Name: 질병 모델링을위한 근육 조직 검사에서 환자 유래 세포주의 분리 및 멸화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: 배우세요 인간 근육 생검에서 근원세포를 분리하고 CDK4와 hTERT로 멸화하여 무제한 세포 공급원을 확보하는 방법. 이 기술은 근육 질환 연구와 약물 스크리닝에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 간행물은 Cure CMD와 AFM(Association Contre Les Myopathies) 보조금(프로젝트 16297) 및 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 자금 지원을 받습니다(보조금 번호 K08 AR059750, L40 AR057721 및 2R01NS047727).

참고 : 인체 조직의 수집을위한 프로토콜을 검토하고 기관 IRB위원회의 승인을 받아야한다. 폐기, 드 확인 된 인체 조직의 컬렉션은 보스턴 아동 병원과 브리검 여성 병원 IRB위원회에 의해 승인되었습니다. 후술하는 방법은 디 식별에서, 근원 세포의 분리를 위해 적용되어, 조직을 폐기. 설명 방법은 동의 환자 물질에​​서 수집 한 조직에 적용 할 수있다. 1. 세포 분리 <ol><li> 근육 조직 검사 및 근육 조직 세포의 정화의 해리 <ol><li> 조직의 양을 계산하는 근육 생검을 함유하는 접시를 다시 무게 - 후 해리를 위해 조직 배양 생물 안전성 후드에서 10cm 조직 배양 플레이트를 사전 달아. </li><li> 미세하게 멸균 메스, 말하다 근육 조직을 사용하고 마르지 조직을 방지하기 위해 멸균 1X HBSS 몇 방울을 추가합니다. </li><li> 3.5 ml의 디 각각 추가spase II 및 근육 조직의 그램 당 D 콜라게나 제 소화한다. 멸균 25 ML의 피펫을 통해 몇 번을 다진 조직과 효소 솔루션을 피펫. 15 분 동안 5 % CO 2, 37 ℃에서 조직 배양 인큐베이터에서 인큐베이션 플레이트를 슬러리 쉽게 5 ㎖ 멸균 피펫 비록 통과 할 때까지 조직을 소화. 주 : 조직 해리 보통 45-90 분 이내에 소화 효소에 의해 달성된다. 자세한 내용은 &#39;대표 결과&#39;섹션을 참조하십시오. </li><li> 329 XG (~ 1,100 RPM)을 첨가하고 실온에서 10 분 동안 50 ㎖ 원뿔형 튜브 및 세포 펠렛 위에 100 ㎛ 세포 스트레이너를 통해 해리 조직, 필터 멸균 성장 배지 2 볼륨을 추가. 미디어 컴포지션 재료 표를 참조하십시오. </li><li> 멸균 된 성장 배지의 1 부피에 펠렛을 재현 탁하고 7 볼륨을 적혈구 세포 용해 액을 합한다. 40 μm의 셀 스트레이너를 통해 솔루션을 필터링 한 후 t 펠렛329 XG에 10 분, 실내 온도 그는 세포. </li><li> 혈구 세포의 개수를 1 × 106 세포 / 100 ㎕의 농도로 HBSS 1X 0.5 % BSA에서 세포를 재현 탁. 따로 설정 ~ 음 (흠) 제어에 사용되는 단일 관에서 25 만 셀. FACS 정렬하여 CD56 양성 세포의 적절한 게이팅에 필요한 요오드화 프로피 듐 및 CD56 따로 추가 단일 색 스테인드 제어 튜브를 설정합니다. 정렬 매뉴얼 셀 또는 적절한 컨트롤을 보장하는 핵심 설비 전문가를 정렬 FACS가 포함되어 있습니다에 문의하기를 참조하십시오. </li><li> 얼룩 세포는 항 CD56 항체의 5μL / 10 6 세포를 정렬 할 수 있습니다. 30 분 동안 얼음에 (통제를​​ 포함한) 모든 샘플을 품어. </li><li> 10 ㎖의 1X HBSS에 워시 샘플 및 펠릿 세포 냉장 원심 분리기 329 XG (~ 1,100 RPM), 4 ° C의 온도에서 10 분 동안. </li><li> SOR되도록 시료 1μg / ml의 최종 농도로 요오드화 프로피 듐 추가죽은 세포의 배제 테드. 형광 활성화 된 세포 선별기를 이용하여 비 - 근육 조직 세포로부터의 근원 성 CD56 양성 세포를 정제 하였다. </li></ol></li><li> 피부 생검의 해리 참고 : 근육 조직 검사를 사용할 수없는 경우 피부 섬유 아 세포는 환자의 피부 펀치에서 고립 될 수있다. 피부 섬유 아세포는 근육 조직 세포를 생성하는 형질 MyoD 함께 포함하여 많은 연구를위한 생체 물질로서 사용될 수있다. 또한, 피부 섬유 아세포는 더 깊은 연구 다양한 세포 유형으로 분화 될 수 IPS 세포를 생성하는데 사용될 수있다. <ol><li> 교통 매체의 실험실로 피부 생검을 전송. 샘플이 수신되면, 가능한 빨리 초대 배양을 수행한다. 일차 배양 당일에 확립 될 수없는 경우, 실온에서 밤새 샘플을 저장한다. </li><li> 층류 후드 멸균 35mm 페트리 접시에 피부 생검을 전송합니다. </li><li> 멸균 1 페트리 접시에 피부 조직 검사를 씻어X PBS는 혈액과 이물질을 제거합니다. 멸균 메스 지방 조직을 제거합니다. </li><li> 2 ㎖의 콜라게나 제 용액을 첨가하고 메스 말하다 조직, 조직의 크기에 따라 1 시간 45 분 동안 37 ° C에서 배양한다. </li><li> , 15ml의 원뿔형 튜브에 소화 조직 전송 배 섬유 아세포 배양 배지 2 ㎖로 배양 접시 린스하고 동일한 튜브에서 매체를 수집한다. </li><li> 실온에서 5 분 동안 200 XG에서 세포 펠렛. </li><li> 상층 액을 제거하고 다시 다음, 펠렛 세포를 콜라겐을 제거하는 섬유 아세포 매체의 3 ml의 펠렛을 씻는다. 미디어 컴포지션 재료 표를 참조하십시오. </li><li> 단계 1.2.7 한 번 더 반복합니다. </li><li> T25 무균 조직 배양 플라스크 위에 5 ml의 섬유 아세포 매체와 플레이트 세포 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 5 % CO 2와 37 ° C에서 플라스크를 품어. </li><li> 다음 1~3일을 통해 섬유 아세포의 부착과 성장을위한 문화를 평가합니다. &lt;BR /&gt; 참고 : 일부 작은 조직 조각은 또한 판에 부착 할 수 있고 섬유 아세포이 조직의 조각을 이동한다. </li><li> 섬유 아세포는 약 80 %의 합류로 성장 될 때까지 동일한 조건에서 문화를 유지한다. </li><li> 트립신에 의해 섬유 아세포를 수집하고 추가 확장을위한 신선한 배양 플라스크에 전송합니다. 칼슘 ++ 및 마그네슘 ++의 무료 문화를 1X PBS에서 3 회 세척하여 트립신을 수행합니다. 37 ° C에서 2 분 동안 세포 (2 ㎖ / T25 플라스크)에 트립신 - EDTA (참조 자료 표)를 추가합니다. </li><li> 추가 플라스크에 분리 된 세포를 분할합니다. 일부 조직 조각이 원래 T25 플라스크에 연결된 상태를 유지하는 경우,이 플라스크에 5 ml의 신선한 문화 매체를 추가하고 더 많은 섬유 아세포는 지속적으로 밖으로 이동합니다. 참고 : 확장 된 섬유 아세포 문화 P1로 아래로 냉동 및 미래의 실험을 위해 액체 질소에 저장할 수 있습니다. </li></ol></li></ol> 근육 조직 세포의 2 멸화 <ol><lI&gt; 4 박의 비율 DMEM 중소기업 199에서 10cm 무균 조직 배양 플레이트에 플레이트 5 백만 피닉스 Ecotropic 포장 세포 (PE) : 10 % 송아지 혈청 1. </li><li> 10 mM의 카페인 보충 신선한 매체의 5 mL를 형질에 30 분 전에 피드 세포. </li><li> MIDI 준비 (CDK4 또는 플라스미드는 hTERT) 및 polyjet으로부터 플라스미드 DNA의 2 μg의 혼합물을 균질화하고 제조업체에서 권장, 15 분 동안 실온에서 배양한다. </li><li> 밤새 PE 세포에 플라스미드 / polyjet 혼합물을 추가합니다. </li><li> 신선한 배지로 피드 세포 (DMEM 및 (4)의 중간 (199) 비율 : 10 % 송아지 혈청 1). 12 시간 후, 바이러스 - 함유 상등액을 모으고 0.45 ㎛의 공극 크기의 필터를 통해 필터링. </li><li> (G41 밤새 amphotropic 패키징 세포주 PA317 5를 감염 수집 상청액 1 ㎖를 사용하거나, 0.5 ㎎ / ㎖로 네오 마이신 선택 후 안정한 바이러스 - 생산 세포주를 얻기8) CDK4 또는 0.5 mg을 위해 /의 hTERT에 대한 하이 그로 마이신 ㎖로. </li><li> 다음 세 가지 수확의 상층 액을 매일 아침, 저녁과 아침을 수확, 근처 포화 상태에 안정적으로 포장 세포를 성장시켜 바이러스 상층 액을 작업 준비합니다. </li><li> 바이러스 상층 액을 여과하고, 직접 나중에 사용하기 위해 -80 ° C에서 1 ml의 분취 량 및 저장에 사용하거나 나눕니다. 바이러스 상등액을 각각 동결 - 해동로 50 %의 감염 효율이 없어집니다. 표백 세척을하기 위해 바이러스 입자를 만진 모든 것을 폐기하기 전에 기억하십시오. 주 : 안정 PA317 바이러스 생산 세포주 냉동 영구 저장 -150 ° C로 유지 될 수있다 (중간 동결하는 10 % DMSO이다 혈청 90 %). </li><li> 플레이트 FACS 정제 근원 성 세포 / 웰을 0.1 % 젤라틴으로 코팅 된 6- 웰 플레이트에 5 × 104 세포의 밀도 (1.1-1.9 단계에서 설명). 