Name: 포유 동물 세포에 기능 세균 이펙터의 전기 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: 배우세요 포유 동물 세포에 세균 이펙터 단백질을 전기영동으로 도입하는 방법을. 공초점 면역형광 현미경으로 단백질의 세포 내 위치와 기능을 분석하여 병원성 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

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이 연구는 NIGMS(National Institutes of Health, GM094623)의 지원을 받았습니다. 이 작업의 상당 부분은 PNNL(Pacific Northwest National Laboratory)에 위치한 DOE/BER 국립 과학 사용자 시설인 환경 분자 과학 실험실에서 수행되었습니다. PNNL은 DE-AC05-76RLO1830 계약에 따라 Battelle이 DOE를 위해 운영합니다.

1. 사전에 준비 <ol><li> 37 ° C에 따뜻한 멸균 인산 완충 식염수 (PBS). </li><li> 10 % 소 태아 혈청 (FBS)이 보충 된 이글 배지 (DMEM) 및 최소 필수 매체 (MEM)의 따뜻한 둘 베코 변형, 100 IU / ml의 페니실린, 100 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신을 37 ° C이다. 참고 :이 각각 RAW와 헬라 세포 정상적인 성장 미디어 (NGM)를 나타냅니다. </li></ol> 세포의 2. 준비 <ol><li> NGM에 70-90%의 포화 상태에 RAW 264.7 세포를 성장. <ol><li> 가습 95 % 공기 / 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C에서 세포를 유지한다. </li></ol></li><li> NGM에 70-90%의 포화 상태에 헬라 세포를 성장. <ol><li> 가습 95 % 공기 / 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C에서 세포를 유지한다. </li></ol></li><li> 수집하기 전에, 멸균 PBS로 한 번 세포 단층을 씻는다. </li><li> 멸균 원뿔 튜브에 미리 합류 세포를 수집합니다. <ol><li> 부드럽게 RAW 세포를 긁어PBS에서 고무 경찰관으로, 반복 피펫으로 세포 집계를 분산한다. </li><li> 육안 검사는 문화면에서 해리가 표시 될 때까지 0.25 % 트립신 솔루션 헬라 세포를 분리합니다. 예를 들어, T-75 플라스크에 대해 2 내지 3 ml의 사용. 트립신 솔루션이 전체 성장 표면을 커버하기 위해 그에 따라 볼륨을 조정합니다. <ol><li> NGM 10 % FBS를 함유하는과 해리 반응을 켄칭. </li><li> 세포 집합체를 분산시키기 반복 피펫 팅으로, 트립신 NGM의 적어도 두 배 볼륨을 사용. </li></ol></li></ol></li><li> 가볍게 4 분 900 XG에서 원심 분리하여 세포 펠렛. </li><li> 멸균 PBS를 사용하여 트립신 / 종결 용액과 동일한 볼륨에 재현 탁. </li><li> 입자 또는 혈구 계수기를 사용하여 세포를 카운트. </li><li> 가볍게 4 분 900 XG에서 원심 분리하여 세포 펠렛. </li><li> 5.5 × 106 6.0 × 106 개의 세포 / ㎖의 PBS를위한 충분한 부피 재현 탁. 참고 : 예를 들어, 하나의 T-75 플라스크 approxim을 얻을 것입니다러면 7.5 × 10 6 세포 (29). </li><li> 전기까지 얼음에 세포 현탁액을 유지합니다. </li></ol> 일렉트로 3. 준비 <ol><li> 얼음 사전 냉각 전기 큐벳 (0.4 cm 간격). </li><li> 전기 장치의 전원을 켜고 0.3 kV의에 전압을 설정합니다. 참고 : 용량 및 저항 (제조업체가 10 μF 600 Ω로 설정) 우리의 electroporator에 설정 조정하지 않았다. </li><li> NGM과 복구 판을 작성하고 37 ℃에서 가습 95 % 공기 / 5 % CO 2 분위기에서 평형 </li></ol> 4. Electroporation에 <ol><li> 사전 냉장 큐벳에 세포 현탁액 400 μl를 놓고 베트 (/ ㎖ 50 μg의) 선택된 단백질 20 μg의를 추가합니다. </li><li> 톡 베트는 부드럽게 ~ 10 배 세포를 손상시키지 않고 혼합합니다. 참고 : 베트는 잘 혼합 여러 번 반전 될 수 있지만, 최대 피펫하지 않고 아래로 또는 소용돌이 세포의 손상을 방지 할 수 있습니다. </li><l난&gt; 종이 타월 또는 다른 와이퍼와 큐벳의 드라이 외부는 electroporator에 전기 불꽃을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 1.5-1.7 밀리 0.3 kV의에서 Electroporate 샘플. 참고 :이 연구에 대한 전형적인했다. </li><li> 즉시 전기 플릭 베트 후 부드럽게 ~ 10 배는 잘 혼합합니다. </li></ol> 세포의 5. 도금 <ol><li> 준비가 될 때까지 얼음에 electroporation하여 세포 보관 큐벳 복구 플레이트에 배치합니다. </li><li> 대부분의 다운 스트림 분석을 위해, 외부 이펙터 단백질을 제거하기 위해 미리 예열 NGM으로 세포가 1 배 씻는다. <ol><li> 분석을 위해 세포를 제거하고 NGM의 3-5 ml의 일시 중지합니다. </li><li> 4 분 동안 900 XG에서 원심 분리하여 세포 펠렛. </li><li> 원하는 판 크기 (예 : 35mm 접시 2 ml)에 대한 NGM의 적절한 볼륨을 Resuspend. </li></ol></li><li> 다운 스트림 분석을위한 세포의 적당량을 제거합니다. <ol><li> 예 1 : 현미경 분석을위한 유리 바닥 요리에 판. </li><li> 예 2 : 판 INT친 화성 - 정제를 같은 단백질 분석 용 O 세포 배양 플라스틱. </li></ol></li><li> 세포는 적어도 4 시간 동안 37 ° C에서 95 % 가습 된 공기 / 5 % CO 2 분위기하에 평형화 플레이트에서 복구 할. </li></ol> 6. 