Name: 마우스 대장 수입 성의 엔딩의 생체 기능 특성에 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 9 s
Description: 학습하세요 마우스 대장 직장의 외부 수입성 신경 말단을 생체 외에서 기능적으로 특성화하는 방법을. 단일 섬유 전기생리학 기록을 통해 기계 및 화학 자극에 대한 반응을 분석하고, 다양한 기계수용성 말단 유형을 식별하여 통각 메커니즘 연구에 활용합니다.

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NIH award R01 DK093525(GFG)에서 지원합니다. 우리는 앰버 셰퍼(Amber Shaffer) 박사(피츠버그 대학)의 원고에 대한 과학적 검토와 문법 편집에 크게 감사드리며, 그림 준비에 도움을 준 마이클 버첨(Michael Burcham)에게 감사한다.

참고 :이 프로토콜을 검토하고 피츠버그 기관 동물 관리 및 사용위원회의 대학에 의해 승인되었다. 수정 크렙스 솔루션 및 시험 약물 분취 1. 준비 <ol><li> 117.9의 NaCl, 4.7 KCl을 25의 NaHCO3, 1.3의 NaH 2 PO 4, 황산 1.2, 2.5 CaCl2를 11.1 D 글루코오스, 2 소듐 뷰티 레이트, (20), 아세트산 나트륨 (mm 단위)가 포함 개질 크렙스 용액 6 L 만들기 0.004 니페디핀 (자발적인 근육의 수축을 차단하기 위해), 0.003 인도 메타 신 (indomethacin)은 (내인성 프로스타글란딘의 합성을 차단하기 위해). 각각 조직의 절개 및 단일 섬유 녹음, 얼음처럼 차가운 따뜻한 크렙스 솔루션을 사용합니다. </li><li> 모든 화학 용액을 준비 (예를 들어, IS, 캅사이신, ATP) 원하는 농도로 분액. </li></ol> 대장 직장 - 신경 조직의 2 해부 <ol><li> 마취 및 수컷 마우스 안락사 (6-8주 이전, 20~30g)에서를10 변위 유량 CO 2 실 - 생쥐까지 분당 챔버 체적의 30 %는 가슴 움직임의 부재로 나타내는 바와 같이 호흡 완전히 멈춘다. </li><li> 즉시, 흉부 챔버를 개방 절단 우심방을 천공하고, 얼음처럼 차가운 크렙스의 충분한 볼륨 (~ 500 ml)에 마우스 시체를 침지 안락사,에게서 피를 뽑다 다음 (4 ° C) 솔루션은 carbogen (95 % O 2 버블 5 % CO 2). </li><li> 조심스럽게 모든 내장 그러나 콜론과 골반 장기를 제거합니다. 약간 횡격막 위 T12 척추 분절에 걸쳐 반 마우스 횡단면과 빙냉 함유 해부 챔버에 꼬리 절반을 전송하고, 크렙스 용액을 버블. </li><li> 실체 현미경 아래에서 요도에 자신의 접합에에 병행하여 방광 및 생식 기관을 제거하고 총장 골 동맥으로 분기합니다 때까지 하강 / 복부 대동맥을 제거합니다. PN 또는 surroundin에서 LSN 무료g의 무딘 절개하여 조직과 L6 및 S1 척추 (PN)에 열 또는 T13과 (LSN)에 L1 척추에 자사의 복부 진입 점까지 장골 외부에서 신경을 따릅니다. </li><li> 치골 치골 좌우 비구 관절을 잘라 및 장골 뼈를 제거합니다. 신경이 척추를 입력 어디까지 대장 직장 가까이에서 첨부 된 근육과 결합 조직에서 하나 PN 또는 LSN 조심스럽게 무료. </li><li> 조심스럽게 원위부 대장 직장을 노출 장골 뼈를 절제. 연속체에 부착 된 PN 또는 LSN과 원위부 대장 직장을 해부하다. </li><li> 티슈 챔버의 욕조에 부착 함과 함께 신경 대장 직장 전송. 더 해부 과도한 결합 조직을 제거하고 방지 장간막 국경을 따라 길이 방향으로 대장 직장을 엽니 다. </li><li> 이 위를 향하도록 점막면, chambe의 실리콘베이스에 기록 구획에 인접한 대장 직장의 장간막 가장자리를 고정R 및 힘은 액추에이터에만 연결 후크 긁어 대장 직장의 길이 antimesenteric 부착 (도 1에 도시되고도 2a에 촬영). </li><li> 마우스 홀 및 게이트에 의해 목욕 구획에 연결되는 기록 구획에 PN이나 LSN 연장. 부드럽게에 신경을 준수 할 수있는 친수성 ​​표면을 제공 녹화 실에서 작은 유리 거울에 신경 트렁크를하다. 따뜻한와 목욕 구획 Superfuse (30-32 ° C가), 크렙스 솔루션을 산소와 미네랄 오일과 기록 구획을 입력합니다. </li></ol> 3. 단일 섬유 녹음하고 받아들이는 필드의 현지화 <ol><li> 조심스럽게 높은 배율 (- 60X 50)에 입체 현미경 PN 또는 LSN에서 epineurium (신경초)를 벗겨. ~ 100 ㎛ 두께의 8 신경 다발 - 미세 집게를 사용하여, 5에 신경 트렁크를 애타게. </li><li> 백금 - 이리듐 참조를 배치티슈 챔버 크렙스 용액과 접촉하는 전극. 