세포가 바이러스 감염으로 진행하기 전에 판에 제대로 연결되어 있는지 확인하십시오. </li><li> F, 필터링 400 μl를 추가reshly 하룻밤 (컨트롤로이 우물을 유지) 각 여섯 웰 플레이트에 바이러스 상층 액 또는 냉동 분량을 생산했다. </li><li> 2.5 ㎖ / 웰의 신선 근육 매체 (4 세포를 공급함으로써 변화 매체 : 0.02 M HEPES 완충액; 1.4 ㎎ / L 비타민 B12, 15 % 소 태아 혈청으로 보충 한 둘 베코 변형 이글 배지 (DMEM) 및 매체 (199) 0.03 mg의 / L의 ZnSO4, 0.055 ㎎ / L 덱사메타손, 2.5 ㎍ / L 간세포 성장 인자 및 10 ㎍ / L 염기성 섬유 아세포 성장 인자). 표백제 용기에 바이러스 입자를 함유하는 매체 및 피펫 버린다. 삼일 후, 감염에서 회복 400 ㎍ / ㎖의 네오 마이신 (CDK4 감염) 또는 300 ㎍ / ml의 하이 그로 마이신 (의 hTERT 감염)을 사용하여 선택을 치료하는 데에 동일한 배지에서 세포를 남겨주세요. </li><li> 제어 요리 다이의 셀 (1-2 주)까지 약물 선택에 따라 세포를 유지한다. </li><li> 심지어 selecti 동안 (EDTA 0.05 % 트립신을 사용하여 컨 플루를 60 내지 80 %의 밀집 상태) 통로 세포들은 합류되기 전에기간에. 선택 약물로 보충 신선한 근원 세포 매체와 여러 10cm 요리를 Replate 세포 (2.11에서 설명). 이종 집단으로 불멸화 선택된 셀을 유지하거나 완전히 균질 유전 적 배경 (모든 셀에서 동일한 트랜스 진의 삽입)을 얻었다 복제. </li><li> 다음 단계를 사용하여 클론 선택을 수행합니다 : <ol><li> 작은 식민지가 (10 ~ 20 세포)이 형성 될 때까지, 저밀도 (예 : 10cm 요리를 300-500 세포)에서 세포를 씨와 약 2 주 동안을 유지한다. </li><li> 마르지 않도록 세포 박막만을 남겨이 시점에서 매체의 대부분을 제거한다. </li><li> (일단 실리콘 진공 그리스에 담근에) 원하는 각 복제를 통해 복제 링을 놓고 트립신 / EDTA 몇 방울을 추가합니다. </li><li> 수확 세포들은 조심스럽게 1 ml의 끝이나 파스퇴르 피펫을 사용하여 세포를 흡입하고 사용할 수있는 가장 작은 멀티 웰 괞 찮아로 전송 반올림이 되시면테 (96 또는 48, 24 또는 12 웰 플레이트). </li><li> 지역의 포화 상태를 방지하기 위해 필요에 따라 복제를 확장합니다. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Flanigan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Neurol%22%5BJournal%5D)">The muscular dystrophies.</a> Semin Neurol. 32, 255-263 (2012).</li>
<li>Mercuri, E., Muntoni, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Muscular dystrophies.</a> Lancet. 381, 845-860 (2013).</li>
<li>Sharples, A. P., Stewart, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myoblast+models+of+skeletal+muscle+hypertrophy+and+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Clin+Nutr+Metab+Care%22%5BJournal%5D)">Myoblast models of skeletal muscle hypertrophy and atrophy.</a> Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 14, 230-236 (2011).</li>
<li>Tran, T., Andersen, R., Sherman, S. P., Pyle, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+skeletal+muscle+development+and+applications+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Insights into skeletal muscle development and applications in regenerative medicine.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 300, 51-83 (2013).</li>
<li>Miller, A. D., Buttimore, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redesign+of+retrovirus+packaging+cell+lines+to+avoid+recombination+leading+to+helper+virus+production%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Redesign of retrovirus packaging cell lines to avoid recombination leading to helper virus production.</a> Mol Cell Biol. 6, 2895-2902 (1986).</li>
<li>Schubert, W., Zimmermann, K., Cramer, M., Starzinski-Powitz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+antigen+Leu-19+as+a+molecular+marker+of+regeneration+in+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte antigen Leu-19 as a molecular marker of regeneration in human skeletal muscle.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 307-311 (1989).</li>
<li>Mechtersheimer, G., Staudter, M., Moller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+natural+killer+%28NK%29+cell-associated+antigen+CD56%28Leu-19%29%2C+which+is+identical+to+the+140-kDa+isoform+of+N-CAM%2C+in+neural+and+skeletal+muscle+cells+and+tumors+derived+therefrom%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Expression of the natural killer (NK) cell-associated antigen CD56(Leu-19), which is identical to the 140-kDa isoform of N-CAM, in neural and skeletal muscle cells and tumors derived therefrom.</a> Ann N Y Acad Sci. 650, 311-316 (1992).</li>
<li>Pavlath, G. K., Gussoni, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+myoblasts+and+muscle-derived+SP+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Human myoblasts and muscle-derived SP cells.</a> Methods Mol Med. 107, 97-110 (2005).</li>
<li>Boldrin, L., Muntoni, F., Morgan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+human+and+mouse+satellite+cells+really+the+same%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Are human and mouse satellite cells really the same.</a> J Histochem Cytochem. 58, 941-955 (2010).</li>
<li>Belles-Isles, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+selection+of+donor+myoblast+clones+for+muscular+dystrophy+therapy+using+cell+surface+expression+of+NCAM%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Histochem%22%5BJournal%5D)">Rapid selection of donor myoblast clones for muscular dystrophy therapy using cell surface expression of NCAM.</a> Eur J Histochem. 37, 375-380 (1993).</li>