현미경 분석 6.1) 고정 / 면역 형광 염색법 <ol><li> 워시 세포는 4 시간의 회복 기간 후 멸균 PBS로 1 배. </li><li> 실온에서 2 분 동안 100 % 메탄올에 세포를 고정. 완전히 세포 (예를 들어, 2 ml의 35mm의 요리)를 충당하기 위해 충분한 메탄올을 사용합니다. </li><li> 멸균 PBS로 세척 배. </li><li> 15 분 동안 PBS에서 0.4 % 트리톤 X-100 세포를 Permeabilize 하시려면. 예를 들어, 35mm 직경 플레이트 된 1 mL의 사용. <ol><li> 에피토프 및 표적 단백질의 위치에 따라 트리톤 X-100 투과성으로 강도의 길이를 조정합니다. 참고 : 최상의 결과를 그러나 위의 조건은 대부분의 C에 적합해야한다, 경험적으로 각 대상에 대해 결정해야합니다ytosolic 목표. </li></ol></li><li> RT에서 1 시간 동안 PBS 중 5 % 소 혈청 알부민 (BSA)으로 차단. 예를 들어, 35mm 직경 플레이트 된 1 mL의 사용. </li><li> PBS로 세척 배. </li><li> 도 4에서 밤새 항체 용액에 결합 차 항체 (PBS 중 0.1 % 트리톤 X-100, 1 % BSA)을 부화 &#160; 부드러운 락과 C를 °. 예를 들어, 35mm 직경 플레이트를 0.5ml를 사용한다. <ol><li> 항체 희석에 대한 제조업체의 권장 사항을 따르십시오. 주 : 200 희석 : PKN1 항체 1에 사용 된 반면, 1000 희석 : 예를 들어, 스트렙 타비 딘 - 결합 펩티드 태그 (SBP-Tag)을 1 항체를 사용 하였다. </li></ol></li><li> PBS로 세척 4 배. </li><li> 빛으로부터 보호 실온에서 1 시간 동안 항체 결합 액에 적합한 형광 접합 된 이차 항체와 함께 배양한다. <ol><li> 예를 들어, 실온에서 1 시간 동안 또는 알렉사 488 알렉사 647을 사용한다. <ol><li> 개미에 대한 제조업체의 권장 사항을 따르십시오ibody 희석. (예를 들어 약 1 : 1,000 본 연구). </li></ol></li><li> 예를 들어, 필요에 따라 다른 얼룩을 추가, 5 μM 밀 배아 agglutinnin (WGA) 실온에서 1 시간 동안, 제조업체의 권고에 따라 알렉사 647 또는 DAPI에 결합. </li></ol></li><li> 이미지에 대한 준비가 될 때까지 빛으로부터 보호 PBS 4 ° C에서 저장 씻을 5 배. </li></ol> 6.2) 공 초점 현미경 및 이미지 분석 <ol><li> 63X 기름 침지 목표를 사용하여 반전 공 초점 현미경 이미지 샘플. <ol><li> 492-542 nm의 방출 사이의 대역폭과 아르곤 레이저의 488nm의 라인을 이용하여, 화상을 녹색 채널. </li><li> 640-718 nm의 방출 사이의 대역폭을 가진 633 nm의 다이오드 레이저를 사용하여 적색 이미지 채널. </li><li> 407-453 nm의 방출 사이의 대역폭을 가진 405 nm의 다이오드 레이저를 사용하여 청색 이미지 채널. </li><li> Z-스택 세포 볼륨의 전체를 커버 여러 채널을 확인합니다. </li></ol></li><li> 해당 이미지 처리 소프트웨어로 이미지를 처리​​. </li></ol> 7. 선호도 정화 <ol><li> 4 시간의 회복 기간 후 4 ° C PBS로 두 번 일렉트로 세포를 씻으십시오. </li><li> 와를 Lyse ~ 용해 완충액 얼음 (PBS에서 프로테아제 억제제 칵테일 및 포스파타제 억제제와 1 % 트리톤 X-100)의 1.0 ml의. 제조업체의 지침에 따라 억제제를 사용합니다. 참고 : 예를 들어, 모두 본 연구에 사용 된 프로테아제 및 포스파타제 억제제 (100X)에 공급하고 있지만, 다른 제제는 동일하게 잘 작동한다. </li><li> 즉시 고무 경찰관과 세포를 긁어 원뿔 튜브에 수집합니다. </li><li> 활발한로 소용돌이 초음파 처리를 Lyse. 참고 : 다른 용해 방법은 똑같이 잘 작동 할 수 있지만 효율이 경험적으로 분석 요구 사항의 적합성 여부를 결정해야합니다. <ol><li> 간헐적 와동와 3 × 30 초 초음파 처리. </li></ol></li><li> 4 ° C에서 10 분 동안 10,000 XG에 원심 분리기 수집세포 파편과 불용성 집계; 뜨는을 저장합니다. </li><li> 엔드 오버 엔드 회전 4 ° C에서 하룻밤 스트렙 타비 딘 아가로 오스 수지 현탁액 50 μL와 일렉트로 세포 용 해물 같은 부피 (~ 1.0 ml)에 결합합니다. 참고 :이 수지는 스트렙 타비 딘 결합 펩타이드 친 화성 태그를 통해 일렉트릭 단백질 (및 관련 단지)를 캡처합니다. </li><li> 2 분 동안 2,500 XG에 원심 분리기 및 상층 액을 제거한다. </li><li> 40 침대 볼륨 (~ 1 ml)을 PBS로 두 번 세척 할 것. </li><li> 30 μl의 4 배 LDS 로딩 버퍼 (141 mM 트리스베이스, 2 % LDS, 10 % 글리세롤, 0.51 mM의 EDTA, 0.22 mM의의 Serva 블루 G, 빨간 0.175 mM의 페놀, 산도 8.5), 20 μL DIH 2 O, 1 μL의 추가 일정량 허용 0.5 M 트리스 (2- 카르복시 에틸) 포스 핀 (TCEP)는 비드 2340. </li><li> 10 분 동안 95 ° C에서 열 및 얼음에 멋진. </li><li> 스핀 5 분 4 ° C에서&gt; 10,000 XG. </li><li> 상층 액을 수집합니다. </li><li> 적절한 항체를 참고하여 웨스턴 블롯을 수행 그는다시, 안티 PKN1 차 항체가 사용됩니다. </li></ol>

