2014년 11월 9일
이 기술의 목표는 연구자들이 모든 연령의 Drosophila melanogaster에서 번데기 안구 디스크의 해부, 면역 염색 및 장착을 수행할 수 있도록 하는 것입니다.
동공 디스크 해부 및 초파리 melanogaster의 장착에 오신 것을 환영합니다. 적절한 HD 번데기를 선택해야 합니다. 해부는 동공 케이스를 뚫고 케이스에서 번데기를 제거하는 것으로 시작됩니다.
번데기의 흉부 중간에 대각선으로 절단이 이루어집니다. 번데기를 자른 후 IIS를 장착하기 전에 뇌와 IIS를 분리하고 처리합니다. 현미경 검사가 해부 과정을 시작하고 적절하게 나이를 먹기 위해 번데기를 선택합니다.
번데기를 해부 접시에 큰 PBS 방울에 넣으십시오. 가장 좋은 방법은 입 고리가 아래를 향하도록 번데기의 방향을 잡는 것입니다. 이것은 입 고리를 아래쪽으로 향하게 하는 입 고리입니다.
한 쌍의 집게로 번데기를 부드럽게 잡습니다. 날카로운 집게로 동공 케이스 내부의 발달 중인 번데기를 너무 세게 쥐지 않도록 주의합니다. 눈동자를 뚫고 네 걸음을 벌려 끝을 떼어냅니다.
안으로 손을 뻗어 방금 만들어진 구멍에서 발달 중인 번데기를 잡습니다. 다음으로, 가위를 가지고 번데기를 흉부 중간 수준으로 자릅니다. 대각선으로 자릅니다.
그런 다음 파편을 제거하거나 PU를 새로운 PBS 방울로 옮기는 것이 가장 좋습니다. 세척은 피펫 블로어 튜브를 사용하여 수행할 수 있으며 필요에 따라 PBS를 추가하여 탈수를 방지해야 합니다. 다음으로, 한 쌍의 집게로 동공 머리 큐티클의 상단을 단단히 잡습니다.
송풍기 튜브의 끝을 사용하여 큐티클 내의 조직을 잡지 마십시오. 동공 케이스를 부드럽게 밀어 뇌를 돌출시키고 동공 케이스에서 눈 디스크를 부착합니다. 이 과정을 돕기 위해 송풍기 튜브의 PBS를 사용하여 헤드 케이스에서 여기에서 보이는 파편을 부드럽게 불어내어 뇌와 I 디스크가 주변 조직에서 분리되고 쉽게 식별될 때까지 필요에 따라 밀고 불어내는 이 과정을 계속할 수 있습니다. 이미 시작되었고 I diss는 약간의 색이 있습니다.
눈 디스는 빨간색으로 윤곽선이 표시되고 그 사이에 뇌가 강조 표시됩니다. 더 높은 배율에서 각 I 디스크를 쉽게 식별할 수 있습니다. 다시 말하지만, I 디스크는 빨간색으로 윤곽이 그려져 있으며 그 사이에 뇌가 있습니다.
뇌와 I.디스크는 집게와 송풍기관을 최적으로 사용하여 계속 청소하고 나머지 조직과 분리해야 하며, 눈 디스크와 뇌는 향후 조작을 위한 집게의 손잡이 역할을 할 수 있도록 머리 표피에 계속 부착되어 있어야 합니다. 불고 미는 과정을 통해 머리 표피에서 뇌와 눈 디스크를 제거하는 것이 일반적입니다. I dis와 뇌를 조심스럽게 분리한 후 조직을 고정된 용액에 부드럽게 넣습니다.
처음에는 I 디스크가 스스로 무너져 고정되지 않도록 고정 장치 위에 떠 있게 합니다 닫힌 방향에서 가장 좋은 방법은 I 디스크를 해부하고 고정 장치 위에 떠 있게 하는 것입니다. 다음 I 디스크 세트가 해부되는 동안 그들은 떠 있는 상태로 남아 있으며, 그런 다음 I 디스크를 고정한 후 고정 장치에 잠깁니다. 면역 염색과 같이 필요에 따라 처리된 다음 시각화를 위해 슬라이드에 장착됩니다.
