Polysom​​e 프로파일 링 포유 동물 세포에 선택적 mRNA의 번역 평가

다음 실험의 전반적인 목표는 폴리리보솜의 고정화와 분리를 통해 고도로 번역된 mRNA와 불량하게 번역된 mRNA를 구별하는 것입니다. 이는 먼저 세포에 cyclo heide를 추가하여 리보솜, 전좌 및 RNA 번역을 억제함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 처리된 세포의 용해물을 수크로오스 구배와 초원심분리기에 로드하여 질량에 따라 저장된 폴리리보솜을 분리합니다.

다음으로, 그래디언트(gradient)를 동일한 분수로 나누어 최종 단계에서 고도로 번역된 전사체와 잘못 번역된 전사체를 분리합니다. R-T-Q-P-C-R은 각 분획 내에서 관심 mRNA의 존재를 감지하는 데 사용됩니다. 궁극적으로 리보솜 프로파일링은 뚜렷한 생리학적 및 병태생리학적 스트레스에 대한 반응으로 mRNA의 전체 및 특정 번역의 변화를 감지하는 데 사용할 수 있습니다.

PolyOne 프로파일링은 분자 및 세포 생물학 분야의 주요 질문, 예를 들어 어떤 mRNA가 선택되고, S 스트레스 동안 번역되며, 이를 통해 세포가 이러한 조건에 어떻게 적응할 수 있는지와 같은 질문에 답할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 실험실에 있는 대학원생의 엄마 Dar입니다: 자동 그라디언트 메이커를 사용하여 자당 그라디언트를 준비하려면 먼저 그라디언트 메이커를 켜고 플레이트가 수평을 이룰 때 그라디언트를 유지할 플레이트의 수평을 맞추십시오. 완료를 클릭합니다.

그런 다음 그라디언트 프로그램을 선택하려면 grad 메뉴를 열고 목록을 선택합니다. SW 41을 클릭한 다음 10-50% 기울기 11단계 프로그램이 표시될 때까지 목록을 스크롤하고 누릅니다. 쓰다. 그런 다음 SW 41 원뿔형 초원심분리기 튜브를 마커 블록에 삽입하고 제공된 미세 튜브 마커를 사용하여 블록의 상단 단계를 따라 튜브의 선을 추적합니다.

튜브를 안정된 표면의 피팅 랙에 놓은 다음 제공된 두 개의 캐뉼러를 두 개의 10ml 주사기에 부착합니다. 피펫은 주사기를 세척하기 위해 활성화 용액에 RNA가 포함된 증류수를 몇 번 위아래로 데웁니다. 그런 다음 물의 흔적을 모두 제거한 후 주사기 중 하나에 10%자당과 사이클로 하이드를 채우고 초원심분리기 튜브 바닥에 캐뉼라를 삽입합니다.

용액이 튜브에 표시된 표시를 지날 때까지 용액을 부드럽게 분배합니다. 거품이 생기지 않도록 주의하세요. 그런 다음 다른 주사기에 50% 자당과 사이클로 하이드를 채우고 물티슈로 튜브에서 여분의 액체를 청소합니다.

캐뉼러를 사용하여 50% 자당 용액을 튜브에 부드럽게 삽입하고 용액이 표시와 수평이 되면 멈춘 다음 캐뉼라를 빠르고 부드럽게 제거합니다. 10% 자당 용액은 튜브 상단에 반월판을 형성하기 위해 상승해야 합니다. 그런 다음 초원심분리기 튜브를 약간 기울여 기포를 제거하고 마이크로 피펫을 사용하여 캡을 삽입하여 캡 저장소에 있는 과도한 액체를 제거합니다.

그라디언트 메이커에 튜브를 놓고 실행 버튼을 누릅니다. 플레이트가 지정된 각도로 기울어집니다. 5초 동안 일시 중지하면 그라디언트를 형성하기 위한 회전이 시작됩니다.

약 2분 후 기계에서 그라디언트 형성이 완료되었음을 알리는 신호음이 울립니다. 튜브를 랙으로 부드럽게 옮기고 기울기를 방해하지 않도록 위쪽으로 움직일 때 캡을 신속하게 제거합니다. 그런 다음 이전에 준비된 세포 용해물 260 단위를 각 자당 구배에 부드럽게 로드하고 초원심분리기에서 섭씨 4도, 260도, 343배의 온도에서 1시간 30분 동안 튜브를 회전시킵니다.

그래디언트 분별 시스템 기기를 설정하려면 먼저 분광 광도계를 켭니다. 그런 다음 폴더 아이콘을 두 번 선택한 다음 돌아가기 화살표를 두 번 선택하여 홈 화면으로 돌아가고 분획 분취기를 PolyZone 방법으로 설정하여 분획 분취기의 밸브가 waste로 설정되었는지 확인합니다. 쓰레기통 아이콘을 가리키는 화살표를 클릭한 다음 증류수가 들어 있는 250ml MIA 플라스크를 쓰레기 수거 튜브 아래에 놓습니다.