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</ol>

저자가 공개하는 게 없다.

병원성 박테리아로부터 분비 이펙터 숙주 세포 환경 내에서 작동하도록 진화하고, 따라서 호스트 내에서 (in situ)을 연구하기 위해 유용하다. 숙주 세포에 특정 관심 이펙터의 도입은 관련 병원체 호스트 상호 작용이 다른 세균 단백질의 간섭없이 독립적으로 연구 할 수 있습니다. 목표는 형질 감염 또는 형질 도입시켜과 관련된 몇 가지 문제를 피하고, 진핵 생물 숙주 세포 내로 박테리아 효과기 단백질을 도입하기위한 수단으로 전기 천공을 탐구 하였다. 녹색 형광 단백질이 대조군으로 사용하고, 살모넬라 효과기 단백질을 시험 하였다. 이 때문에 상피 세포뿐만 아니라 면역 세포를 대상 호스트 세균성 병원체의 관심, 인간 상피 형 세포주 (HeLa 세포)와 마우스 대 식세포 유사 세포 (RAW 264.7)를 사용 하였다. 전기 세포 viabili에서 뚜렷한 감소와 숙주 세포에 외래 단백질을 제공 할 수 있습니다타이, 그리고 전달 단백질 최대 4 일 동안 세포에서 검출되었다. <p class="jove...

