질병 모델링을위한 근육 조직 검사에서 환자 유래 세포주의 분리 및 멸화

다음 실험의 전반적인 목표는 인간 환자의 근육 생검에서 정제된 근육 세포를 분리하고 후속 연구를 위해 불멸화하는 것입니다. 이는 먼저 수집된 조직의 무게를 측정하고, 다지고, 소화하여 단핵 세포를 해리함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 근육 세포는 사실에 의해 비 근육 세포에서 정제됩니다.

다음으로, 근육 세포는 CDK 4와 H turt에 모두 감염되어 불멸 세포를 생성합니다. 그 결과, 환자 유래 살아있는 근육 세포가 여러 계대에 걸쳐 확장될 수 있으며 세포 융합 분석법, 경련하는 근관의 존재 및 근육 생성 마커의 발현에 따라 분화될 수 있음을 보여줍니다. 이 기술의 의미는 근육 질환 진단을 넘어 확장되는데, 이는 약물 스크리닝 또는 많은 수의 세포가 필요한 기타 다운스트림 응용 분야를 위해 잠재적으로 무제한의 근육 세포를 제공할 수 있기 때문입니다.

저는 댈러스에 있는 Dr.Woody Wright 실험실의 박사후 연구원인 Jerome Robbin과 함께 절차를 시연할 것입니다. 근육 세포를 분리하여 근육 세포를 정화하는 것으로 시작합니다. 먼저 조직 배양 생물 안전성 후드에서 근육 생검의 질량을 기록합니다.

다음으로 10cm 접시에 멸균 메스를 사용하여 조직을 잘게 다진 조각으로 다집니다. 조직 1g당 조직이 건조하지 않도록 X-H-B-S-S 몇 방울을 추가합니다. 3.5ml의 디스크 페이스트 2와 3.5ml의 콜라겐 분해 효소 D 용액을 추가합니다.

그런 다음 세포를 25ml 피펫과 혼합하고 15분마다 플레이트를 인큐베이터로 옮깁니다. 90분 이내에 5ml 피펫으로 세포를 혼합합니다. 완전한 조직 해리가 있어야 합니다.

조직이 해리되면 두 부피의 성장 배지를 추가하고 100미크론 스트레이너를 통해 여과합니다. 50ml 튜브에 여과액을 모으십시오. 실온에서 329G의 여과액에서 10분 동안 세포를 펠렛

그런 다음 HBSS의 세포를 0.5%BS, A로 재현탁하고 계수합니다. 100마이크로리터당 100만 개의 셀을 얻을 수 있도록 부피를 조정합니다. 250, 000 세포 분취액을 염색되지 않은 대조군으로 따로 보관하고 단일 염색 대조군을 위해 두 개의 유사한 부분 표본을 따로 보관합니다.

이는 모두 팩스 분석에 필요합니다. 이제, 100만 개의 세포 당 56 항체의 5 microlit로 세포를 염색하고, 30분 동안 얼음에 모든 표본을 배양하십시오. 다음으로, 10ml의 HBSS로 샘플을 빠르게 세척합니다.

그런 다음 이전과 같이 세포를 펠릿화하되 세포가 펠릿화된 후 섭씨 4도에서 상등액을 버리고 세포 펠릿을 밀리리터당 500만 개의 세포로 하나의 X-H-B-S-S에 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 프로피듐 요오드화물을 밀리리터당 1마이크로그램의 최종 농도로 추가합니다. 이제 정제 플레이트에 따른 사실을 사용하여 비근육성 세포에서 myogenic CD 56 양성 세포를 정제합니다.

50에 myogenic 세포, 0.1%gelatin 문화로 입힌 6개의 좋은 판에 있는 우물 당 000, 붙어 있을 때까지 세포는, 그 후에 불멸의 세포주를 위한 바이러스로 그(것)들을 감염시킨다. 텍스트 프로토콜에는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 진피 섬유아세포를 정제하고 배양하는 방법에 대한 추가 검토가 있습니다. 피닉스 열대 세포를 플라스미드 PolyJet 혼합물로 하룻밤 동안 배양한 후 피닉스 열대 세포를 준비합니다.

DME M1의 4개 부분, 중간 부분, 1 99 및 10% 송아지 혈청의 4개 부분으로 구성된 신선하고 중간 크기의 세포를 공급합니다. 또한 수축성 포장을 준비하십시오. PA 3 17 셀은 약 400, 000 PA 3 17 셀이있는 6 웰 플레이트에 있습니다.

12시간 후, 상층액이 함유된 바이러스를 피닉스 열대 세포에 채취하여 0.45미크론 필터에 통과시킵니다. 그런 다음 상등액 1ml를 사용하여 PA 3 개의 17 세포를 감염시키고 밤새 배양합니다. 다음날, 세포가 cofluency에 가까울 때 배지에 밀리리터당 0.5mg의 항생제를 도포하여 PA 3 개의 17 세포에서 바이러스 생산 세포주를 선택하고 12 시간 간격으로 3 회 세포에서 상등액을 수확합니다.