순차적으로 동일한 재료로 이루어진 기록 전극 상 개별 신경 다발을 배치. </li><li> 부드럽게 쓰다듬어에 의해 대장 표면 아래로 대장 구 심성에서 AP를 보여주고 부드러운 페인트 브러시를 사용합니다. 검출 AP (활동 전위) 녹음을 통해 콜론에 분포 신경 다발 (들)를 찾습니다. 참고 : PN과 LSN은 또한 방광과 골반 장기에 분포. </li><li> 추가로 10 μm의 두께 ~ 미세 필라멘트 다발로 신경 다발을 분할하고, 기록 전극 상 개별 필라멘트를 배치 30 G 바늘 팁의 쌍을 사용한다. </li><li> 전기적 현재 확산의 ~ 2mm 반경을 생산 초과 임계 자극 강도 (10mA 크기, 0.3 Hz에서 @ 0.5 밀리 초 시간)에서 구 심성 엔딩을 자극하는 점막 표면에 수직 라운드 팁 동심 전극을 배치합니다. 체계적 (~ 1.5 mm 단계를 전극 이동) 평평 대장 직장의 길이와 폭을 따라 수용 엔딩 현지화. </li><li> 구 심성 결말이 흥분 할 때, 최소한의 자극 강도 (자극 임계 값)이 필요 활성화 (수용 필드, RF)의 위치를​​ 정확히 파악할 수있는 전극의 위치를​​ 조정합니다. &gt; 3mA (19) 자극 임계 값 엔딩을 폐기하십시오. </li><li> 자극 인공물과 활동 전위의 발병 사이의 전도 속도 1 ~ (CV)) 수용 필드 (RF)에서, 자극 전극 및 상기 기록 위치, 2) 전도 지연 (예를 들어,도 2B의 간격)를 계산 . CV (m / 초) = 거리 (mm) / 전도 지연 (밀리 초). </li></ol> Mechanosensitive 대장 구 심성의 4 기능 분류 <ol><li> 전기 자극에 의​​한 RF를 찾은 후, RF에 다음과 같은 세 가지 기계적인 자극을 적용 <ol><li> CALIBRA의 끝을 눌러 프로빙 자극을 실시테드 프레이 같은 나일론 모노 필라멘트 (0.4 1g의 힘) 수직으로 평탄화 된 대장 직장에서 RF쪽으로. </li><li> 부드럽게 RF에 작은 표면 전단 응력을 생성하는 좋은 나일론 필라멘트 가닥 (10 mg의 힘)으로 대장 점막을 쓰다듬어하여 쓰다듬어 자극을 실시한다. </li><li> 경 스트레칭 력을 얻어 컴퓨터 제어 동력 액츄에이터를 이용하여 원주 연신을 실시 - 단계 2.8에 기재된 후크 퀴 통하여 대장 직장의 항 장간막 가장자리를 따라 원주 방향 (0~5 mN의 / 초에서 170 MN) . </li></ol></li><li> 장막으로, 점막을 (프로빙 둔 만 응답) 구 심성을 분류 근육 (원주 스트레칭에 대응하고 프로빙 둔) 근육 / 점막을 (원주 스트레칭, 점막 쓰다듬어에 대응하고 프로빙 둔), 또는 (쓰다듬어 점막 및 프로빙 둔 응답) MIA (세 기계적 자극의에 반응하지 않음). </li><li> 만에 (장간막 구 심성의 경우어려운 LS​​N의 신경 분포)은 전기 자극에 의​​해 선택적으로 활성화 장간막의 프로빙 / 기계 쓰다듬어하여 수용 엔딩을 찾습니다. </li><li> 스트레칭에 민감한 구 심성 (근육과 근육 점막)의 경우, 경 스트레칭 중 첫 번째 AP를 불러 일으키는 힘으로 정의 된 응답 임계 값을 결정합니다. </li><li> 장막 심성 들면, 컴퓨터 제어 동력 구동되는 액추에이터에 의해 수용 필드의 프로빙 점상의 수준을 상승 그들의 응답을 기록. </li></ol> 받아들이는 엔딩 5. 화학 응용 프로그램 / 변조 <ol><li> 기계적인 자극에 대한 기본 응답을 기록 (즉, 경 스트레칭, 프로빙 반점, 또는 점막 쓰다듬어에 응답). </li><li> 코트 바닥 튜브 (10mm 높고 4 × 4mm 2 정사각형 또는 4 황동 또는 스테인레스 스틸, - 5 mm 직경)의 조각의 가장자리에 바셀린과 대장 직장의 수용 필드 위에 놓습니다. </li><li> 제거화학 물질 (들)을 검사 할 함유하는 용액을 5 분에 170 μL - 크렙스 내부 튜브 용액 및 3에 대해 수용 결말을 노출. </li><li> 화학 응용 프로그램 중 심성의 반응을 모니터 (일부 구 심성은 chemosensitive 있습니다). </li><li> 화학 물질의 작용을 정지하고, 약액 튜브를 제거한다. 내 4 - 6 분, 기준선 응답과 동일한 기계적 자극에 대한 구 심성 응답을 테스트한다. </li><li> 워시 아웃의 충분한 기간 (&gt; 15 분) 후 다시 기계적인 자극을 다시 적용합니다. </li></ol> 6. 녹음 및 차별 AP 스파이크 <ol><li> 20 kHz에서 축삭에서 기록 된 전기 신호를 디지털화하여 컴퓨터에 데이터를 저장한다. 오디오 모니터에 의해 온라인 신호를 모니터링합니다. </li><li> 오프라인 AP 스파이크를 분석하고 개별 스파이크 파형 (25)의 주성분 분석을 기반으로 하나의 단위를 구별. 참고 : 하나의 기록이 일 더 이상 포함되어야합니다두 쉽게 식별 가능한 활성 단위. </li></ol>

