Polysom​​e 프로파일 링 포유 동물 세포에 선택적 mRNA의 번역 평가

다음 실험의 전반적인 목표는 폴리리보솜의 고정 및 분리를 통해 번역 효율이 높은 mRNA와 낮은 mRNA를 구분하는 것입니다. 이를 위해 먼저 세포에 cyclo heximide를 첨가하여 리보솜의 전위와 RNA 번역을 억제합니다. 두 번째 단계로, 처리된 세포의 용해물을 수크로스 밀도 구배에 로딩하고 초원심분리를 수행하여 저장된 폴리리보솜을 질량에 따라 분리합니다.

다음으로, 마지막 단계에서 번역 효율이 높은 전사체와 낮은 전사체를 분리하기 위해 그래디언트를 동일한 분획으로 나눕니다. 각 분획 내에 목적 mRNA가 존재하는지 확인하기 위해 R-T-Q-P-C-R을 사용합니다. 궁극적으로 리보솜 프로파일링을 통해 다양한 생리적 및 병리적 스트레스에 반응하여 mRNA의 전반적인 번역 및 특정 번역의 변화를 검출할 수 있습니다.

PolyOne 프로파일링은 S 스트레스 동안 어떤 mRNA가 선택되고 번역되는지, 그리고 이를 통해 세포가 이러한 조건에 어떻게 적응하는지와 같은 분자 및 세포 생물학 분야의 핵심 질문에 답할 수 있습니다. 이 절차의 시연은 실험실 대학원생에 의해 진행됩니다. 자동 농도 구배 제조기를 사용하여 수크로스 구배를 준비하려면, 먼저 구배 제조기의 전원을 켜고 구배를 담을 플레이트의 수평을 맞춘 후, 플레이트 수평이 맞춰지면 완료를 클릭하십시오.

그 다음 그래디언트 프로그램을 선택하려면, grad 메뉴를 열고 리스트를 선택하십시오. SW 41을 클릭한 후, 10~50% 그래디언트 11단계 프로그램이 보일 때까지 리스트를 스크롤하고 Use를 누르십시오. 다음으로 SW 41 원추형 초원심분리 튜브를 마커 블록에 넣고, 제공된 정밀 튜브 마커를 사용하여 블록의 상단 단계에 맞춰 튜브에 선을 그으십시오.

튜브를 안정적인 표면의 적절한 랙에 배치한 다음, 제공된 두 개의 캐뉼라를 10 milliliter 시린지 두 개에 연결합니다. 활성화 용액 내의 RNA가 포함된 따뜻한 증류수를 시린지로 몇 번 빨아들였다가 내뱉으며 세척합니다. 그 후 물의 흔적을 모두 제거하고, 시린지 하나에 10% sucrose와 cyclo heide를 혼합하여 채운 뒤, 초원심분리 튜브 바닥에 캐뉼라를 삽입합니다.

기포가 생기지 않도록 주의하면서, 튜브에 표시된 선을 살짝 넘을 때까지 용액을 천천히 분주합니다. 그런 다음 다른 시린지에 50% sucrose와 cyclo heximide 혼합액을 채우고, 와이프로 튜브에 묻은 여분의 액체를 닦아냅니다.

캐뉼라를 사용하여 50% sucrose 용액을 튜브에 천천히 주입하고, 용액이 표시선과 일치하면 멈춘 뒤 캐뉼라를 빠르고 부드럽게 제거하십시오. 10% sucrose 용액이 상승하여 튜브 상단에 메니스커스를 형성해야 합니다. 다음으로, 초원심분리 튜브를 약간 기울여 기포를 제거하고 캡을 씌운 후, 마이크로 피펫을 사용하여 캡의 리저버에 남아있는 과잉 액체를 제거하십시오.

튜브를 그라디언트 메이커 위에 놓고 실행 버튼을 누릅니다. 이때 플레이트가 지정된 각도로 기울어지게 됩니다. 5초 동안 일시 정지한 후, 그라디언트를 형성하기 위한 회전이 시작됩니다.

약 2분 후, 기기에서 비프음이 울리면 구배 형성이 완료되었음을 나타냅니다. 튜브를 랙으로 조심스럽게 옮기고, 구배가 흐트러지지 않도록 위쪽 방향으로 빠르게 캡을 제거하십시오. 그다음, 미리 준비한 세포 용해물을 각 sucrose 구배에 260 units씩 동일하게 조심스럽게 로딩하고, 초원심분리기로 260, 343 times G 및 4°C에서 1시간 30분 동안 원심분리하십시오.

구배 분획 시스템 장치를 설정하려면 먼저 분광광도계를 켭니다. 그다음 폴더 아이콘을 두 번 누르고 리턴 화살표를 두 번 눌러 홈 화면으로 돌아간 후, 분획 수집기의 밸브가 폐기물로 설정되도록 분획 수집기를 PolyZone 방법으로 설정합니다. 휴지통 아이콘을 가리키는 화살표를 클릭한 다음, 증류수가 담긴 250 milliliter MIA 플라스크를 폐기물 수집 튜브 아래에 놓습니다.

