마우스 대장 수입 성의 엔딩의 생체 기능 특성에

다음 실험의 전반적인 목표는 시험관 내에서 마우스 공동 직장의 외인성 구심성 신경 종말을 기능적으로 특성화하는 것입니다. 이는 결장직장 및 부속된 골반 또는 요추 Splunk 목 신경을 연속체로 적출하고 조직을 체외 기록 챔버에 배치함으로써 달성됩니다.두 번째 단계로, 골반 또는 요추 Splunk 목 신경 몸통을 미세한 필라멘트로 분할하여 개별 신경 축삭돌기에 대한 단일 섬유 전기생리학적 기록을 만들 수 있습니다. 다음으로, 개별 결장 신경 말단은 수용장의 편향되지 않은 전기 자극에 의해 식별되고 세 가지 뚜렷한 기계적 자극에 대한 반응 프로파일에 따라 기능적으로 분류됩니다.

또한, 신경 말단에 적용되는 화학 물질에 대한 반응은 황동 튜브 조각으로 수용장을 분리하고 용액을 화학 물질 또는 화학 물질 혼합물을 포함하는 용액으로 대체하여 테스트할 수 있습니다. 결과는 생쥐 colorectal이 5가지 다른 종류의 메카노 민감성에 의해 신경이 분포되어 있음을 보여줍니다. 또한, 대장직장인의 약 25%는 기계적으로 둔감하거나 조용한 통각 수용기입니다.

이 방법은 우리와 다른 사람들이 결장직장의 감각 신경을 연구하는 데 사용합니다. 우리는 많은 위장 장애가 감각 신경 분포의 흥분성 또는 감작과 관련이 있기 때문에 이 연구 접근 방식을 사용하는 데 관심이 있습니다. 감작 메커니즘을 이해하는 데 대한 우리의 관심은 과민성 대장 증후군과 같은 위장 장애와 일반적으로 관련된 통증과 불편함을 조절하는 데 유용할 수 있는 치료 전략을 개발하는 데 도움이 되고자 하는 우리의 열망과 관련이 있습니다.

이 방법의 시각적 시연은 조직 해부와 신경 분리 단계를 마스터하기가 매우 어렵기 때문에 매우 중요합니다. 신경이 혁신하고 있습니다. 원위 결장직장은 해부 중에 쉽게 손상될 수 있습니다.

따라서 신중한 해부와 분할 단계는 이 실험을 복제하려는 사람들에게 매우 중요합니다. 쥐를 안락사시킨 직후 피를 흘리고, 흉실을 잘라내고, 오른쪽 심방에 구멍을 뚫고, 쥐 사체와 얼음처럼 차가운 크렙 용액 반 리터를 담근다. 그런 다음 결장과 골반 장기를 제외한 모든 내장을 조심스럽게 제거합니다.

그런 다음 흉부 횡격막에서 약간 위 T 12 지점에서 마우스의 몸을 가로질러 몸의 절반을 얼음처럼 차가운 거품 크레브 용액이 들어 있는 해부실로 옮깁니다. 입체경으로 방광과 생식 기관을 요도의 접합부에서 횡단하여 제거합니다. 또한 하행 대동맥이 총장골동맥으로 분기될 때까지 하행 대동맥을 제거합니다.

이제 골반 또는 요추 팽목 신경을 주변 조직에서 풀어줍니다. 장골능 바깥쪽의 신경을 따라 척추로 들어가는 입구까지 갑니다. 골반 신경은 L 6과 S 1 척추로, 요추 널빤지 신경은 T 13과 L 1로 들어갑니다.

왼쪽과 오른쪽 골반 신경의 절제입니다. 다음으로 치골 합성을 자르고 좌우 비구 관절을 자릅니다. 그런 다음 장골 뼈를 제거하십시오 장골을 제거한 후 신경이 자유로운 원위 결장 직장을 해부합니다.

주변 근육과 결합 조직에서 연결된 신경. 신경은 기계 손상에 취약합니다. 우리는 주변 조직으로부터 자유롭기 때문에 신경을 당기거나 꼬집지 않도록 특별한 주의를 기울여야 합니다.