많은 그람 음성균 직접 숙주 세포를 1-5로 (이펙터라고 함) 병원성 관련 단백질을 주입하도록 전문화 분비 시스템을 사용한다. 숙주의 면역 억제, 세포 골격 변화, 세포 내 신호 전달 및 매매, 전사 변화 수정 및 호스트 테아 변경 6-9 : 이러한 이펙터 포함한 생물학적 기능의 넓은 범위를 갖는다. 일부 이펙터 기능하지만 호스트 대상 외 다수의 생화학 적 조치 (들)이 결정될 수 남아 알려져있다. 야생형 및 재조합 박테리아 감염을 비교하는 세포 독성 이펙터 메커니즘을 연구하는 유효한 방법이지만, 상기 숙주 세포에 도입 개별 이펙터 종종 유리하다. 따라서, 숙주 세포의 컨텍스트에서 세균 효과기 단백질을 도입하고 특성화 간단한 방법이 매우 바람직하다. 실험 분석 위스콘신 단순화하나의 이펙터가 중요 번째 다른 이펙터는 반대 또는 중복 기능을 가질 수 있기 때문이다. 이 단순화를 달성하기 위해, 연구진은 이전에 긁어은 12, 13로드, 바이러스 성 전달 (10), 미세 주입법 (11) 등 다양한 방법에 의해 세포로 거대 분자를 도입, 화학적으로 유도 미세 주입 (14), 독점 단백질 &quot;형질 전환&quot;시약 (15), 인산 칼슘 침전와 세포 융합 (16), 및 전기 17-20. 도입 된 분자는 세포 내 표적 (21, 22)에 대한 단백질, 세포 투과성 염료 및 항체 DNA, RNA, RNAi의 종을 포함하여 핵산 이르기까지 다양합니다. 일부 방법은 도입 될 수있는 고분자의 종류를 포함한 한계가 있고, 특히 하류 분석 높아 세포 독성 작용의 손상 기전, 효능이 낮고 또는 도입 효율이 제한 될 수있다. 형질, ofte또한 대 식세포 및 일차 전지와 같은 몇 가지 중요한 숙주 세포 유형, 형질 향해 특히 내성을 겪고 제한, 포유 동물 세포에서 세균의 유전자를 발현하는 방법을 위해 사용되는 N. 이 외에도, 또한 외래 DNA의 도입시 생성 된 박테리아 단백질의 수준을 조절하는 것이 곤란하다. 많은 작품은 일반적인 실험실 기술로 모두 세균 및 포유 동물 세포에 핵산의 전기를 설립했다; 그러나, 생리 학적 조건하에 단백질을 세포 내로 전달하기위한 최선의 방법에 대한 지속적인 연구가있다. 단백질 형질 전환에 보고서는 유망하지만, 고가의 시약 및 최적화를 필요로한다. 최소한의 비용으로 셀 대상의 다양한에 잠재적으로 독성 세균 이펙터를 소개하는 욕망은 생체 내에서 단백질을 연구하는 방법으로 전기를 고려하는 우리를 이끌었다. 단백질 전기 23-25는 만족입니다또한 전기 형질 전환 또는 전자 주입 (26)로 알려진 electropermeabilization를 통해 살아있는 세포로 단백질을 소개 HOD. 이 방법은 세포막에 구멍을 만드는 고강도 전기 펄스를 사용한다. 이 가역적 모공은 일반적으로 세포 내 공간에서 제외됩니다 거대 분자가 세포를 입력 할 수 있습니다. 외부 전계를 제거하여, 상기 멤브레인은 셀이 통과 구멍 (27, 28)의 분자를 보유 할 수 있도록, 다시 봉인 할 수있다. 표준 electroporator 일관 마우스 대 식세포 유사 세포 및 인간 상피 세포에 모두 세균 이펙터를 도입이 연구에 사용 하였다. 이 방법은 세포 생존 능력의 뚜렷한 감소와 신속하고 효율적이며 저렴하다. 도입 된 단백질은 면역 형광 현미경을 통해 시각 또는 기능 분석에 사용할 수 있습니다. 이뿐만 아니라, 비 독성 표준으로 녹색 형광 단백질 (GFP)을 사용하여 입증되었다두 살모넬라 이펙터 단백질과 SspH1 GtgE. 우리는 진핵 숙주 세포에서 세균 독성 단백질의 기능 연구의 레퍼토리에 추가 도구로 단백질 전기를 제안한다.