다음은 뇌가 여전히 PBS의 큰 방울에 부착 된 고정 동공 I 디스크입니다. 마운팅 및 글리세롤은 매우 어렵지만 iis와 50% 글리세롤 및 PBS를 성공적으로 장착했습니다. PBS에 마운트하는 경우 탈수를 피해야 합니다.
머리의 표피가 제거된 것을 볼 수 있습니다. 빨간색으로 표시된 것은 각 I 디스크입니다. 그 사이에 뇌가 강조 표시됩니다.
날카로운 집게를 잡고 안구 디스크와 뇌 사이의 연결을 끊으십시오. 이것은 뇌를 잡고 날카로운 집게를 여기 연결부에 놓음으로써 이루어집니다. 이것은 매우 어려울 수 있습니다.
날카로운 집게를 사용하는 것이 중요한데, 그 이유는 이 과정을 훨씬 쉽게 해주기 때문입니다. 미세한 해부 바늘을 사용하여 이러한 분리를 할 수도 있을 뿐만 아니라 볼 수 있습니다. 때로는 눈 디스크와 연결부를 안정시키면서 뇌를 분리하는 것이 더 쉽습니다.
이 안구 디스크에는 상당히 많은 외부 조직이 남아 있으며, I 디스크가 이쪽이 위를 향하도록 현미경 슬라이드에 장착하는 한 안구 디스크의 이미징에 영향을 미치지 않습니다. 이를 통해 I 디스크의 정점 표면이 현미경 슬라이드에서 평평해질 수 있습니다. 우리는 이 조직을 더 제거함으로써 일반적으로 I 디스크의 조직 손상을 초래한다는 것을 발견했습니다.
따라서 이 조직을 그대로 두고 이미징 단계에서 피하는 것이 좋습니다. 뇌를 제거하는 또 다른 방법은 여기에서 볼 수 있듯이 해부 바늘이나 날카로운 집게로 눈 디스크를 연결 부위에 고정한 다음 뇌를 빼내는 것입니다. 이 분리는 I 디스크에 남아 있는 조직이 적어 훨씬 깨끗했습니다.
모든 I 디스크 준비를 마쳤으면 광학 트랙이 위쪽을 향하도록 일렬로 정렬합니다. PBS를 제거하고 VTA 실드 또는 기타 장착 매체로 교체한 다음 커버 슬립으로 덮습니다. 이제 I 디스크는 상세한 면역 염색 프로토콜과 함께 여기에 설명된 기술을 통해 이미지화할 준비가 되었습니다.
원고에서 I 디스크는 포스포티로신 염색과 함께 여기에서 볼 수 있는 형태학적 특성에 대해 컨포칼 현미경으로 시각화할 수 있으며, I 디스크에서 오멜 세포의 정점 형태를 드러낼 수 있습니다. 다른 항체 및 유전 기술을 사용하여 I 디스크의 원뿔 세포에서 절단된 전사 인자의 발현에 대해 여기에서 볼 수 있는 바와 같이 세포 파이프 및 발현 패턴을 식별할 수 있습니다. 이 비디오는 학부생에게 이 기술을 가르치기 위해 제작된 교육 비디오를 리마스터링한 것입니다.
많은 학생들이 이 비디오를 사용하여 이 기술에 대한 교육을 성공적으로 받았으며 여러분에게도 도움이 되기를 바랍니다. 실험에 행운을 빌며 이 기술이 도움이 되기를 바랍니다.
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본 문서는 Drosophila melanogaster 유충 눈 디스크의 분리, 면역 염색, 마운팅에 대한 기술을 설명합니다. 이 과정은 적절한 연령의 유충을 선택하는 것부터 시작하며, 추가 분석을 위해 필요한 구성 요소를 분리하기 위한 신중한 분리를 포함합니다.
Dissection and mounting of Drosophila pupal eye discs enables high-resolution visualization of cellular architecture and protein expression in a genetically tractable model system. This approach supports target validation and mechanistic de-risking in early discovery by providing quantitative, reproducible readouts of developmental processes. The technique enhances predictive confidence for pathway interrogation and phenotypic screening in neurobiology and genetics research.
The method integrates into early discovery workflows by providing biologically relevant, quantifiable outputs for hypothesis testing and pathway analysis.