그런 다음 신경이 부착된 결장직장을 조직실로 옮깁니다. 장간막 경계를 따라 결장직장을 세로로 열고 결장직장 점막 쪽을 위로 위치시킵니다. 그런 다음 마우스 구멍과 게이트로 욕조 구획에 연결된 기록실로 신경을 확장합니다.

작은 유리 거울에 신경관을 놓습니다. 거울은 친수성이며 신경이 거울에 달라붙을 것입니다. 이제 기록실 옆에, 대장항암의 장간막 가장자리를 핀으로 고정합니다.

이제 따뜻한 산소가 공급된 Creb 용액으로 수조 구획을 수퍼 퓨즈하고 기록 구획에 미네랄 오일을 채워 설정을 완료합니다. 고배율로 실체 현미경 아래의 힘 액추에이터에 연결된 고리 갈퀴에 colorectal의 anti 장간막 길이를 부착합니다. 고립된 골반 또는 요추 경부 신경에서 미세한 집게를 사용하여 신경초를 조심스럽게 벗겨냅니다.

신경 줄기를 각각 두께가 약 100미크론인 5-8개의 신경 다발로 묶습니다. 이제 기준 전극을 조직 챔버의 Krebs 용액과 접촉시킵니다. 그런 다음 개별 신경 다발을 기록 전극에 순차적으로 배치하여 결장직장에서 활동 전위를 불러옵니다.

부드러운 붓을 사용하여 colorectal 표면을 부드럽게 쓰다듬습니다. 따라서 결장에 신경을 분포시키는 신경 다발을 확인하십시오. 이제 한 쌍의 30게이지 바늘 끝을 사용하여 신경 다발을 10미크론 두께의 필라멘트로 더 분할하고 필라멘트 중 하나를 기록 전극에 넣습니다.

이 단계에서는 높은 수준의 눈, 손의 협응력 및 민첩성이 필요합니다. 그런 다음 구심성 신경 종말을 전기적으로 여기시키기 위해 점막 표면에 수직인 둥근 끝이 있는 동심 전극을 배치하고 최고 역치 강도로 자극합니다. 이것은 반경 2mm에 걸쳐 흐르는 전류를 생성합니다.

수용 말단을 찾으려면 평평한 co, 직장의 길이와 너비를 따라 전극을 1.5mm 단위로 체계적으로 움직입니다. 구심성 결말이 들뜨면 전극 위치와 자극 강도를 조정하여 반응하는 데 가장 적은 자극 강도가 필요한 수용 영역을 정확히 찾아냅니다. 자극 역치가 3밀리암페어보다 크면 해당 신경 종말을 버리고 다른 신경 필라멘트를 연구하기 위해 계속 진행합니다.

이제 수용장에서 자극전극과 기록 부위 사이의 거리로부터, 그리고 자극 인공물과 활동전위의 시작 사이의 전도 지연으로부터 전도 속도를 계산한다. 전기 자극으로 수용 영역을 찾은 후 세 가지 기계적 자극을 가합니다. 먼저, 나일론 모노필라멘트와 같이 보정된 폰 프레이의 끝을 평평한 결장직장의 수용 영역을 향해 수직으로 눌러 프로빙 자극을 가합니다.

0.4g과 1g의 힘을 생성하는 모노필라멘트를 사용하십시오. 둘째, 수용장에서 작은 표면 전단 응력을 생성하기 위해 10밀리그램의 힘을 생성하는 미세한 나일론 필라멘트 가닥으로 결장직장 점막을 부드럽게 쓰다듬어 쓰다듬는 자극을 생성합니다. 셋째, 컴퓨터 제어 힘 액추에이터를 사용하여 원주 스트레칭을 수행합니다.

결장직장의 anti mesenteric edge를 따라 원주 방향으로 ramp 스트레칭 힘을 전달하도록 합니다. 이제 ENS를 serosal mucosal muscular muscular mucosal 또는 MIAA mechanically insensitive centerent로 분류합니다. 세 가지 테스트의 결과를 기반으로 합니다.