<table><tbody><tr><td>0.25% 트립신-EDTA 용액</td><td>Cellgro</td><td>25-050-Cl</td><td></td></tr><tr><td>0.4cm 갭 일회용 전기천공법 큐벳</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2088</td><td></td></tr><tr><td>100% 메탄올</td><td>Any</td><td>N/A</td><td>가연성, 독성</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4919</td><td></td></tr><tr><td>세포 계수 장치 - 혈구계 또는 Coulter 카운터</td><td>Beckman Coulter</td><td>모델 Z1</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 인큐베이터</td><td>모든</td><td>N / A</td><td>가습 95 % 공기 / 5 % CO2 atmosphere at 37 °C; 씨&nbsp;</td></tr><tr><td>세포 배양 플라스틱</td><td>모든</td><td>N/A</td><td>세포 배양 플라스크/플레이트, 피펫, 튜브, 고무 경찰관</td></tr><tr><td>Dulbecco의 Modification of Eagle' s 매체 (DMEM)</td> <td>Cellgro</td><td>10-013</td><td>37 &deg로 따뜻하게; 씨&nbsp;</td></tr><tr><td>Electroporator</td><td>Bio-Rad</td><td>E. coli Pulser</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Cellgro</td><td>35-016-CV</td><td></td></tr><tr><td>형광 컨포칼 현미경&nbsp;</td><td>Ziess</td><td>모델&nbsp; LSM 710&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>현미경 검사용 유리 바닥 접시</td><td>Wilco Wells</td><td>HBSt-3522</td><td></td></tr><tr><td>HALT 프로테아제 억제제 칵테일</td><td>피어스</td><td>78430</td><td>부식성, 독성</td></tr><tr><td>HeLa 세포주</td><td>ATCC</td><td>ATCC CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>LDS 4X 로딩 버퍼</td><td>Invitrogen</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>최소 필수 매체 (MEM)&nbsp;</td><td>Cellgro</td><td>10-010</td><td>37도까지 따뜻하게; 씨&nbsp;</td></tr><tr><td>퇴색 방지 시약과 함께 기타 형광 염색제(WGA, DAPI)</td><td>Any</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Cellgro</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>RAW 264.7 세포주</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>관심 표적에 대한 1차 항체</td><td>Any</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>형광단에 접합된 2차 항체</td><td>Any</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>4</td><td></td><td>&deg로 냉각; 씨&nbsp;</td></tr><tr><td>멸균 인산염 완충 식염수</td><td>37</td> &deg로 따뜻한 모든 <td>N/A</td><td>; 씨&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">[헤더]</td></tr><tr><td>Streptavidin Agarose 수지 현탁액&nbsp;</td><td>Pierce</td><td>20353</td><td></td></tr><tr><td>원뿔형 튜브를 수용할 수 있는 탁상용 원심분리기(스윙 버킷 선호)</td><td>모든</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>646547</td><td>부식성, 독성</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8585</td><td>자극성, 독성</td></tr></tbody></table>

포유 동물 세포에 기능 세균 이펙터의 전기

Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells

살아있는 세포의 맥락에서 단백질 상호 작용의 연구는 현지화, 역학, 그리고 상호 작용 파트너에 대한 중요한 정보를 생성 할 수 있습니다. 이 정보는 호스트 병원체 상호 작용의 컨텍스트에서 특히 유용하다. 많은 병원체 단백질은 세포 내 환경 내에서 숙주의 면역 시스템 및 생존의 회피를 가능 같은 방법의 다양한 숙주 세포 내에서 기능한다. 이러한 병원체 단백질 호스트 세포 상호 작용을 연구하기 위해, 여러 가지 접근 방법이 일반적으로 포함하여, 사용됩니다 생체 내 감염에 형질 전환 또는 형질 도입을 통해 태그 또는 돌연변이 단백질 또는 병원체 유전자의 도입을 발현하는 균주. 이러한 방식은 각각 이점과 단점을 갖는다. 우리는 직접 세포에 외래 단백질을 소개 할 수있는 방법을 모색하고 있습니다. 일반적으로 일렉트로 세포 내로 핵산을 도입하기 위해 사용되지만, 생물 리 학적 근거가 정확히 동일하지만 드물게 단백질에 적용되지 않았다.표준 electroporator는 포유 동물 세포에 친 화성 태그가 세균 이펙터를 소개하는 데 사용되었다. 상피 및 마우스 대식 세포는 전통적인 분리 방법에 의해 배양하고, 관심 외인성 세균 병원체의 단백질 (예를 들어 살모넬라 Typhimurium의 GtgE) 0.4 cm 갭 전기 천공 큐벳에 넣었다. 전기 (0.3 kV의) 짧은 (4 시간) 회복 기간 후, 세포 내 단백질은 형광 친 화성 태그를 통해 단백질을 라벨 및 공 초점 현미경으로 공간과 시간 분포를 조사하여 확인 하였다. 일렉트로 단백질은 세포 내부의 세포 내 작용 및 올바른 거래 및 단백질 - 단백질 상호 작용을 할 수있는 것으로 나타났다. 외래 단백질이 세포의 표면 상에 축적되는 경향이 있지만, 일렉트로 샘플 단독 배양 세포 내 이펙터 농도에 대하여 크게 증가했다. 이 프로토콜은 AP에서 할 수 간단하고 빠른만큼타겟팅 및 병원성 세포 내 단백질의 기능을 포함하는 숙주 세포에서 단백질의 병원체 높은 처리량 특성을 허용 arallel 패션.

개념의 초기 증거로서, 정제 된 녹색 형광 단백질을 이용하여 성공적으로 전기 포유 동물 세포에 도입 하였다. GFP, 대략 27 kD의 분자량 단백질은 일반적으로 세포 독성이없는 중요한 분자 생물학 도구로 (일반적으로 플라스미드 DNA로부터 발현) 포유 동물 세포 내로 도입된다. 헬라 세포 (그림 1A)를 배양 또는 형광 GFP 신호를 확인하기 위해 면역 형광 공 초점 현미경을 25 ㎍ / ㎖의 GFP와 (그림 1B)를 전기 천공 하였다. GFP는 세포 세포질 내부 것을 입증하기 위해, 또한, 세포 핵을 나타낼 밀 배아 응집소 (WGA) 세포질 경계 (적색)의 윤곽뿐만 아니라 핵산 얼룩, DAPI (파란색)으로 염색 하였다. 어떤 세포 내 단백질 GFP 함께 배양 세포에서 관찰되지 않았다하면서 세포 내 GFP 신호는 전기 천공시에만 관찰되었다. 비슷한 결과는 RAW264.7 마​​우스로 관찰되었다대 식세포 유사 세포 (도 1C 및 <st...