<li>Meng, J., Adkin, C. F., Xu, S. W., Muntoni, F., Morgan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+human+muscle-derived+cells+to+skeletal+muscle+regeneration+in+dystrophic+host+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Contribution of human muscle-derived cells to skeletal muscle regeneration in dystrophic host mice.</a> PLoS One. 6, e17454(2011).</li>
<li>Zhu, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence+in+human+myoblasts+is+overcome+by+human+telomerase+reverse+transcriptase+and+cyclin-dependent+kinase+4%3A+consequences+in+aging+muscle+and+therapeutic+strategies+for+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence in human myoblasts is overcome by human telomerase reverse transcriptase and cyclin-dependent kinase 4: consequences in aging muscle and therapeutic strategies for muscular dystrophies.</a> Aging Cell. 6, 515-523 (2007).</li>
<li>Mamchaoui, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+pathological+human+myoblasts%3A+towards+a+universal+tool+for+the+study+of+neuromuscular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Skelet+Muscle%22%5BJournal%5D)">Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders.</a> Skelet Muscle. 1, 34(2011).</li>
<li>Sigmund, C. D., Stec, D. E. Genetic Manipulation of the Renin-Angiotensin System Using Cre-loxP-Recombinase. Methods Mol Med. 51, 53-65 (2001).</li>
<li>Ludlow, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+telomerase+enzyme+activity+determination+using+droplet+digital+PCR+with+single+cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative telomerase enzyme activity determination using droplet digital PCR with single cell resolution.</a> Nucleic Acids Res. 42, e104(2014).</li>
<li>Jankowski, R. J., Haluszczak, C., Trucco, M., Huard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+characterization+of+myogenic+cell+populations+obtained+via+the+preplate+technique%3A+potential+for+rapid+isolation+of+muscle-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric characterization of myogenic cell populations obtained via the preplate technique: potential for rapid isolation of muscle-derived stem cells.</a> Hum Gene Ther. 12, 619-628 (2001).</li>
<li>Gharaibeh, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+slowly+adhering+cell+fraction+containing+stem+cells+from+murine+skeletal+muscle+by+the+preplate+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of a slowly adhering cell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by the preplate technique.</a> Nat Protoc. 3, 1501-1509 (2008).</li>
<li>Qu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+approaches+to+improve+cell+survival+in+myoblast+transfer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy.</a> J Cell Biol. 142, 1257-1267 (1998).</li>
<li>Choi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyoD+converts+primary+dermal+fibroblasts%2C+chondroblasts%2C+smooth+muscle%2C+and+retinal+pigmented+epithelial+cells+into+striated+mononucleated+myoblasts+and+multinucleated+myotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MyoD converts primary dermal fibroblasts, chondroblasts, smooth muscle, and retinal pigmented epithelial cells into striated mononucleated myoblasts and multinucleated myotubes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 7988-7992 (1990).</li>
<li>Huard, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+dermal+fibroblasts+expressing+MyoD1+in+mouse+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Transplantation of dermal fibroblasts expressing MyoD1 in mouse muscles.</a> Biochem Biophys Res Commun. 248, 648-654 (1998).</li>
<li>Lattanzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+myogenic+conversion+of+human+fibroblasts+by+adenoviral+vector-mediated+MyoD+gene+transfer.+An+alternative+strategy+for+ex+vivo+gene+therapy+of+primary+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">High efficiency myogenic conversion of human fibroblasts by adenoviral vector-mediated MyoD gene transfer. An alternative strategy for ex vivo gene therapy of primary myopathies.</a> J Clin Invest. 101, 2119-2128 (1998).</li>
<li>Park, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+modulates+Wnt+signalling+by+association+with+target+gene+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Telomerase modulates Wnt signalling by association with target gene chromatin.</a> Nature. 460, 66-72 (2009).</li>
</ol>

