포유 동물 세포에 기능 세균 이펙터의 전기

다음 실험의 전반적인 목표는 박테리아 효과기와 같은 외인성, 잠재적으로 세포독성이 있는 단백질을 포유류 세포에 도입하여 그 효과와 기능을 연구하는 것입니다. 이는 먼저 표준 배양 조건을 통해 포유류 세포를 성장시켜 정제된 관심 단백질을 도입할 수 있는 적절한 숙주와 같은 세포를 얻음으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 정제된 박테리아 효과기의 존재 하에서 배양된 숙주 세포의 전기천공이 수행되며, 이를 통해 단백질이 숙주 세포에 들어가 숙주 세포와 상호 작용할 수 있습니다.

다음으로, 이펙터 단백질의 세포 내 국소화 및 기능을 평가하기 위해 시각화 또는 기타 기능 분석이 수행됩니다. 컨포칼 현미경 검사, 면역화학적 방법 또는 기타 분석 기법을 기반으로 한 결과는 기능적 박테리아 효과기가 예상되는 세포 내 위치에 국한되고 알려진 상호 작용 파트너에 결합하는 것을 보여줍니다. transsection 또는 transduction과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 프로토콜이 잠재적인 세포 독성을 극복할 수 있는 빠르고 간단하며 저렴한 접근 방식이라는 것입니다.

이 방법은 박테리아 효과기 단백질의 기능에 대한 발견 또는 검증과 같은 병원체 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 박테리아 효과기 단백질에 대한 통찰력을 제공하는 데 사용되었지만 다른 단백질이나 작은 분자에도 적용할 수 있습니다. 결과를 시각화하는 것은 매우 중요합니다.

알려진 세포 특징과의 공동 국소화 이후, 전기천공된 단백질의 예상되는 세포 내 연관성을 확인하여 이 절차를 시작합니다. 400마이크로리터의 세포 현탁액을 사전 냉각된 베트로 옮깁니다. 그런 다음 선택한 단백질 20마이크로그램을 추가하여 밀리리터당 50마이크로그램의 최종 농도에 도달합니다.

수의사를 약 10회 정도 부드럽게 두드려 혼합하고 세포가 손상되지 않도록 합니다. 그런 다음 Q Vet의 외부를 종이 타월로 건조시켜 전기에서 전기 아크를 방지하십시오. 샘플을 전기에 넣고 전기천공 직후 1.5-1.7밀리초 동안 0.3킬로볼트로 설정합니다.

qve를 약 10회 부드럽게 두드려 시료를 완전히 혼합한 후 고정 및 면역형광 염색 또는 친화성 정제를 진행합니다. 전기천공법에서 4시간 동안 회복한 후 멸균 PBS로 세포를 세척합니다. 그런 다음 실온에서 2분 동안 100% 메탄올에 세포를 고정합니다.

그런 다음 멸균 PB S3로 세포를 더 세척합니다. PBS에서 0.4%tritton X 100으로 세포를 15분 동안 투여합니다. 투과제의 길이와 Triton X 100의 강도를 epitope와 타겟 단백질의 위치에 따라 조절합니다.

그런 다음 PBS에서 5%BSA가 있는 세포를 실온에서 1시간 동안 차단합니다. 나중. PBS로 세 번 씻으십시오. 다음으로, 항체 결합 용액의 기본 항체와 함께 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양하고 다음날 부드럽게 흔듭니다.

PBS로 세포를 4번 더 씻습니다. 그런 다음 항체 결합 용액에 적절한 형광 접합 2차 항체와 함께 배양합니다. 필요에 따라 Alexa 6 47 또는 DPI에 접합된 5마이크로몰, 밀 배아, 응집소 또는 WGA와 같은 다른 염색을 실온에서 1시간 동안 빛으로부터 보호합니다.