먼저 화학적 민감도를 테스트하기 위해 램프, 원주 방향, 스트레칭 또는 수직 기계적 프로빙을 통해 이전 섹션에서와 같이 기계적 자극에 대한 기준선 반응을 기록합니다. 먼저 황동 또는 스테인리스 스틸 튜브 조각의 하단 가장자리에 석유를 코팅하고 colorectal의 수용 필드 위에 놓습니다. 이제 튜빙 내부에서 Krebs 용액을 흡입하고 용액을 170마이크로리터의 테스트 용액으로 교체합니다.

구심성의 반응을 모니터링하면서 튜브를 3-5분 동안 제자리에 두십시오. 4분에서 6분 이내에 튜브를 제거한 직후, 기준선 반응과 동일한 기계적 자극에 대한 구심성 반응을 테스트합니다. 15분 이상 경과하면 시약이 씻겨 나간 것으로 간주될 수 있습니다.

그런 다음 기계적 자극이 다시 적용됩니다. 기준선 개미와 비교하기 위해, 수용 영역을 찾기 위해 절개된 신경을 자극했습니다. 수용장은 활동 전위의 전도 지연을 사용하여 활동 전위 반응에 의해 식별되었습니다.

계산된 전도 속도는 초당 43미터였으며, 이는 수초화되지 않은 C 섬유 범위에 있습니다. 수용 영역을 확인한 후, 모노필라멘트와 같은 휴대용 폰 프레이에 의해 수직으로 조사되었고, 또한 휴대용 미세 나일론 필라멘트로 부드럽게 쓰다듬어졌습니다. 프로빙에 대한 AFR 응답은 또한 대장직장의 동일한 부위에 정확하게 타이밍이 맞춰지고 재현 가능한 일련의 기계적 힘을 전달하는 컴퓨터 제어 힘 액추에이터에 의해 평가되었습니다.

유사하게, colorectal의 원주 스트레칭은 동일한 액추에이터 노력에 의해 전달되었습니다. 반응은 프로빙(probing), 쓰다듬기(stroking), 스트래킹(stroking), 스트레칭(stretch) 민감 구심성의 스트레치 반응에 대한 반응에 따라 구별할 수 있으며, 5분씩 간격을 둔 3개의 연속적인 원주 스트레칭에 의해 유발되었습니다. 스파이크 숫자는 균일하게 고정되어 자극 반응 함수로 표시되어 높은 재현성과 반응 크기 및 반응 임계값을 모두 드러냈습니다.

다음으로 화학 물질을 적용했습니다. ens의 직접적인 활성화는 기계적으로 둔감한 구심성에 선동적인 수프의 적용 후에 산성 hypertonic 해결책의 적용 후에 일어났다. 엔딩의 활성화는 일어나지 않았지만, 메노 감수성의 획득은 분명했다.

스트레치에 민감하고 메노에 민감한 구심성은 염증성 수프를 바른 후 수용 영역의 기계적 스트레칭에도 민감했습니다.일단 숙달되면 조직 해부를 완료하고 단일 섬유 기록을 달성하는 데 일반적으로 3-4시간이 걸립니다. 일반적인 실험은 처음부터 끝까지 하루 종일 걸립니다. 이 비디오를 본 후에는 신경이 연결된 결장직장을 외과적으로 제거하고 채취하는 방법을 이해해야 합니다.

그런 다음 골반 신경 또는 요추 널빤지 신경의 단일 Ahern 섬유에서 기록하여 편향되지 않은 전기 검색 전략을 사용하여 결장을 신경 분포시킬 수 있습니다. 그런 다음 co-ectum에서 수용 말단을 식별하고 수용 말단에 직접 화학 물질을 적용하여 화학 물질 민감성뿐만 아니라 화학 민감성을 테스트할 수 있어야 합니다. 이 제제는 결장직장의 기본적인 생리학적 질문뿐만 아니라 병태생리학적 메커니즘을 연구할 수 있는 강력한 제제입니다.