Electroporation은 정제된 박테리아 독성 효과기 단백질을 살아있는 진핵 세포에 직접 삽입하는 데 사용되었습니다. 단백질 국소화는 컨포칼 면역형광 현미경으로 모니터링했습니다. 이 방법을 사용하면 활성 외인성 단백질을 사용하여 이동, 기능 및 단백질-단백질 상호 작용에 대한 연구를 수행할 수 있으므로 진핵 세포에서 이종 발현의 필요성을 피할 수 있습니다.

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. ...

다음 실험의 전반적인 목표는 박테리아 이펙터와 같이 잠재적으로 세포 독성을 가진 외인성 단백질을 포유류 세포에 도입하여 그 효과와 기능을 연구하는 것입니다. 이를 위해 먼저 표준 배양 조건으로 포유류 세포를 배양하여, 정제된 목적 단백질을 도입할 적절한 숙주 유사 세포를 확보합니다. 두 번째 단계로, 정제된 박테리아 이펙터가 존재하는 상태에서 배양된 숙주 세포에 전기천공법(electroporation)을 수행하며, 이를 통해 단백질이 숙주 세포 내부로 들어가 상호작용하게 됩니다.다음으로, 이펙터 단백질의 세포 내 위치와 기능성을 평가하기 위해 시각화 또는 기타 기능 분석을 수행합니다. 공초점 현미경, 면역화학적 방법 또는 기타 분석 기술을 기반으로 한 결과는 기능적 박테리아 이펙터가 예상되는 세포 내 위치에 국소화되고, 알려진 상호작용 파트너와 결합함을 보여줍니다. 형질전환이나 형질도입과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 이 프로토콜이 잠재적인 세포 독성을 극복할 수 있는 빠르고 간단하며 비용 효율적인 접근 방식이라는 점입니다.이 방법은 박테리아 이펙터 단백질의 기능 발견 또는 검증과 같이 병원체 생물학 분야의 핵심적인 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 본 방법은 박테리아 이펙터 단백질에 대한 통찰력을 제공하기 위해 사용되었으나, 다른 단백질이나 저분자 화합물에도 적용할 수 있습니다. 결과의 시각화가 매우 중요합니다.알려진 세포 구조와의 공국소화(colocalization)를 통해, 이 절차를 시작하여 전기천공된 단백질의 예상되는 세포 내 연관성을 확인하십시오. 세포 현탁액 400 µL를 미리 냉각된 튜브로 옮깁니다. 그다지 선택한 단백질 20 µg을 첨가하여 최종 농도가 50 µg/mL가 되도록 합니다.세포 손상을 방지하고 혼합하기 위해 튜브를 가볍게 10회 정도 튕겨줍니다. 그 후, 전기천공 시 전기 아크 발생을 방지하기 위해 Q Vet 외부를 페이퍼 타월로 닦아 건조시킵니다. 샘플을 전기천공 장치에 넣고, 전기천공 직후 0.3 kilovolts에서 1.5 to 1.7 milliseconds로 설정합니다.고정 및 면역형광 염색 또는 친화성 정제로 넘어가기 전에, 큐벳을 약 10회 정도 가볍게 튕겨 샘플을 충분히 혼합하십시오. 전기천공법 후 4시간 동안 회복시킨 다음, 멸균 PBS로 세포를 세척하십시오. 그다음 실온에서 100%methanol로 2분 동안 세포를 고정하십시오.그 후, 멸균된 PBS로 세포를 3회 더 세척합니다. PBS에 희석된 0.4% Triton X 100으로 15분 동안 세포를 투과화합니다. 표적 단백질의 에피토프와 위치에 따라 투과화 시간과 Triton X 100의 농도를 조절하십시오.그런 다음 상온에서 5% BSA가 포함된 PBS로 1시간 동안 세포를 블로킹합니다. 이후 PBS로 3회 세척합니다. 다음으로, 항체 결합 용액 내의 1차 항체와 함께 4°C에서 완만한 흔들림을 주며 하룻밤 동안 배양한 후 다음 날 회수합니다.세포를 PBS로 4회 더 세척합니다. 그런 다음 항체 결합 용액 내의 적절한 형광 표지 2차 항체와 함께 인큐베이션합니다. 필요에 따라 5 µM의 wheat germ agglutinin 또는 Alexa 647가 결합된 WGA 또는 DPI와 같은 다른 염색제를 추가하고, 실온에서 빛을 차단한 상태로 1시간 동안 반응시킵니다.그런 다음 세포를 PBS로 5회 세척하고, 본 단계의 이미징 준비가 될 때까지 4°C에서 차광하여 보관하십시오. 전기천공된 세포를 4°C PBS로 2회 세척하십시오. 