그런 다음 PBS로 세포를 5회 세척하고 이 단계에서 이미지화할 준비가 될 때까지 빛으로부터 보호된 섭씨 4도에서 보관합니다. 전기천공된 세포를 섭씨 4도의 PBS로 두 번 세척합니다. 4시간의 회복 후 얼음 위에 1ml의 용해 완충액으로 세포를 이가 만듭니다.

즉시 고무 경찰관으로 세포를 긁어내고 원뿔형 튜브에 모으십시오. 그런 다음 초음파 처리와 격렬한 소용돌이로 세포를 이가 만듭니다. 다음으로, 10, 000 시간에 표본을 분리기

섭씨 4도에서 10분 동안 중력을 유지하여 세포 파편과 불용성 응집체를 수집하고 상층액을 저장합니다. 1밀리리터의 정화된 전기천공 세포 용해물을 50마이크로리터의 아로스 수지 현탁액과 결합합니다. 혼합물을 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 종단 간 회전으로 배양하여 strp havein 결합 펩타이드 친화성 태그를 통해 전기천공된 단백질 및 관련 복합체를 포획합니다.

그 후, 2, 2 분 동안 500 배 중력에서 샘플을 원심 분리하고 상등액을 버립니다. 그런 다음 1ml의 PBS로 샘플을 두 번 세척합니다. 다음으로, 30마이크로리터의 XLDS 로딩 버퍼 4개, 증류된 H2O 20마이크로리터 및 0.5몰 TCEP 1마이크로리터를 시료에 첨가하고 약간의 상등액을 남깁니다.

샘플을 섭씨 95도에서 10분 동안 가열합니다. 그런 다음 얼음에 약 1분 동안 식힙니다. 그 후, 10, 5 분 동안 4 섭씨 온도에 중력의 000 시간에 표본을 분리기

마지막에는 적절한 항체와 함께 웨스턴 블롯에 대한 상층액을 수집합니다. 헬라 세포를 인큐베이션 또는 밀리리터당 50마이크로그램의 친화성 태그가 붙은 살모넬라 효과기, GTGE로 전기천공하고 안티 이펙터 태그 항체 dpi, 핵 마스크 및 WGA로 염색하여 세포질 경계를 설명하기 위해 배양된 헬라 세포는 GTGE의 내재화가 부족함을 나타내는 녹색 형광의 부재를 보여줍니다. 이것은 Electroporated GTG의 대표적인 현미경 사진으로, 표시된 세포 내 electroporated effector 단백질을 보여줍니다.

다음은 진핵 생물의 상호 작용 파트너인 사인 단백질 키나아제 N one을 검출하기 위한 서쪽 얼룩입니다. 맨 오른쪽 차선에는 두 개의 풀이 있는 큐벳이 있습니다. 1qve의 신호는 배경으로 혼합되었지만, pkn 1은 밀리리터당 50마이크로그램의 전기천공법 후 컨포칼 현미경에 의한 미끼 없음 대조군에서 볼 수 있는 결합 부족보다 여전히 풍부했습니다.

S sph one hela 세포는 pkn one과 S SPH one 사이의 공동 국소화를 보여줍니다. 이러한 광학적 중복은 effector와 host 단백질이 물리적으로 상호 작용할 수 있을 만큼 충분히 가깝다는 것을 나타냅니다. 그 상호작용이 처음으로 핵에서 나타났다는 사실은 단백질이 숙주에 의해 정확하게 교통되었다는 추가적인 지지를 제공한다.

이 기술을 마스터하면 높은 처리량 방식으로 수행할 수 있습니다. 여러 개별 단백질을 연구하기 위해 이 절차를 시도하는 동안 각 세포 유형 및 단백질 표적에 대한 최상의 전기천공 조건을 경험적으로 결정하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차를 통해 여러 단백질, 작은 분자 또는 이 둘의 조합으로 멀티플렉싱하여 다양한 모델 시스템에서 세포 과정을 더 잘 이해할

이 비디오를 시청한 후에는 단백질과 같은 거대분자를 포유류 세포에 도입하기 위해 전기천공법을 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.