. 자당 밀도 구배 원심 분리하여 Polyribosome (polysom​​e) 분별은 게놈 전체의 규모에 개인의 mRNA의 번역 효율을 직접 측정 할 수 있습니다. 또한,이 방법은 신호 전달 분자 샤페론 및 리보솜과 같은 polysom​​e - 관련 인자의 생화학 적 분석에 이용 될 수있다.

게놈 전체 규모에 Polysom​​e 분별과 포유류 Translatomes 분석

Translating Ribosome Affinity Purification(TRAP)은 mRNA의 세포 유형별 번역을 캡처할 수 있습니다. 여기에서 우리는 초파리 배아의 희귀 세포 집단에서 mRNA를 분리하는 데 전념하는 최초의 TRAP 프로토콜을 보고합니다.

희귀 세포 집단에서 TRAP-RC, 번역 리보솜 선호도 정화<em&gt; 초파리</em&gt; 배아

이 프로토콜은 결합된 리보솜의 수를 기준으로 식물 조직에서 전사체를 추출하고 분획하는 쉬운 방법을 설명합니다. 이를 통해 translation activity의 전반적인 추정치와 특정 mRNA의 translational status 결정을 수행할 수 있습니다.

공장 Polysom​​e 프로파일 링을위한 쉬운 방법

이 원고 시각화 및 subcellular 구획에서 지역화 된 번역 이벤트를 계량 하는 방법을 설명 합니다. 이 원고에 제안 접근 기본 confocal 이미징 시스템 및 시 약을 필요로 하 고 신속 하 고 비용 효율적인.

정량적 면역 형광 측정 글로벌 현지화 번역

Polysome 프로 파일링 기술의 전반적인 목표 단백질 합성 하는 동안 개별 mRNAs 또는 transcriptome mRNAs의 변환 활동의 분석입니다. 방법은 단백질 합성 규제, 번역 활성화 및 건강과 여러 인간의 질병에 억압의 연구에 대 한 중요 합니다.

Polysome Leishmania, 인간 세포 및 마우스 고환에서 프로 파일링

여기 선물이 polysome 끼얹는다 절연된 마우스 마음에 프로 파일링을 수행 하는 프로토콜. 우리 심장 관류, 프로 파일링, polysome polysome 분수 mRNAs, miRNAs, 및 polysome 프로테옴의 분석에 대 한 방법을 설명 합니다.

동적 Proteomic 그리고 미르 Langendorff 관류 후 절연 마우스 마음에서에서 Polysomes의 분석

여기서, 우리는 리보태그 시스템을 사용하여 성인 남성 마우스 생식세포의 선택집단으로부터 리보솜 및 관련 RNA의 면역침전을 기술한다. 전략적 번식과 신중한 면역 침전은 세균 세포 트랜스라토메에 알리고 돌연변이 표현형의 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하는 깨끗하고 재현 가능한 결과를 초래합니다.

남성 마우스의 생식 세포에서 리보태그 면역 강하

포유류 뇌의 발달은 번역 수준에서 유전자 발현의 적절한 제어를 필요로한다. 여기서는 조립하기 쉬운 자당 그라데이션 및 분획 플랫폼을 갖춘 다각형 프로파일링 시스템을 사용하여 개발 중인 뇌에서 mRNA의 번역 상태를 평가합니다.

다각형 프로파일링을 사용하여 개발 마우스 뇌의 번역 분석

이 프로토콜은 자동화된 그래디언트 메이커 또는 그래디언트 분별 시스템을 사용하지 않고 폴리솜 프로파일을 생성하는 방법을 설명합니다.

그래디언트 메이커 또는 분획 시스템이 없는 폴리솜 프로파일링

학습하세요 포유동물 세포에서 폴리솜 프로파일링을 이용한 선택적 mRNA 번역 평가 방법을. 초당회분, RT-qPCR을 활용하여 스트레스 조건에서 번역 효율을 분석하고 세포 적응 메커니즘을 규명합니다.

Polysom​​e 프로파일 링 포유 동물 세포에 선택적 mRNA의 번역 평가

더 많은 동영상 탐색

Polysome 프로파일 링 포유 동물 세포에 선택적 mRNA의 번역 평가