4시간의 회복 기간 후, 얼음 위에서 1 mL의 용해 버퍼(lysis buffer)로 세포를 용해하십시오.고무 폴리스맨(rubber policeman)으로 세포를 즉시 긁어내어 원추형 튜브에 수집합니다. 그다음 초음파 처리(sonication)와 강한 볼텍싱(vortexing)을 통해 세포를 용해합니다. 이어서 샘플을 10,000 ×g에서 원심 분리합니다.4°C에서 10분 동안 중력 침전시켜 세포 파편과 불용성 응집물을 수집하고 상층액을 보관합니다. 정제된 전기천공 세포 용해물 1mL를 streptavidin 레진 현탁액 50µL와 혼합합니다. 혼합물을 4°C에서 하룻밤 동안 end-over-end 회전시키며 배양하여, Strep-tag 결합 펩타이드 친화성 태그를 통해 전기천공된 단백질과 관련 복합체를 포집합니다.그 후, 샘플을 2,500 ×g에서 2분 동안 원심분리하고 상층액을 제거합니다. 그런 다음 1 mL의 PBS로 샘플을 2회 세척합니다. 다음으로, 4× LDS 로딩 버퍼 30 µL, 증류수(H2O) 20 µL, 0.5 M TCEP 1 µL를 샘플에 추가하며, 상층액을 약간 남겨둡니다.시료를 95 °C에서 10분 동안 가열하십시오. 그 다음 얼음 위에서 약 1분 동안 냉각합니다. 이어서 시료를 4 °C에서 10,000 ×g로 5분 동안 원심분리하십시오.마지막으로, 적절한 항체를 사용하여 웨스턴 블롯을 수행하기 위해 상층액을 수집합니다. HeLa 세포를 50 $\mu\text{g/mL}$의 어피니티 태그가 붙은 살모넬라 이펙터인 GTGE와 함께 배양하거나 전기천공법으로 도입한 후, 이펙터 태그 항체와 dpi, 핵 마스크 및 세포질 경계를 구분하기 위한 WGA로 염색하였습니다. 배양된 HeLa 세포는 녹색 형광이 나타나지 않아 GTGE의 내부 유입이 없음을 보여줍니다. 이것은 전기천공된 GTGE의 대표적인 사진 마이크로그래프이며, 세포 내로 도입된 이펙터 단백질을 보여줍니다.진핵생물 상호작용 파트너인 protein kinase N1을 검출하기 위한 western blot 결과입니다. 맨 오른쪽 레인은 두 개의 풀링된 큐벳을 포함하고 있음에 유의하십시오. 하나의 qve에서 나온 신호가 배경으로 섞여 들어갔으나, 50 µg/mL로 전기천공법을 수행한 후 공초점 현미경으로 관찰했을 때 pkn1은 베이트가 없는 대조군에서 보이는 결합 부재 상태보다 여전히 농축되어 있었습니다.S sph one hela 세포는 pkn one과 S SPH one 사이의 공국소화를 보여줍니다. 이러한 광학적 중첩은 이펙터와 호스트 단백질이 물리적으로 상호작용할 수 있을 만큼 충분히 가까이 있음을 나타냅니다. 이러한 상호작용이 핵 내에서 처음으로 확인되었다는 사실은 해당 단백질이 호스트에 의해 올바르게 수송되었다는 추가적인 근거를 제공합니다.이 기술을 숙달하면 고처리량 방식으로 수행할 수 있습니다. 여러 개별 단백질을 연구할 때, 이 절차를 시도하면서 각 세포 유형과 표적 단백질에 최적화된 전기천공 조건을 경험적으로 결정하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 이 절차를 통해 여러 단백질, 저분자 화합물 또는 이들의 조합을 다중화하여 다양한 모델 시스템에서의 세포 프로세스를 더 잘 이해할 수 있습니다.이 영상을 시청하고 나면, 포유류 세포에 단백질과 같은 거대 분자를 도입하기 위해 전기천공법(electroporation)을 어떻게 사용할 수 있는지 충분히 이해하게 될 것입니다.

electroporation-of-functional-bacterial-effectors-into-mammalian-cells

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

Mycobacterial 병원성 전략이 제대로 이해 남아있다. 대부분의 종의 느린 성장 속도, 세포 벽 뚫리지 자연과 병원균 작업의 위험이 연구 mycobacteria 어렵게하고 이러한 생물 우리의 가난한 이해하기위한 대부분 책임이 있습니다. 이 비디오에서 우리는 DNA의 항목을 허용하는 간단한 높은 전기 충격을 쓰는 세포를 포함 electroporation의 기술을 보여줄 것입니다. 그것은 mycobacterial 세포에 DNA를 도입을 위해 가장 널리 사용되는 방법입니다.