저자는 공개할 것이 없습니다.

유용한 자원으로 세포 질병의 체외 모델에서 질병의 표현형을 설정할 때, 근원 세포 집단의 분리 및 배양은 매우 유용합니다. 여기에 설명 근원 성 세포 분리 과정은, 전파 분화, 또는 즉시 분석 할 수 골격근 시험편 근모 섬유 아세포의 분리를 허용한다. 근원 세포의 구조와 기능은 세포 생존, 세포 융합의 평가의 평가 또는 RNA 또는 단백질 분자의 발현 연구를 통해, 현미경 검사를 통해 평가 될 수있다. 또한 아세포는 조직 손상 다음 근육 발달과 회복의 맥락에서 근원 세포 기능의 직접적인 평가를 허용 미성숙 근섬유의 많은 특징을 공유 myotubes로 분화 될 수있다. 이러한 표현형의 모든 근육 조직 세포의 초기 구절이 비슷한 재현하는 경향이 있지만, 많은 차 m의 동작yogenic 세포주 많은 통로에 걸쳐 변경 될 수있다. 그 결과, (1.1.2) 배양 시설의 편의성 및 장기간에 걸쳐 재현 가능한 결과들의 생성을 용이하게 할 수있는 소정의 근원 성 세포주 불멸...

A correction was made to the authors section in: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling
One of the authors names was corrected from:
Stacy C. Cossette
to:
Stacy A. Cossette

A correction was made to the authors section in: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

Erratum: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

분자 진단은 지난 20년 동안 극적으로 발전했습니다. 게놈 DNA는 이제 가래나 뺨 면봉에서 일상적으로 분리되지만 과거에는 채혈이 필요했습니다. 현재 처리 시간이 빠르고 유전자 염기서열 분석이 용이하기 때문에 많은 질병 돌연변이가 추가 검사 없이 일상적으로 확인됩니다. 근육 질환 진단의 경우, 지난 10년 동안 근이영양증(muscular dystrophy) 또는 근병증(myopathy)의 원인이 되는 수십 개의 새로운 유전자가 확인됨에 따라 이러한 질병을 진단하는 방식이 극적으로 바뀌었습니다 1,2. 현재 근이영양증과 선천성 근병증의 원인으로 확인된 유전자는 수십 가지가 있지만, 이러한 유전자 중 많은 수가 질병을 유발하는 메커니즘은 불분명합니다. 특히 희귀 질환은 환자 집단의 규모가 작기 때문에 문제가 됩니다. 이러한 사례뿐만 아니라 더 흔한 질병의 경우, 발병 기전에 대한 연구를 촉진하고 치료 약물을 스크리닝하는 안정적인 도구를 생성하는 것이 매우 바람직합니다. 
DNA 진단의 극적인 발전에도 불구하고, 원발성 대사 질환 또는 근육 질환이 의심되는 많은 환자에서 1차 진단을 내리기 위해 근육 생검이 여전히 시행되고 있습니다. 근육 생검이 필요한 경우, 환자의 추가 이환율 위험을 최소화하면서 추가 진단 및 연구 조직 채취의 기회를 제공합니다. 각 조직 표본에 대한 많은 용도가 있기 때문에 간단하고 효율적이며 최소한의 조직을 필요로 하는 수술 조직을 사용하여 1차 세포 배양을 위한 기술을 확립하는 것이 매우 바람직합니다. 조직에서 일차 세포를 최대한 분리하고 살아있는 물질을 장기간 보관하기 위해 근육 또는 피부 생검의 적절한 분류가 필요합니다. 또한 줄기세포 연구 및 약물 스크리닝은 세포 기반 분석을 사용하여 많은 질병에 대한 치료법을 개발할 수 있는 큰 가능성을 가지고 있습니다 3,4.
본 문서에서는 인간의 근육 또는 피부 생검에서 일차 세포를 분리하는 방법을 설명합니다. 또한, 우리는 개인으로부터 많은 수의 세포를 생성하는 데 유용한 근육 세포의 불멸화를 위한 프로토콜을 포함합니다. 이러한 세포는 맞춤형 약물 스크리닝과 같은 다운스트림 응용 분야에 사용할 수 있으며, 그렇지 않으면 일차 조직에서 얻은 세포의 수가 전반적으로 적기 때문에 달성할 수 없습니다.