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여기에 설명 된 체외 대장 직장 - 신경 준비는 잘 내장 감각 신경에 다른 비 기능적 접근 방법 (예를 들면, 세포 분자, 조직 학적 연구)를 보완 개별 대장 구 심성 신경의 신경 인코딩 기능 (연구 할 수있는 강력한 방법이 될 입증되었습니다 ) 자세한 내용은 리뷰 27을 참조하십시오. 통각 및 장기 대장의 과민 반응에 기여하는 신경 메커니즘은 밝혀지지하고 약리 조작은 내장 통증을 완화 할 수 공개 대상을 가지고 수행되었다. 이러한 준비의 성공적인 구현과 관련된 다음과 같은 주요 포인트는 아래에 설명되어 있습니다 : 전기 노이즈의 1) 감소, 신호 검출 2) 증가하고, 구 심성 인코딩의 변화를 평가하는 표준화 된 자극의 3)를 선택합니다. 또한,이 기술의 몇 가지 제한 사항이 논의된다. 활동 전위 (APS) propagati(130) MV - NG는 세포 내 신경을 따라 축삭은 일반적으로 100의 횡단 잠재력을 가지고있다. ...

통증 과민 명백 병인 학적 원인이나 조직 손상의 유무에 존재 과민성 대장 증후군 (IBS)을 포함하여 위장 기능 장애로부터 고통받는 환자의 주된 불만이다. 예를 들어, IBS 환자 (복부의 촉진에 즉, 부드러움) 정상적인 장 기능 동안 직장 풍선 팽창 증가 감도 높게 응답을 포함하는 과민 반응,뿐만 아니라 체세포 추천의 과민 반응을 나타내는 일. 의 개선 이해, 대장 구 심성을 대상으로하는 IBS 환자에서 (구 아닐 레이트 사이 클라-C의 효능 linaclotide 4-6 경구 섭취 예를 들어, 국소 마취제 2,3의 내 직장 점안을) 통증과 과민을 완화에 효과적 일 수 있기 때문에 대장 직장의 구 심성 신경 분포가 중요합니다. 대장의 구 심성을 포함하여 내장 구 심성,/ nutrient- 화학적 및 열적 양상 (예를 들면, 7-9)에 응답 할 수있다. 그러나, 기계적 자극 (즉, mechanosensitive 구 심성)에 응답 내장 구 심성이되었습니다 기계적 자극 (예를 들어, 내강 팽만, 스트레칭) 일반적으로 불편과 고통 10-16을 포함하여 의식이 감각에 야기 할 것들이기 때문에 가장 철저하게 연구했다. 또한, 내장은 일반적으로, 기계적으로 문자를 구분 구 심성 (실종자)에 의해 신경 지배를 자동 또는 자고 통각 수용기 (17)이라고합니다. 정상적인 생리 조건에서, 실종자는 기계적인 자극에 응답하거나 매우 높은 응답이 18 임계 값이 있지만 활성화 및 병태 생리 학적 조건에서 mechanosensitivity를 획득 과민 반응에 공헌 할 수 없습니다. 여기에 설명 된 시험 관내 제조 방법 및 프로토콜을 이용하여, 우리는 개발 바다 전기 자극 전략을 채용<html> 대장 직장 (19) 모두 mechanosensitive 및 MIA 엔딩의 편견 식별을 가능하게 수용 엔딩에 대한 RCH. 대장 신경 분포는 요추 내장의 (LSN)과 골반 신경 (PN) 경로에서 파생 다섯 mechanosensitive 클래스 (장막, 점막, 근육, 근육 점막, 장간막) 한 MIA 클래스 (20)으로 분류 할 수있다 대장 구 심성을 포함한다. 이 체외 준비를 사용하여, 우리는 대장 실종자 인수 mechanosensitivity는 LSN 경로에 PN 경로에서 실종자의 71 %와 실종자의 23 %를 증감 염증 수프 (IS), 그들의 수용 필드의 짧은 노출 다음 (민감) 발견 19. 우리는 또한 오래 지속되는 행동 내장 과민 반응의 맥락에서 실종자의 장기 감작 (최대 28 일) 문서화 (모산 (21) 또는 2,4,6- 트리니트로 산으로 결장 내 치료를받은 쥐에서, 즉 (TNBS) 22) . mechanosensitive 구 심성 신경, 근육과 근육 점막 구 심성 중 jove_content은 &quot;&gt; (즉, 스트레칭 구분) 및 유해 대장 팽만 (23, 24)의 인코딩을 보조하다 카나비노이드 대장 직장의 원주 스트레치를 인코딩 할 수있는 유일한 클래스입니다. 컴퓨터 제어를 사용하여 동력 액츄에이터, 우리는 평면화 대장 암 조직의 원주 방향의 표준, 균질하고 재현성 램핑 신축성을인가하고 상기 스트레치 성 구 심성을 낮은 임계치와 높은 임계치 (23)를 분류. 또, 신축성 감작를 시간 경과에 따라 결장 내 모산 21 TNBS (22) 치료 후 과민 구 심성은 내장 통증 및 과민 반응의 스트레칭에 민감한 대장 구 심성의 역할을 제안, 행동 내장 과민 반응의 시작, 지속, 및 / 또는 복구에 해당합니다.