Mycobacteria의 Electroporation

출처: Stefan, A., et al., 대장균에서 단백질 공동 발현의 다면적인 이점. J. Vis. 경험. (2015년)이 비디오는 세포 준비, 전기천공, 회수 및 형질전환체 선택을 포함하여 항생제 내성 유전자를 운반하는 플라스미드로 대장균 을 형질전환하는 절차를 보여줍니다.

고전압 전기천공법을 이용한 박테리아의 제조 및 형질전환

출처: Berens, C. 외. 유도성 발현 시스템을 적용하여 박테리아 병원성 인자가 세포 내 신호 전달에 미치는 간섭을 연구합니다. J. Vis. 경험 (2015)이 영상은 박테리아 효과 단백질 CaeB가 숙주 세포자사멸 연쇄 반응을 방해하는 위치를 식별하기 위해 유도 발현 시스템을 사용하는 방법을 보여줍니다. 이 연구는 CaeB 발현 세포를 테트라사이클린 반응 시스템으로 형질전환하여 프로세포자사멸 유전자 발현을 유도하는 과정을 개괄하며, 이를 통해 연쇄 반응 내 교란 지점을 식별합니다.

박테리아 효과 단백질을 발현하는 세포로의 유도성 유전자 발현 시스템과의 형질전환

이 비디오에서는 전기천공법을 통해 박테리아 효과기 단백질을 포유류 세포에 도입하는 방법을 보여줍니다. 박테리아 effector 단백질의 세포 내 국소화는 특정 형광단 접합 항체로 염색한 후 컨포칼 현미경 검사에 의해 검출됩니다.

Electroporation에 의하여 포유류 세포로 Bacterial Effector 단백질의 소개

일렉트로 변형으로 알려진 공정에서 박테리아로 DNA를 도입하기위한 일반적으로 사용되는 방법이다. electrocompetent 세포의 제조를위한 기존의 프로토콜은 시간 소모적이고 노동 집약적이다. 이 문서는 다른, 빠른, 그리고 현재 일부 실험실에서 사용 electrocompetent 세포의 준비를위한 효율적인 방법을 설명합니다.

Electrocompetent의 준비를위한 신속한 프로토콜<em&gt; 대장균</em&gt;와<em&gt; 콜레라 균</em

Electroporation 셀에 관심사의 유전자를 전달 하는 효과적인 접근 이다. 적용 하 여이 접근에서 vivo에서 성인 마우스 지 루트 신경 절 (DRG)의 신경에, 축 삭 재생 비보를 공부 하는 모델을 설명 합니다.

성인 마우스 지 루트 신경 절의 Electroporation Vivo에서 조사 포유류 축 삭 재생:

여기에 제시된 단세포 전기기화는 체외 해마 슬라이스 배양 연령의 범위에 걸쳐 흥분성 및 억제 뉴런 모두에서 유전자를 전달할 수 있는 프로토콜입니다. 우리의 접근은 개별 적인 세포에 있는 유전자의 정확하고 능률적인 발현을 제공합니다, 세포 자율및 세포 간 기능을 검토하기 위하여 이용될 수 있는.

마우스 해마 흥분및 직업 별 억제 신경의 다른 organotypic 슬라이스 문화에 걸쳐 단세포 전기화

우리는 잠자는 숲속의 미녀 (SB) 트랜스포존 시스템을 사용하여 색소 상피 유래 인자 (PEDF)를 코딩하는 유전자로 전기 천공함으로써 1 차 인간 색소 상피 세포를 형질 감염시키는 프로토콜을 개발했습니다. 성공적인 형질감염은 정량적 중합효소연쇄반응(qPCR), 면역블로팅 및 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 입증되었다.

잠자는 숲속의 미녀 트랜스포존 시스템을 이용한 1차 인간 색소 상피 세포의 전기천공 기반 유전자 변형

플라스미드 DNA를 골격근으로 전기천공하는 것은 마우스의 근육 수축성을 손상시키지 않으면서 유전자 발현을 조절하는 실행 가능한 방법이다.

플라스미드 DNA를 마우스 골격근으로 전기천공

RNA로서 게놈 편집자를 전달하는 것은 1차 포유류 세포와 세포주의 게놈을 변형하는 데 특히 강력한 방법입니다. 이 프로토콜의 목표는 유전체 편집기를 mRNA로 1차 포유류 세포와 세포주에 전달한 후, 표적 Illumina 시퀀싱과 분석을 통해 편집 결과를 정량화하는 것입니다.

1차 포유류 세포에서 편집자 RNA의 전기천공을 통한 유전체 편집

배우세요 포유 동물 세포에 세균 이펙터 단백질을 전기영동으로 도입하는 방법을. 공초점 면역형광 현미경으로 단백질의 세포 내 위치와 기능을 분석하여 병원성 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

포유 동물 세포에 기능 세균 이펙터의 전기

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