<table><tbody><tr><td>장비</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>조직&nbsp; 문화 생물 안전 후드</td><td>Baker Company, Inc.</td><td>모델 SterilGuard 후드</td><td></td></tr><tr><td>벤치탑 원심 분리기, 예 : Beckman 모델&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>모델 Allegra 6R</td><td>세포 분류가 수행되면 냉장 기능이 있는 원심분리기가 선호됩니다</td></tr>. <tr><td>현미경</td><td>Nikon</td><td>Model Eclipse TS100</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 인큐베이터, CO2 소스에 연결</td>됨 <td>Forma Scientific&nbsp;</td><td>Series II</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence-activated cell sorter (FACS)</td><td>Becton Dickinson</td><td>Model Aria</td><td></td></tr><tr><td>조직에서 주요 근아세포</td><td></td><td></td><td></td>를 분리하기 위한 시약</tr><tr><td>Dispase II</td><td>Roche Applied Science</td><td>#04942078001</td> DMEM Collagenase D&nbsp<td>에서 2.4U/ml의 양말 용액을 준비합니다</td></tr><tr><td>.</td><td>Roche Applied Science</td><td>#088882001</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>1x Sterile Hank'의 원액을 준비합니다. s Balanced Saline Solution (HBSS), 칼슘 및 마그네슘 무료</td><td>GIBCO Life Technologies</td><td>#14185-052</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민, 분획 V</td><td>Sigma</td><td>#05470</td><td>FACS 분류를 위한 1X HBSS 0.5% BSA의 멸균 용액을 준비합니다</td></tr><tr><td>. 근아세포를 위한 멸균 성장 배지: Dulbecco' 의 변형된 독수리' s 고포도당(4.5g) 함유 30% 소 태아 혈청</td><td>GIBCO Life Technologies</td><td>11965-092</td><td>L-글루타민</td></tr><tr><td>RBC 용해 용액</td> 포함 <td>Qiagen</td><td>158904</td><td></td></tr><tr><td>Propidium Iodide 스톡 10mg/ml</td><td>Sigma</td><td>P4170</td><td>멸균 증류수에 분말을 희석하여 스톡 용액 준비</td></tr><tr><td>유세포 분석을 위한 항인간 CD56 항체</td><td>Biolegend</td><td>318310</td><td>APC-접합 항체, 기타 라벨은 사용 가능</td></tr><tr><td>1차 근아세포</td><td></td><td></td><td></td>의 불멸화를 위한 시약</tr><tr><td>친환경성 패키징 세포주 PE</td><td>Cell Biolabs</td><td>RV-101</td><td></td></tr><tr><td>양쪽 친화성 패키징 세포주 PA3174</td><td>Cell Biolabs</td><td>RV-102</td><td></td></tr><tr><td>돼지 피부 젤라틴</td><td>Sigma</td><td>G1890-500g</td><td>물에 0.1% 젤라틴의 원액을 준비합니다. 접시에 용액을 37°C로 코팅합니다. C를 1시간 동안 사용합니다. 용액을 제거하고 매체를 추가합니다.</td></tr><tr><td>폴리젯&nbsp;</td><td>Signagen</td><td>SL100688</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Fisher</td><td>345812</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin</td><td>EMD Biosciences</td><td>400051</td><td></td></tr><tr><td>pBabe plasmids containing mCDK4 and hTERT</td><td>not commercial available</td><td></td><td>Stadler et al, 2013</td></tr><tr><td>Qiagen plasmid midiprep kit</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>미디엄 199 (31150022)</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s 변형 이글 매체 (DMEM)</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>DMEM (11965-092)</td> <td>믹스 4 : 1 DMEM : 199</td></tr><tr><td>Myoblast 성장 매체 : 4 : 1 Dulbecco ' s 변형 이글 배지(DMEM) 및 배지 199에는 15% 소 태아 혈청이 보충되었습니다. 0.02 M HEPES 완충액; 1.4 mg/L 비타민 B12; 0.03 mg/L ZnSO4, 0.055 mg/L 덱사메타손, 2.5 &μ; g/L 간세포 성장 인자 및 10 &mu; g/L 베타 섬유아세포 성장 인자.</td><td>생명 공학(DMEM, F199); 애틀랜타 생물학(FBS); 인비트로겐(Hepes); 피셔 (ZincSulfate); 시그마(Vit.B12, 덱사메타손); 케미콘 인터내셔널(HGF); 바이오파이오니어(betaFGF)&nbsp;</td><td>#15630-080 (Hepes); #Z68-500 (ZnSO); #V2876.#D4902 (Vit.B12, Dex); GF116 (HGF); HRP-0011 (bFGF).&nbsp;</td><td>배지 및 원액 Vit. B12 (20mg/ml)를 준비합니다. 아연설페이트(60&마이크로; g/ml); 덱스(55&마이크로; g/&마이크로; l) 더 쉽게 사용할 수 있도록 별도로 사용하십시오. HGF 원액(5&micro; g/ml) 및 FGF(20&micro; g/ml)는 최종 작업 농도에서 매주 새로 첨가해야 합니다.</td></tr><tr><td>TrypLE express</td><td>GIBCO Life Technologies</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>면역염색을 위한 미오신 중쇄 항체</td><td>Developmental Hybridoma Bank</td><td>MF20</td><td>Clone MF20</td></tr><tr><td>면역염색을 위한 Desmin 항체</td><td>Thermo Scientific</td><td>MS-376-S0</td><td>Clone D33</td></tr><tr><td>Horse serum</td><td>Invitrogen</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>1차 피부 섬유아세포 분리를 위한 시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>수송 배지: 10% 소 태아 혈청 및 0.2% 페니실린/스트렙토마이신</td><td>RPMI 배지 보충 RPMI 1640: GIBCO Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>인간 1차 섬유아세포 배양 배지: 10% 소 태아 혈청 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 소 태아 혈청이 보충된 RPMI 1640</td><td>: Thermo Scientific</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 용액 : 12.5ml의 섬유 아세포 배양 배지 및 필터 멸균</td><td>Worthington</td><td>4176</td><td></td></tr><tr><td>멸균 1X 인산염 완충액 식염수 (PBS) 칼슘 및 마그네슘 무함유</td><td>Lonza</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>1 차 근 세포</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml 및 15 ml 멸균 원추형 튜브</td> 분리용 재료 <td>GeneMate / Bioexpress</td><td>C-3394-4 (50 ml) ; C3394-1 (15 ml))멸</td><td></td></tr><tr><td>균 메스</td><td>Aspen Surgical</td><td>372610</td><td></td></tr><tr><td>혈구계</td><td>Hausser Scientific</td><td>1492</td><td></td></tr><tr><td>멸균 5, 10 및 25 ml 피펫</td><td>Bellco glass</td><td>1226-05010 (5 ml); 1200-10010 (10 ml) ; 1228-25050 (25 ml)</td><td>재사용 가능한 피펫은 사용 전에 세척, 면 플러그 및 오토클레이브 멸</td></tr><tr><td>균 조직 배양 처리 플라스틱 접시 (10 cm)</td><td>BD Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>멸균 나일론 셀 스트레이너 (100 &micro; m 및 40 &마이크로; m 사이즈)</td><td>BD 팔콘</td><td>352340 (40&마이크로; m); 352360(100&마이크로; m)</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; myoblast immortalization</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile 0.45 &micro를 위한 재료; m 필터</td><td>Millipore</td><td>SLHV013SL</td><td></td></tr><tr><td>클로닝 링</td><td>Corning</td><td>#3166-8</td><td>사용 전후에 세척 및 고압클레이</td></tr>브 해야 합니다. <tr><td>섬유아세포 세포주용 재료&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>멸균 35mm 조직 배양 처리된 플라스틱 접시</td><td>Greiner bio-one</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>멸균 메스</td><td>DeRoyal</td><td>D4510A</td><td></td></tr><tr><td>멸균 T25 조직 배양 플라스크</td><td>테크노 플라스틱 제품, MIDSCI</td> TrypLE express GIBCO Life Technologies 12605-010 <td></td><td></td> 에 의해 미국에서 판매된 TPP 90026</tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