<table><tbody><tr><td>Leica MZ16 실체 현미경</td><td>Leica Microsystems Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>라이카 IC D 카메라</td><td>라이카 마이크로시스템즈</td><td></td><td></td></tr><tr><td>증폭기</td><td>World Precision instruments, Inc.</td><td>SYS-DAM80</td><td>저잡음 차동 증폭기</td></tr><tr><td>2 칸 조직 챔버</td><td>맞춤형</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Power1401</td><td>Cambridge Electronic Design Limited</td><td>Power1401</td><td>데이터 수집, 아날로그 신호 입력 / 출력</td></tr><tr><td>Spike2 v5.02</td><td>Power1401</td><td></td><td></td></tr><tr><td>오디오 모니터</td><td>Natus Am</td><td> </td><td></td>8</tr><tr><td>사각 펄스 자극기</td><td>Natus</td><td>S48</td><td>전기 자극을 전달하기 위해</td></tr><tr><td>광전 절연 장치</td><td>Natus</td><td>PSIU6</td><td>자극 절연 소음을 줄이기 위해</td></tr><tr><td>동심 양극 미세 전극</td><td>FHC Inc.</td><td>CBFFG75</td><td>전기 자극을 전달하기 위해</td></tr><tr><td>듀얼 모드 레버 시스템</td><td>Aurora Scientific Inc.</td><td>시리즈 300C</td><td>기계적 자극을 전달하기 위해</td></tr><tr><td>집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td>집게 (팁 포함)</td></tr></tbody></table>

마우스 대장 수입 성의 엔딩의 생체 기능 특성에

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

이 비디오 상세히 마우스 대장 직장 - 신경 제제를 사용하여 시험 관내 전기 생리 단일 섬유 기록 프로토콜을 설명한다. 접근 방식은 편견 식별 및 개별 대장 구 심성의 기능을 특성화 할 수 있습니다. 하나 또는 몇 심성에서 발생하는 전파 활동 전위 (APS)의 세포 외 녹음 (즉, 단일 섬유) 대장 직장에서 수용 필드 (RI의)을 조롱 신경 섬유 다발로 만들어진다. 대장 직장은 골반 (PN) 또는 요추 내장의 (LSN) 신경 부착 길이 방향으로 열 중 하나를 제거한다. 조직 플랫 피닝 및 산소화 크렙스 용액으로 관류, 기록 챔버에 배치된다. 초점 전기 자극은 기능적으로 다섯 mechanosensi에 구 심성을 분류 (프로빙 점막 쓰다듬어 원주 스트레칭을 무디게) 더 세 가지 기계적인 자극에 의​​해 테스트 대장 구 심성 엔딩을 찾는 데 사용됩니다적인 클래스를 제공합니다. 이러한 기계적 자극 없음에 응답 엔딩 기계적으로 문자를 구분 구 심성 (실종자)으로 분류됩니다. 화학 물질에 대한 RI의 지역화 된 노출에 의해 mechanosensitive 및 실종자가 과민 반응 (즉, 향상된 응답 감소 임계 값 및 / 또는 mechanosensitivity의 취득)에 대한 평가 될 수는 모두 (예를 들어, 염증 수프 (IS), 캡사이신, 아데노신 삼인산 (ATP)). 우리는 장비와 대장 직장 - 신경 기록 준비, 부착 PN 또는 LSN, 신경 다발에서 대장 직장, 단일 섬유 녹음에 RI의 식별과 대장 직장의 수확 및 RF에 화학 물질의 지역화 된 응용 프로그램을 설명합니다. 또한, 표준화 된 제조 기계적 자극의 적용 과제도 논의된다.