각 수확 후 컬렉션을 필터링합니다. 여과액은 작동하는 바이러스 상층액입니다. 1밀리리터로 나눕니다. 부분 표본.

즉시 사용할 수 있도록 몇 가지 부분 표본을 따로 보관하십시오. 여분의 부분 표본은 섭씨 영하 80도에서 보관할 수 있지만 각 동결 해동 주기마다 50%의 효율이 손실됩니다. 공정 전반에 걸쳐 바이러스 입자에 닿은 장비는 쓰레기통에 버리기 전에 표백제를 세척해야 합니다.

안정된 PA 3 17 바이러스 생산 세포주를 영구적으로 저장하려면 세포를 10% DMSO 90% 혈청으로 동결하고 팩스 정제 세포의 각 웰에 섭씨 영하 150도에서 보관합니다. 6웰 플레이트에 갓 생산된 바이러스 상등액 400마이크로리터를 추가합니다. 바이러스가 없는 두 개의 웰을 대조군으로 두십시오.

플레이트를 밤새 배양하고 다음 날 각 웰의 배지를 2.5ml의 신선한 근육 배지로 변경합니다. 바이러스 입자가 포함된 미디어와 피펫은 표백제 용기에 폐기해야 합니다. 세포가 3일 동안 신선한 근육 배지에서 배양하도록 합니다.

그런 다음 CDK 4 감염의 경우 밀리리터당 400마이크로그램의 네오마이신을 사용하거나 인간 텔로머라아제의 경우 밀리리터당 300마이크로그램의 하이그로마이신을 사용하여 항생제 내성이 있는 세포를 선택합니다. 일주일 또는 2주 동안 역전사효소 감염. 세포와 대조군 웰이 모두 죽을 때까지 선택적 조건에서 세포를 유지합니다.

세포가 합류하기 전에 항상 세포를 계대시켜야 하며, 60-80%Co 유창성에 도달한 선택 중에도 0.05%트립신 EDTA 용액을 사용하여 세포를 수집하고 통과시킵니다. 세포를 항생제가 함유 된 배지 인 신선한 근 아세포로 10cm 접시에 통과시킵니다. 먼저 10cm 접시 당 3-500 개의 매우 낮은 밀도로 세포를 파종합니다.

작은 군체가 분명해질 때 10-20개의 세포로 구성된 작은 군체가 형성될 때까지 약 2주 동안 이 접시의 세포를 유지합니다. 세포가 건조되지 않도록 얇은 배지 필름만 남기고 대부분의 미디어를 제거합니다. 이제 클로닝 링의 한쪽 면을 실리콘 진공 그리스에 담그고 링을 원하는 클론 위에 놓습니다.

각 링에서 원하는 각 클론 주위에 다른 링을 놓습니다. 트립신 EDTA 용액을 몇 방울 떨어뜨립니다. 세포가 둥글게 만들어지면 현미경을 사용하여 각 세포 볼을 200마이크로리터 피펫 팁으로 조심스럽게 흡인합니다.

cell ball을 사용 가능한 가장 작은 multi-well plate의 well로 옮깁니다. 그런 다음 cofluency를 방지하기 위해 필요에 따라 각 클론을 확장합니다. 설명된 프로토콜을 사용하여 근육 세포를 섬유아세포, 지방 형성 세포 및 면역 세포와 함께 분리한 다음 사실에 의해 정제했습니다.

그런 다음 세포를 cyclin dependent kinase 4, CDK 4 및 human telomerase reverse transcriptase h turt를 발현하는 바이러스를 사용하여 기술된 대로 불멸화시켰습니다. 접시가 분화 프로그램에 들어가 myo tube를 형성할 수 있기 때문에 각 단계에서 접시를 co-fluency 이하로 유지하는 것이 중요했으며, 이는 non immortalized control cell과 immortalized cell의 myo tube formation 및 contraction을 비교하기 때문입니다. 차이는 나타나지 않았습니다.

세포주의 Immortal은 텔로미어 길이와 텔로미어 활성을 측정하여 확인되었습니다. 불멸은 세포 성장 곡선에서도 분명했습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 환자 생검에서 일차 근육 세포를 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

1차 근아세포를 불멸화하고 근생성 클론을 분리하고 선택합니다. 바이러스를 다루기 위해서는 특정 조직 배양과 안전한 환기 시스템을 사용해야 한다는 점을 잊지 마십시오. 또한 피펫, 팁, 접시, 주사기 및 필터와 같은 바이러스 조작과 관련된 모든 것은 원치 않는 오염을 방지하기 위해 표백해야 합니다.

바이러스 입자는 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 예방 조치를 취해야 합니다.