이제 차트 기록기에서 다음과 같은 설정을 선택하십시오. 감도 다이얼을 램프 및 광학계 설정으로 맞추고, 노이즈 필터 스위치를 1.5로 설정합니다. 피크 분리 다이얼은 off로, 차트 속도 다이얼은 30 centimeters per hour로 설정하고, 분광광도계 본체 상단의 베이스라인 조정 다이얼을 max open으로 맞춥니다. 그런 다음 펌프에 시린지와 배럴을 장착하고, 제공된 나사와 육각 렌치를 사용하여 단단히 고정하십시오.

rev 명령어를 빠른 속도로 사용하여 시린지를 chase 용액으로 채웁니다. 그런 다음 펌프를 수직 위치로 두고 forward 명령어를 사용하여 튜빙 내의 공기를 밀어냅니다. 다음으로 RNAs free water가 채워진 초원심분리 튜브를 홀더에 장착한 후, 두 개의 검은색 표시선이 보일 때까지 캐뉼라로 튜브를 관통합니다.

분주 구멍은 두 표시 사이에 있습니다. 시린지 펌프를 전진 수동 모드로 설정하여 6.0 milliliters per minute의 속도로 작동시킵니다. 체이스 용액이 튜브의 1/3을 채우면, 유속을 1.0 milliliters per minute의 가변 속도로 전환하십시오.

이제 분광광도계의 베이스라인 조정 다이얼을 돌려 차트의 전압이 0이 되도록 합니다. 그러면 물이 폐액 튜브를 통해 el Mya 플라스크로 배출되기 시작합니다. 그 다음, 원하는 감도를 1.0 au로 설정하십시오.

감도가 조정되면 baseline 버튼을 누르고 레코더의 offset 다이얼을 돌려 차트 레코더의 10% 표시선에 맞게 베이스라인 설정을 조정합니다. 베이스라인이 안정되면 펌프 스위치와 차트 속도 다이얼을 off로 돌립니다. 펌프가 꺼지면, chase 용액이 천자 캐뉼라의 첫 번째 표시선에 도달할 때까지 회수하기 위해 스위치를 rev 위치로 전환합니다.

그 후 원심분리관을 제거하고, 소량의 체이스 용액(chase solution)으로 캐뉼라 내의 기포를 분산시킨 다음, 그라디언트를 분획하는 동안 플로우 셀에서 누출되었을 수 있는 잔류수를 닦아냅니다. 다음으로, sucrose 그라디언트가 들어 있는 원심분리관을 홀더에 설치하고 캐뉼라로 관을 관통시킵니다. 그런 다음 2 mL 마이크로 원심분리관 10개를 분획 수집기 트레이의 2번부터 11번 위치에 배치하고, 캡이 위로 튀어나오지 않도록 1번 위치에 웨이스트 튜브(waist tube)를 배치합니다.

펌프 제어 다이얼을 수동으로 설정하고 시린지 펌프의 유속을 6.0 milliliters per minute로 설정하십시오. 그 다음, 암(arm)이 첫 번째 튜브에 도달하는 즉시 분획 수집기의 재생 버튼을 누르십시오. 일시 정지 버튼을 눌러 암의 위치를 잡고 분획 분주 밸브를 여십시오.

그런 다음 정방향(forward) 명령을 사용하여 펌프를 가동하고 차트 기록계 펜을 모니터링합니다. 펜이 위쪽으로 굴절되기 시작하여 시료가 플로우 셀을 통과하고 있음이 확인되면, 폐액 튜브를 1번 튜브로 빠르게 교체하십시오. 첫 번째 방울이 수집되면 즉시 명령을 원격 시작(remote start), 정지(stop), 그리고 분당 1.0 milliliters로 전환하고 재생(play) 버튼을 눌러 분획 수집기 인터페이스가 매 분마다 1 milliliter 분획을 수집하도록 합니다.

마지막으로, 파란색 추적 용액이 마지막 튜브에 들어가면 정지 버튼을 누릅니다. PolyZone 프로파일링은 IRA 매개 번역에서 PDCD4의 특이적 관여를 입증하는 핵심 기술입니다. 예를 들어, 본 실험에서는 HEC 2 93 세포를 일시적으로 형질전환시켜 내인성 PDCD4 수준을 고갈시킨 후 PolyZone 프로파일 분석을 수행하였습니다.

PolyZone 프로파일에 변화가 없었다는 점에서 알 수 있듯이, PDC D four의 수준을 낮추어도 해당 유전자의 전반적인 번역은 저해되지 않았습니다. SI 대조군과 IPD CD four 처리 세포를 비교했을 때, 비-IRAs 변이체인 XIAP의 폴리솜 분포는 처리 여부와 상관없이 동일했습니다. 이와 대조적으로, IS를 보유한 두 mRNA인 XIAP와 BCL XL의 폴리솜 분포는 유의미하게 변화되었습니다.

PD CD4가 없을 때, 이 두 mRNA의 분포는 무거운 리보솜 쪽으로 이동했습니다. 이는 XIAP 및 BCL XL mRNA의 정상 상태 수준 변화를 동반하지 않았으므로, 이러한 결과는 Western blotting으로 추가 확인한 바와 같이 PDC D four 수준이 감소한 세포에서 XIAP 및 BCL XL의 번역이 강화되었음을 입증합니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 Sucrose 구배를 준비하고 초원심분리를 통해 폴리솜을 분리하여 mRNA 번역을 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.