설치는 그림 1에 예시되어있다. 그것은 실리콘 늘어선 목욕 구획 및 연속 미네랄 오일 충전 실에 첨부 된 신경의 대장 직장을 수용하는 맞춤형 조직 챔버를 포함한다. 두 챔버는 구획 CNC 기계에 의해 아크릴 수지의 고체 블록으로부터 기계 가공 하였다 두 구획의 바닥이어서 결장 조직 다운 핀을 쉽게 허용하도록 기업 실리콘 늘어서 하였다. 조롱 신경 다발에서 세포 외 AP는 공통 모드 제거비 (CMRR ~ 60dB)와 저잡음, 배터리로 구동되는 차동 증폭기를 사용하여 기록됩니다. 증폭기의 이득은 0.3~10 kHz에서 10,000 배와 대역 필터의 범위로 설정된다. 대장 직장의 전기 자극은 대장 점막과 접촉 동심 전극을 통해 정전류 모드에서 광학적으로 결합 된 자극에 의​​해 제공됩니다. 기계 자극 (대장 스트레칭 및 프로빙 반점)는 교류에 의해 제공됩니다힘 액추에이터를 같습 제어. AD 변환기와 소프트웨어는 적절한 기계적, 전기적 자극뿐만 아니라, 기록을 개시하기 위해 전압 지령 출력을 전송하고 차...

이 비디오는 시험관 내 마우스 결장직장 신경 제제에서 단일 섬유 전기생리학적 기록을 수행하기 위한 프로토콜을 보여줍니다.

This video demonstrates in detail an in vitro single-fiber electrophysiological recording protocol using a mouse colorectum-nerve preparation. The ...