질병 모델링을위한 근육 조직 검사에서 환자 유래 세포주의 분리 및 멸화

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

환자 특이적 세포주의 생성은 진단 또는 중개 연구를 위한 매우 유용한 도구이며, 이러한 세포는 환자의 진단 정밀 검사 중에 사용할 수 있는 피부 또는 근육 생검 조직에서 수집할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 일차 세포 배양을 위해 소량의 근육 또는 피부 조직에서 살아있는 세포를 분리하는 기술에 대해 설명합니다. 또한, 우리는 일차 세포에서 myogenic cell line과 fibroblast cell line을 불멸화하는 기술을 제공합니다. 일단 세포주가 불멸화되면, 환자 유래 세포의 상당한 증식이 달성될 수 있습니다. 불멸화된 세포는 약물 스크리닝 및 유전자 돌연변이의 체외 교정을 포함한 많은 다운스트림 응용 분야에 적용할 수 있습니다. 전체적으로 이러한 프로토콜은 다운스트림 애플리케이션을 위해 환자 유래 세포를 생성하고 보존할 수 있는 신뢰할 수 있는 도구를 제공합니다.

도 1은 주 조직 분해에 관여하는 주요 단계들을 도시한다 : 조직의 정확한 양은 (도 1A, B) 멸균 조직 배양 용 배양 접시에 칭량된다. 티슈 슬러리 (도 1C, D)를 구할 때까지 조직이어서 미세 멸균 다진 메스를 사용한다. 분해 효소를 첨가 한 다음에, 주 근조직 해리는 대개 45-90 분 이내에 소화 효소에 의해 달성된다. 소화 조직의 진행은 통상적 overdigestion 및 세포 사멸을 방지하기 위해 15 ~ 20 분마다 모니터링된다. 효소 소화 부드럽게 피펫하고 몇 시간마다 15 ~ 20 분을 혼합 할 수 있습니다. 소화 단계의 마지막에, 세포를 100 ㎛ (도 1E, F) 다음, 40 ㎛의 필터를 통해 여과된다. 근조직의 개시 량에 따라 그리고 샘플 또는 약간 심하게 영향을받는 근육, 해리 CEL 차로부터 얻어 졌는지LS 이질적인 것이다.도 1H는 다음의 <st...

이 프로토콜은 근육 또는 피부 조직에서 근육 및 섬유아세포 세포주의 살아있는 세포를 분리하고 1차 배양하는 기술을 설명합니다. 이러한 세포주를 불멸화하는 기술도 설명됩니다. 전체적으로 이러한 프로토콜은 다운스트림 애플리케이션을 위해 환자 유래 세포를 생성하고 보존할 수 있는 신뢰할 수 있는 도구를 제공합니다.