이제 차트 레코더에서 다음 설정을 선택하고 감도 다이얼을 설정하여 lamp 및 광학 장치 노이즈 필터. 피크 분리기 다이얼을 1.5로 전환하여 차트 속도를 끄고, 시간당 30cm와 기준선으로 다이얼을 조정하고, 분광 광도계 장치 상단의 다이얼을 최대 개방으로 조정합니다. 그런 다음 주사기와 배럴을 펌프에 넣고 제공된 나사와 Alan Key를 사용하여 제자리에 조입니다.

빠른 속도로 rev 명령을 사용하여 주사기를 chase 솔루션으로 채웁니다. 그런 다음 펌프를 똑바로 세우고 앞으로 명령을 사용하여 튜브를 통해 공기를 쫓습니다. 다음으로, 홀더에 RNA 자유수로 채워진 초원심분리기 튜브를 설치한 다음 두 개의 검은색 표시가 보일 때까지 캐뉼라로 튜브를 뚫습니다.

디스펜싱 구멍은 두 표시 사이에 있습니다. 주사기 펌프를 분당 6.0밀리리터로 순방향 수동으로 시작합니다. 체이스 솔루션이 튜브의 1/3을 채우면 분당 1.0밀리리터의 유속으로 속도를 가변으로 전환합니다.

이제 볼륨이 될 때까지 분광 광도계의 기준선 조정 다이얼을 돌립니다.tage 차트의 e는 0입니다. 물이 폐기물 튜브에서 엘 Mya 플라스크로 빠져나가기 시작합니다. 그런 다음 원하는 감도를 1.0au로 설정합니다.

감도가 조정되면 또한 기준선 버튼을 누르고 레코더 오프셋 다이얼을 돌려 차트 레코더의 기준선 설정을 10% 표시로 조정합니다. 그런 다음 안정적인 기준선에 도달하면 펌프 스위치와 차트 단축 다이얼을 끕니다. 펌프가 꺼지면 회전 위치로 전환하여 피어싱 캐뉼라의 첫 번째 표시에 도달할 때까지 추적 솔루션을 복구합니다.

그런 다음 원심분리기 튜브를 제거하고, 약간의 체이스 용액으로 캐뉼라의 기포를 분산시키고, 플로우 셀에서 누출되었을 수 있는 잔류 물을 청소하여 그래디언트를 분별합니다. 다음으로, 홀더에 자당 구배가 포함된 원심분리기 튜브를 설치하고 캐뉼라로 튜브를 뚫습니다. 그런 다음 10개의 2밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브를 분획 수집기 트레이에 넣고 2에서 11까지의 위치에 배치하고 캡이 위쪽으로 돌출되지 않도록 허리 튜브를 1번 위치에 놓습니다.

펌프 제어 다이얼을 수동으로 설정하고 주사기 펌프의 유속을 분당 6.0밀리리터로 설정합니다. 그런 다음 암이 첫 번째 튜브에 도달하자마자 분획 수집기에서 재생을 누릅니다. 일시 중지 버튼을 눌러 암을 배치하고 분획 디스펜싱 밸브를 엽니다.

그런 다음 forward 명령을 사용하여 펌프를 시작하고 차트 레코더 펜을 모니터링합니다. 펜이 위쪽으로 편향되기 시작하여 샘플이 플로우 셀을 통과하고 있음을 나타내면 폐기물 튜브를 튜브 번호 1로 빠르게 교체합니다. 그런 다음 첫 번째 방울이 수집되면 명령을 원격 시작, 중지 및 분당 1.0밀리리터 변수로 빠르게 전환하고 재생을 눌러 분획 분취기 인터페이스가 1분마다 1밀리리터 분획을 수집할 수 있도록 합니다.

마지막으로 파란색 체이스 솔루션이 마지막 튜브에 들어간 후 중지를 누릅니다. PolyZone 프로파일링은 IRA 매개 번역에서 PD CD4의 특정 관여를 입증하는 핵심 기술입니다. 예를 들어, 이 실험에서는 HEC 2 93 세포를 일시적으로 transfection하여 PDC D 4의 내인성 수준을 고갈시킨 다음 PolyZone 프로파일 분석을 수행했습니다.

PDC D 4의 수치를 감소시키는 것은 PolyZone 프로파일의 변화가 없는 것으로 판단되는 유전자의 전체 번역을 손상시키지 않았습니다. SI 대조군과 IPD CD를 비교했을 때, 4개의 처리된 세포를 유사하게 처리한 세포와 처리되지 않은 세포 간에 XIAP의 비 IRA 변이체의 폴리솜 분포는 변하지 않았습니다. 대조적으로, mRNA XIAP와 BCL XL을 품고 있는 두 IS의 폴리솜 분포는 크게 변경되었습니다.

PD CD4가 없는 경우, 이 두 mRNA의 분포는 헤비 리보솜으로 이동되었습니다. 이는 XIAP와 BCL XL mRNA의 정상 상태 수준의 변화를 동반하지 않기 때문에, 이러한 결과는 서양 꽃에 의해 추가로 확인된 바와 같이 PDC D 4 수준이 감소된 세포에서 XIAP와 BCL XL의 향상된 번역을 보여줍니다. 이 동영상을 시청한 후에는 Sucrose region을 준비하고 초원심분리로 polysome을 분리하여 mRNA translation을 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.