다음 실험의 전체적인 목표는 생체 외(in vitro) 마우스 결장 및 직장에서 외인성 구심성 신경 말단을 기능적으로 특성화하는 것입니다. 이를 위해 결장-직장과 이에 연결된 골반 또는 요추 부위의 신경절 신경을 연속된 상태로 채취하여 생체 외 기록 챔버에 배치합니다. 두 번째 단계로, 개별 신경 축삭의 단일 섬유 전기생리학적 기록이 가능하도록 골반 또는 요추 부위의 신경절 신경 줄기를 미세한 섬유 가닥으로 분리합니다. 다음으로 수용장(receptive fields)에 대한 무작위 전기 자극을 통해 개별 결장-직장 신경 말단을 식별하고, 세 가지 서로 다른 기계적 자극에 대한 반응 프로파일을 기반으로 기능적으로 분류합니다.또한, 황동 튜브 조각으로 수용 영역을 분리하고 용액을 해당 화학 물질 또는 화학 물질 혼합물이 포함된 용액으로 교체함으로써 신경 말단에 작용하는 화학 물질에 대한 반응을 테스트할 수 있습니다. 결과에 따르면 생쥐의 결장직장은 다섯 가지 서로 다른 클래스의 기계 민감성 신경절에 의해 지배됩니다. 또한, 결장직장 신경절의 약 25%는 기계적 자극에 민감하지 않거나 무음성 통각 수용기입니다.본 방법은 본 연구진과 다른 연구자들이 결장직장의 감각 신경 분포를 연구하는 데 사용하고 있습니다. 많은 위장관 질환이 감각 신경 분포의 민감화 또는 흥분성 변화와 관련이 있기 때문에, 우리는 이러한 연구 접근법을 활용하고자 합니다. 민감화 기전을 이해하려는 우리의 관심은 과민성 대장 증후군과 같은 위장관 질환에서 일반적으로 동반되는 통증과 불편감을 조절하는 데 유용한 치료 전략 개발에 기여하고자 하는 바람과 관련이 있습니다.조직 박리 및 신경 분리 단계는 숙달하기 매우 어렵기 때문에 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 원위부 결장직장으로 연결되는 신경은 박리 과정 중 쉽게 손상될 수 있습니다.따라서 이 실험을 재현하고자 하는 경우, 세심한 해부와 분리 단계가 매우 중요합니다. 마우스를 안락사시킨 직후 방혈하고, 흉강을 절개하여 우심방에 천공을 낸 다음, 마우스 사체를 약 0.5 L의 얼음처럼 차가운 Creb solution에 담급니다. 그다음, 결장과 골반 기관을 제외한 모든 내장 기관을 조심스럽게 제거합니다.그 후, 흉격막보다 약간 위쪽인 T 12 부근에서 마우스의 신체를 횡단 절개하고, 몸통의 하단부를 얼음처럼 차가운 bubble crebs solution이 담긴 해부 챔버로 옮깁니다. 실체 현미경 하에서, 방광과 생식 기관을 요도와의 접합부에서 절단하여 제거합니다. 또한, 총장골동맥으로 분지되는 지점까지 하행 대동맥을 제거합니다.이제 주변 조직으로부터 골반 또는 요대동맥 신경을 분리합니다. 장골능 외부에서 척주로 진입하는 지점까지 신경을 따라갑니다. 골반 신경은 L6 및 S1 척주로 진입하며, 요대동맥 신경은 시연된 바와 같이 T13 및 L1으로 진입합니다.좌우 골반 신경의 박리 과정입니다. 다음으로, 치골 결합을 절단하고 좌우 비구 관절을 절단합니다. 그 후 장골을 제거합니다. 장골을 제거한 후, 부착된 신경이 자유로운 상태가 되도록 원위부 결장직장을 박리합니다.주변 근육 및 결합 조직으로부터 신경을 분리합니다. 신경은 기계적 손상에 취약합니다. 주변 조직을 제거하는 과정에서 신경을 잡아당기거나 집지 않도록 각별히 주의해야 합니다.그 다음, 신경이 부착된 대장결장 부위를 조직 챔버로 옮깁니다. 대장결장을 장간막 반대쪽 경계를 따라 세로로 절개하고, 대장결장의 점막면이 위로 오도록 배치합니다. 그런 다음, 마우스 홀과 게이트로 욕조 챔버와 연결된 기록 구획으로 신경을 연장합니다.신경 줄기를 작은 유리 거울 위에 놓습니다. 거울은 친수성으로, 신경이 거울에 부착됩니다. 이제 기록실 옆에 결장직장의 장간막 가장자리를 핀으로 고정합니다.이제 배스 구획(bath compartment)에 따뜻하게 산소화된 Creb 용액을 과량 공급하고, 기록 구획(recording compartment)을 미네랄 오일로 채워 설정을 완료합니다. 실체 현미경의 고배율 상태에서 결장 직장의 장간막 반대측 길이를 힘 액추에이터(force actuator)에 연결된 후크 랙에 부착합니다. 미세 핀셋을 사용하여 분리된 골반 또는 요추 내장 신경에서 신경초를 조심스럽게 벗겨냅니다.신경간을 각각 두께가 약 100 microns인 5~8개의 신경다발로 가닥가닥 나눕니다. 이제 기준 전극을 조직 챔버 내의 Krebs 용액에 접촉시킵니다. 그런 다음 개별 신경다발을 기록 전극 위에 순차적으로 배치하여 결장직장 신경계(colorectal ens)로부터 활동 전위를 유도합니다.부드러운 붓을 사용하여 결장직장 표면을 가볍게 쓸어줍니다. 이를 통해 결장에 분포하는 신경다발을 확인합니다. 이제 30 gauge 바늘 팁 한 쌍을 사용하여 신경다발을 10 micron 두께의 필라멘트로 더 세분화하고, 필라멘트 하나를 기록 전극 위에 올립니다.이 단계에서는 높은 수준의 손과 눈의 협응력 및 정교한 조작 능력이 요구됩니다. 그런 다음 구심성 신경 말단을 전기적으로 자극하기 위해 둥근 팁의 동심 전극을 점막 표면에 수직으로 배치하고 역치 이상의 강도로 자극하십시오. 이를 통해 2 mm 반경으로 전류가 확산됩니다.수용 말단을 찾으려면, 편평하게 펼친 co rectum의 길이와 너적 방향을 따라 전극을 1.5 millimeter 간격으로 체계적으로 이동시키십시오. 