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

다음 실험의 전반적인 목표는 인간 환자의 근육 생검 조직으로부터 정제된 근육 세포를 분리하고, 이를 불멸화하여 후속 연구에 활용하는 것입니다. 이를 위해 먼저 수집된 조직의 무게를 측정한 후, 이를 잘게 다지고 소화시켜 단핵 세포를 해리합니다. 두 번째 단계에서는 FACS를 통해 비근원성 세포로부터 근원성 세포를 정제합니다.다음으로, 불멸화 세포를 생성하기 위해 근원성 세포에 CDK4와 hTERT를 모두 감염시킵니다. 결과에 따르면 환자 유래 생존 근육 세포를 여러 세대 동안 배양 및 확장할 수 있으며, 세포 융합 분석, 수축하는 근관의 존재 및 근원성 마커의 발현을 통해 분화됨을 확인할 수 있습니다. 이 기술의 함의는 근육 질환의 진단을 넘어, 많은 수의 세포가 필요한 약물 스크리닝이나 기타 후속 응용 분야에 무제한의 근원성 세포를 제공할 수 있다는 가능성까지 확장됩니다.저는 달라스에 있는 Dr.Woody Wright 연구실의 박사후 연구원인 Jerome Robbin과 함께 이 절차를 시연하겠습니다. 먼저 근육 생검 조직을 해리하여 근원성 세포를 정제하는 것부터 시작합니다. 우선 조직 배양 생물 안전 작업대(biosafety hood) 내에서 근육 생검 조직의 질량을 측정하여 기록하십시오.다음으로 10 centimeter 디쉬에 멸균 메스를 사용하여 조직을 아주 작게 다집니다. 조직 1g당 조직이 마르지 않도록 1X HBSS를 몇 방울 첨가합니다. 여기에 disc paste two 3.5 milliliters와 collagenase D 용액 3.5 milliliters를 추가합니다.그런 다음 25 mL 피펫으로 세포를 섞고 15분마다 플레이트를 인큐베이터로 옮깁니다. 90분 이내에 5 mL 피펫으로 세포를 섞어줍니다. 조직이 완전히 해리되어야 합니다.조직이 해리되면, 2배 부피의 성장 배지를 첨가하고 100 micron 스트레이너로 여과합니다. 여과액을 50 milliliter 튜브에 수집합니다. 실온에서 329 G로 10분 동안 원심 분리하여 여과액으로부터 세포 펠릿을 형성합니다.그 다음 0.5% BS, A가 포함된 HBSS에 세포를 재부유시키고 세포 수를 측정합니다. 100 µL당 1백만 개의 세포가 되도록 부피를 조정합니다. 250,000개의 세포 분주액을 무염색 대조군으로 따로 보관하고, 단일 염색 대조군을 위해 동일한 분주액 두 개를 따로 보관합니다.이 모든 과정은 FACS 분석에 필수적입니다. 이제 세포 10⁶개당 5 µL의 anti CD 56 항체로 세포를 염색하고, 모든 샘플을 얼음 위에서 30분 동안 배양하십시오. 다음으로, 10 mL의 HBSS로 샘플을 빠르게 세척하십시오.그런 다음 이전과 동일하게 세포를 원심분리하여 펠렛화하되, 4°C에서 진행합니다. 세포가 펠렛화되면 상층액을 제거하고 1X HBSS를 사용하여 세포 펠렛을 mL당 5 million cells 농도로 재부유시킵니다. 그다음 propidium iodide를 최종 농도가 1 µg/mL가 되도록 첨가합니다. 이제 정제 플레이트를 이용한 FACS를 통해 비근형성 세포로부터 근형성 CD56 양성 세포를 정제합니다.0.1% gelatin으로 코팅된 6-웰 플레이트에 웰당 50,000개의 근발생 세포를 배양하고, 세포가 부착될 때까지 기다린 후 세포주 불멸화를 위해 바이러스를 감염시킵니다. 텍스트 프로토콜에는 피부 섬유아세포를 정제하고 배양하는 방법에 대한 추가 검토 내용이 기술되어 있습니다. phoenix tropic 세포를 plasmid PolyJet 혼합물과 함께 하룻밤 동안 배양한 후 준비합니다.DME M1 4부분, 배지 1분분, 1 99 및 10% calf serum으로 구성된 신선한 배지를 세포에 공급합니다. 또한 이소트로픽 패키징을 준비합니다. 6-웰 플레이트에 웰당 약 400,000개의 PA three 17 세포가 들어가도록 PA three 17 세포를 분주합니다.12시간 후, Phoenix tropic 세포 상층액에서 바이러스가 포함된 상층액을 수집하여 0.45 micron 필터로 여과합니다. 그다음 상층액 1 mL를 사용하여 PA three 17 세포를 감염시키고 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 세포가 합류(confluency)에 도달했을 때 배지에 0.5 mg/mL 농도의 항생제를 처리하여 PA three 17 세포로부터 바이러스를 생성하는 세포주를 선별하며, 12시간 간격으로 세포 상층액을 세 차례 수집합니다.매 수확 후 컬렉션을 필터링하십시오. 여과액이 실험에 사용할 바이러스 상층액이 됩니다. 이를 1 mL씩 분주하여 보관하십시오.즉시 사용할 몇 개의 분주액을 따로 떼어 놓습니다. 추가 분주액은 -80°C에서 보관할 수 있으나, 동결-해동 주기가 반복될 때마다 효율이 50%씩 감소합니다. 전 과정 동안 바이러스 입자에 접촉한 장비는 폐기함에 버리기 전에 반드시 표백제로 세척해야 함에 유의하십시오.안정적인 PA three 17 바이러스 생산 세포주를 영구적으로 보존하려면, 세포를 10% DMSO 및 90% 혈청 혼합액에 넣어 동결한 뒤 -150 °C에서 보관하십시오. 6-well 플레이트의 각 웰에 갓 생산된 바이러스 상청액 400 µL를 첨가하십시오. 대조군으로 웰 두 개에는 바이러스를 첨가하지 않고 남겨둡니다.플레이트를 하룻밤 동안 배양하고, 다음 날 각 웰의 배지를 2.5 milliliters의 신선한 근육 배지로 교체하십시오. 바이러스 입자가 포함된 배지와 피펫은 반드시 표백제 처리 용기에 폐기하십시오. 세포를 신선한 근육 배지에서 3일 동안 배양하십시오.그런 다음, CDK4 감염의 경우 mL당 400 µg의 neomycin을, 인간 텔로머레이스 역전사효소(human telomerase reverse transcriptase) 감염의 경우 mL당 300 µg의 hygromycin을 사용하여 항생제 내성 세포를 선택합니다. 1~2주 동안 유지하며, 대조군 웰의 세포가 모두 사멸할 때까지 선택 조건 하에서 세포를 배양합니다.세포가 완전히 합류(confluent)되기 전에 항상 계대 배양하며, 선택 과정 중이라도 60~80% 합류도에 도달하면 0.05% trypsin EDTA 용액을 사용하여 세포를 수집하고 계대 배양하십시오. 항생제가 포함된 신선한 myoblast 배지를 사용하여 10 cm 디쉬로 세포를 옮깁니다. 처음에는 10 cm 디쉬당 3~500개의 매우 낮은 밀도로 세포를 접종하십시오.10~20개의 세포로 구성된 작은 콜로니가 보일 때까지 약 2주 동안 이 디쉬에서 세포를 유지합니다. 세포가 마르지 않도록 얇은 막 형태의 배지만 남기고 대부분의 배지를 제거합니다. 이제 클로닝 링의 한쪽 면에 실리콘 진공 그리스를 바르고, 원하는 클론 위에 링을 덮습니다.각 링 내에서 원하는 클론 주위에 서로 다른 링을 표시합니다. trypsin EDTA 용액을 몇 방울 첨가합니다. 세포가 둥글게 변하면, 현미경을 사용하여 각 세포 덩어리를 200 µL 피펫 팁으로 조심스럽게 흡입합니다.세포 구체를 사용 가능한 가장 작은 크기의 멀티웰 플레이트 웰로 옮깁니다. 그 다음, 합류(confluency)를 방지하기 위해 필요에 따라 각 클론을 확장 배양합니다. 설명된 프로토콜을 사용하여 근원성 세포를 섬유아세포, 지방원성 세포 및 잠재적인 면역 세포와 함께 분리한 후, FACS를 통해 정제하였습니다.그 후, cyclin dependent kinase four(CDK four)와 human telomerase reverse transcriptase(h turt)를 발현하는 바이러스를 사용하여 설명된 방식대로 세포를 불사화하였습니다. 세포가 분화 프로그램에 진입하여 근관(myotube)을 형성할 수 있으므로, 각 단계에서 디쉬의 세포 밀도를 합류(confluency) 상태 미만으로 유지하는 것이 매우 중요했습니다. 비불사화 대조군 세포와 불사화된 세포의 근관 형성 및 수축 정도를 비교한 결과, 차이는 관찰되지 않았습니다.텔로미어 길이와 텔로미어 활성도를 측정하여 세포주의 불멸화를 확인하였습니다. 세포 성장 곡선을 통해서도 불멸화가 확인되었습니다. 이 영상을 시청한 후에는 환자의 생검 조직에서 일차 근육 세포를 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.일차 근모세포를 불멸화하고 불멸화된 근원성 클론을 분리 및 선택합니다. 바이러스를 다룰 때는 전용 조직 배양 후드와 안전 환기 시스템을 사용해야 함을 유념하십시오. 또한, 원치 않는 오염을 방지하기 위해 피펫, 팁, 디쉬, 주사기 및 필터와 같이 바이러스 조작에 사용되는 모든 도구는 표백 처리해야 합니다.바이러스 입자는 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 예방 조치를 취해야 합니다.