구심성 말단이 자극되면, 전극의 위치와 자극 강도를 조절하여 반응에 필요한 자극 강도가 가장 낮은 수용 영역을 정확히 찾아내십시오. 만약 자극 임계값이 3 milliamps보다 크다면, 해당 신경 말단은 제외하고 다른 신경 필라멘트를 연구하기 위해 이동하십시오.이제 수용장(receptive field)의 자극 전극과 기록 지점 사이의 거리, 그리고 자극 아티팩트(stimulus artifact)와 활동 전위 시작 지점 사이의 전도 지연 시간을 이용하여 전도 속도를 계산하십시오. 전기 자극을 통해 수용장의 위치를 찾은 후, 세 가지 기계적 자극을 가합니다. 먼저, 나일론 모노필라멘트와 같이 교정된 von fray의 팁을 평평하게 편 결장직장(colorectal)의 수용장을 향해 수직으로 눌러 탐색 자극을 가하십시오.0.4 g 및 1 g의 힘을 가하는 모노필라멘트를 사용하십시오. 둘째, 수용야에 작은 표면 전단 응력을 발생시키기 위해 10 mg의 힘을 가하는 미세 나일론 필라멘트 가닥으로 대장 점막을 부드럽게 쓸어 자극을 줍니다. 셋째, 컴퓨터 제어 힘 액추에이터를 사용하여 원주 방향 신장(circumferential stretch)을 수행합니다.대장 결장(colorectal)의 반장간막연(anti mesenteric edge)을 따라 원주 방향으로 램프 신장력(ramp stretched force)을 가하게 합니다. 이제 세 가지 테스트 결과에 근거하여, 장신경계(ENS)를 장막성(serosal), 점막성(mucosal), 근육성(muscular), 또는 MIAA(mechanically insensitive afferent, 기계적 무감각 구심성 신경)로 분류하십시오.이전 섹션에서와 같이 램프형 원주 방향, 신전 또는 수직 기계적 탐침을 사용하여 기계적 자극에 대한 기저 반응을 기록함으로써 화학적 민감도를 테스트합니다. 먼저 황동 또는 스테인리스강 튜브 조각의 하단 가장자리에 바셀린을 바르고 이를 결장직장 수용야 위에 배치합니다. 이제 튜브 내부의 Krebs 용액을 흡인하고 170 µL의 테스트 용액으로 교체합니다.구심성 신경의 반응을 모니터링하면서 튜브를 3~5분 동안 제자리에 둡니다. 4~6분 이내에 튜브를 제거한 직후, 기저 반응 때와 동일한 기계적 자극에 대한 구심성 반응을 테스트합니다. 15분 이상이 지나면 시약이 세척된 것으로 간주할 수 있습니다.그 후 기계적 자극을 다시 가합니다. 기준이 되는 개미들과 비교하기 위해, 해부된 신경을 자극하여 수용장을 찾았습니다. 수용장은 활동 전위의 전도 지연을 이용하여 활동 전위 반응을 통해 확인하였습니다.계산된 전도 속도는 0.43 m/s였으며, 이는 무수 C 섬유의 범위 내에 충분히 들어오는 수치입니다. 수용장을 확인한 후, 수동 von fray 유사 모노필라멘트를 사용하여 수직으로 자극을 주었으며, 수동 미세 나일론 필라멘트로 부드럽게 쓸어내리는 자극을 주었습니다. 프로빙에 대한 AFR 반응은 결장직장 부위의 동일한 지점에 정밀하게 타이밍이 조절되고 재현 가능한 일련의 기계적 힘을 가하는 컴퓨터 제어 포스 액추에이터를 통해 또한 평가되었습니다.마찬가지로, 동일한 액추에이터 작동을 통해 결장직장의 원주 방향 신장(circumferential stretch)을 유도하였습니다. 반응은 프로빙(probing)과 스트로킹(stroking)에 대한 반응을 기반으로 구분할 수 있으며, 신장 민감성 구심성 신경(stretch sensitive afferent)으로부터의 신장 반응은 5분 간격으로 세 차례 연속적인 원주 방향 신장을 통해 유도되었습니다. 스파이크 수는 균등하게 고정되어 자극 반응 함수로 표시되었으며, 이를 통해 높은 재현성과 반응 크기 및 반응 역치가 확인되었습니다.다음 약물들을 처리하였습니다. 기계적으로 무감각한 구심성 신경에 염증성 칵테일(inflammatory soup)을 처리한 후, 산성 고장성 용액을 처리하여 ens를 직접 활성화했습니다. 신경 말단의 활성화는 일어나지 않았으나, meno 민감성의 획득이 뚜렷하게 나타났습니다.염증성 칵테일(inflammatory soup)을 처리한 후, 신전 민감성 및 기계 민감성 구심성 신경이 수용장의 기계적 신전에 대해 민감해진 것이 확인되었습니다. 숙련된 경우, 조직 박리를 완료하고 단일 섬유 기록을 수행하는 데 보통 3~4시간이 소요됩니다. 전형적인 실험은 시작부터 끝까지 하루 전체가 소요됩니다. 이 영상을 시청한 후에는 신경이 부착된 대결장 항문 부위를 외과적으로 제거하고 채취하는 방법을 이해하게 될 것입니다.그런 다음, 편향되지 않은 전기적 탐색 전략을 사용하여 결장으로 분포하는 골반 신경 또는 요삭 신경 내의 단일 Ahern 섬유로부터 기록을 수행할 수 있습니다. 이를 통해 직장의 수용성 말단을 식별하고, 수용성 말단에 화학 물질을 직접 도포하여 기계적 민감도 및 화학적 민감도를 테스트할 수 있습니다. 이 실험 준비 과정은 대장직장의 기초적인 생리학적 질문뿐만 아니라 병태생리학적 기전을 연구할 수 있게 해주는 강력한 방법입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 비디오에서는 마우스 근위 결장 루프 또는 pcLoop 세그먼트를 생성하는 수술 절차를 설명한 다음 장 상피 투과성을 연구하기 위해 세그먼트에 형광 마커를 내강 내 주입하는 방법을 설명합니다.

Mouse Proximal Colon loop Model의 생성: 내강내 주사 후 혈청 내 형광 마커를 검출하여 근위 결장 루프를 생성하고 장 투과성을 측정하는 수술 절차

이 비디오는 생체 외 쥐 결장에서 결장 구심성 신경의 활동을 기록하는 방법을 보여주며, 양쪽 끝에 캐뉼레이션하고 식염수를 주입하여 내강 내압을 증가시키는 방법을 보여줍니다. 압력이 증가하면 신경 신호가 증가하여 자극을 나타냅니다.

생체 외 쥐 결장에서 결장 구심성 신경의 전기생리학적 기록

이 비디오는 구심성 신경 활동에 대한 조직 압력과 운동 변화의 영향을 연구하기 위해 절개된 마우스 제주널 분절에서 장간막 구심성 신경의 전기 신호를 기록하는 과정을 보여줍니다.

생체 외 마우스 Jejunum 분절에서 장간막 구심성 신경 활동의 기록

출처: Fried, D. E., Gulbransen, B. D. In situ ca2+ 장 신경계의 영상. J. Vis. Exp. (2015)이 비디오는 칼슘을 보여줍니다. 마우스 Colonic Myenteric plexus 제제에서 장 뉴런 및 신경교세포의 활동을 시각화하고 분석하기 위한 이미징.

Calcium Imaging of enteric Neuron and Glia Activities in a Mouse Colonic Myenteric Plexus(마우스 결장 근육총에서 장 뉴런 및 신경교 활동의 칼슘 이미징)

우리는 장용 신경계의 신경 세포 및 교세포 구성 요소의 직접적인 연구를위한 세포 배양 프로토콜을 보여줍니다. coverslips는에 신경 / glia의 혼합 문화, 면역 전기 생리학, 개별 신경 세포와 아교 세포 기능을 검사 할 수있는 기능을 제공하는 성인 마우스 myenteric 신경 얼기에서 준비가되어...

<em&gt; 체외</em성인 마우스 Myenteric 신경총에서 분리 된 장내 뉴런과 교세포의&gt; 준비

지난 몇 년 동안, 새로운 세대의 내시경은 쥐 대장염과 대장 종양을 평가하기위한 중요한 진단 연구 보조로 등장했습니다. 우리는 생쥐의 염증과 대장 종양의 내시경 적 평가뿐만 아니라 대장염과 대장 종양의 내시경 심각도를 문서화하는 진수 식별자를 사용하는 새로운 채점 시스템에 여기에 대한 자세한 프로토콜을 제시한다.

검증 된 내시경 채점 시스템을 사용하여 대장염과 대장 종양의 위험을 평가하기 위해 마우스의 유연한 대장 내시경 검사

우리는 단단한 내시경을 사용하여 마우스의 결장 병리학 치료를 위한 치료제의 효능을 종단적으로 모니터링하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 살아있는 마우스에서 개별 종양의 치료 반응을 특성화하고 잠재적인 질병 재발을 모니터링하는 데 쉽게 사용할 수 있습니다.

라이브 마우스의 직렬 내시경 이미징을 사용하여 소장 병변에 대한 새로운 치료제의 효능의 비 침습적 평가

이 기사에서는 성체 마우스에서 결장 운동성의 신경 조절 변화를 식별하기 위한 비디오 이미징 기술과 고해상도 시공간 매핑에 대해 설명합니다. 위장관(GI) 기능에 대한 미묘한 영향은 위장관 질환에 대한 이해를 증진하기 위해 분리된 조직 제제에서 이 접근법을 사용하여 감지할 수 있습니다.

비디오 이미징 및 시공간지도는 마우스에서 위장관 운동성을 분석하는

장간막 구심성 신경은 위장관에서 뇌로 정상적인 항상성과 병태생리학에 관한 정보를 전달합니다. 위장 구심성 신경 활동은 구심성 신경이 부착된 분리된 장 분절을 장기 욕조에 장착하고, 신경을 분리하고, 기저 활동과 자극 활동을 평가하여 평가할 수 있습니다.

마우스 Jejunal과 대장 세그먼트에서 장간막 구 심성 신경 활동의 생체 외 녹음에서

비정상적인 감각 기능 내장 고통 및 다른 증상 기능 및 염증 성 대 장 질환의 기초. 프로토콜에는 비보 전 쥐 colorectum 저 승 구심 성 신경의 electrophysiological 녹음에 대 한 여기에 제공 됩니다.

생체 외에서 쥐에 있는 저 승 구심 성 섬유의 Electrophysiological 속성의 특성

Enterochromaffin (EC) 셀 위장 상피 세포의 작은 하위 집합으로 구성 됩니다. EC 셀 전기 고르기가 고 아직 경작 하 고 EC 셀 식별 어려움 생리 연구 제한 세로토닌을 출시. 여기에 제시 된 방법 전기 생리학에 의해 의무가 단일 EC 셀의 기본 문화 모델을 설정 합니다.

기본 교양된 Murine Enterochromaffin 셀의 전체 셀 전기 생리학

학습하세요 마우스 대장 직장의 외부 수입성 신경 말단을 생체 외에서 기능적으로 특성화하는 방법을. 단일 섬유 전기생리학 기록을 통해 기계 및 화학 자극에 대한 반응을 분석하고, 다양한 기계수용성 말단 유형을 식별하여 통각 메커니즘 연구에 활용합니다.

마우스 대장 수입 성의 엔딩의 생체 기능 특성에

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