isolation-immortalization-patient-derived-cell-lines-from-muscle

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

마이크로 해부 explants 기술은 골격 근육 줄기 세포의 원천으로 청소년, 성인이나 배아 근육에서 proliferative 골격근 세포를 분리를위한 강력하고 안정적​​인 방법입니다. 유니 클리,이 세포는 clonally 생체내 이식에 사용되는 골격 근육 줄기 세포 라인을 생산하기 위해 파생되었습니다.

성인 및 배아 골격근의 Microexplant 문화 및 골격 근육 줄기 세포의 분리

myofibers의 절연과 문화는 황금...

성인 골격근의 개인 Myofibers 및 위성 세포의 분리와 문화

인간의 근육에서 유래한 주요 부착 세포 유형은 근육 세포와 섬유아세포입니다. 여기에서 세포 집단은 CD56 항원을 기반으로 하는 자기 활성화 세포 분류를 사용하여 농축됩니다. 이후 특정 항체를 사용한 면역 라벨링과 이미지 분석 기법을 사용하여 개별 세포의 세포질 및 핵 특성을 정량화할 수 있습니다.

인간의 골격근에서 기본 근육 조직 세포와 섬유 아 세포의 분리 및 정량 면역 세포 화학 특성

이 프로토콜은 전기천공법을 사용하여 마우스 근육 섬유에 형광 표지된 단백질을 도입하고 발현합니다. 전기천공법 후 회복 후 섬유가 분리됩니다. 그런 다음 고해상도 컨포칼 현미경을 사용하여 개별 섬유를 이미지화하여 근육 구조를 시각화합니다.

DNA 일렉트로, 근섬유의 분리 및 이미징

여기, 우리는 성인 근육 조직에서 인간 myoblasts의 순수 인구를 얻기위한 방법을 설명합니다. 이 세포들은 생체 외 골격근 분화를 연구하고, 특히 Ca 2+ 신호 전달에 관여하는 단백질을 연구하는데 사용됩니다.

인간의 Myoblast의 분리, Myogenic 분화의 평가 및 저장 운영 칼슘 항목 측정

우리는 골격 근 생검 조직에서 얻은 인간 1 차적인 근육 전구 세포 (hMPCs)를 분리, 배양, 특성화 및 분화하는 기술을 제시합니다.  이러한 방법을 통해 획득되고 특징지어지는 hMPC는 인간 근생 및 골격 근 재생과 관련된 연구 질문을 이후에 해결하는 데 사용될 수 있다.

골격 근 생검 절차에서 인간 근육 선조 세포의 격리, 배양, 특성화 및 분화

근세포는 다핵근화 된 myotubes를 형성하고 결국 골격 근섬유를 형성하기 위해 분화 전구세포를 증식시. 여기에서, 우리는 젊은 성인 마우스 골격 근육에서 1 차적인 근분의 능률적인 격리 그리고 문화를 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 배양에서 근육 세포의 분자, 유전 및 대사 연구를 가능하게합니다.

마우스 골격 근 이식에서 기본 근구의 격리 및 분화

여기서, 우리는 동종구균 돌연변이 라민 Δ8-11 마우스 모델, 에머리-드레이퍼스 근 위축증(EDMD)에 대한 매우 가혹한 모델으로부터 초기 산후 발달 단계에서 단일 근육 섬유를 효율적으로 획득하는 방법을 제안한다.

초기 산후 발달에 있는 에머리 드레이푸스 근 이영양증의 Murine 모형에서 단 근섬유 격리 및 문화

이 프로토콜은 근막세포로 피부 섬유아세포의 변환과 근투로의 분화를 설명합니다. 세포주 신경 근육 장애를 가진 환자에서 파생 되 고 병리학 적 메커니즘을 조사 하 고 치료 전략을 테스트 하는 데 사용할 수 있습니다.

신경 근육 장애에 대 한 치료를 조사 하기 위해 Myoblasts에 인간 섬유 아 세포의 직접 재프로그래밍

이 프로토콜은 마우스의 개별 골격근에서 근육 줄기 세포와 섬유 지방 생성 전구체의 분리를 설명합니다. 이 프로토콜에는 단일 근육 해부, 형광 활성화 세포 분류에 의한 줄기 세포 분리, 면역형광 염색에 의한 순도 평가, 5-ethynyl-2'-deoxyuridine 혼입 분석에 의한 S상 진입의 정량적 측정이 포함됩니다.

개별 골격근에서 정지 줄기 세포 집단의 분리

이 프로토콜은 조직 해리, 순차적 여과, 사전 플레이트 및 정의된 배양 조건을 통해 성체 및 신생아 마우스 골격근에서 1차 근모세포를 분리하고 농축하는 표준화된 방법을 제공하여, 위성 세포 유래 근아세포 배양을 하위 실험 응용으로 구축하고 유지할 수 있게 합니다.

시험관 내 근형성 연구를 위한 골격근 위성 세포 분리

배우세요 인간 근육 생검에서 근원세포를 분리하고 CDK4와 hTERT로 멸화하여 무제한 세포 공급원을 확보하는 방법. 이 기술은 근육 질환 연구와 약물 스크리닝에 활용됩니다.

질병 모델링을위한 근육 조직 검사에서 환자 유래 세포주의 분리 및 멸화

더 많은 동영상 탐색