후생 동물 모델 생물을 사용하여 확산 및 독성 프리온 같은 단백질을 조사

다음 실험의 전반적인 목표는 Metazoan 모델 유기체 C elegance를 사용하여 단백질과 같은 PreOn의 확산 및 복잡한 독성을 조사하는 것입니다. 이는 타임 랩스 형광 현미경을 사용하여 PreOn과 같은 단백질을 포함하는 소포의 세포 내 및 세포 내 수송을 모니터링함으로써 달성됩니다. Next 조직 특정 접힘 센서 및 유비쿼터스 표현 스트레스.

리포터는 세포 적합성에 대한 세포 자율 및 비세포 자율 효과를 평가하는 데 사용됩니다. 그런 다음 PreOn 유도 독성의 새로운 변형자를 식별하기 위해 게놈 전체 RNAi 스크리닝을 수행합니다. 스크리닝은 독성에 대한 판독값으로 스래싱을 사용하여 액체 배양에서 수행됩니다.

마지막으로, 웜 트래커, 이미지 J에 대한 A 플러그인은 C 우아함의 움직임을 조합하여 정량화하는 데 사용됩니다. 이러한 방법을 사용하면 단백질과 같은 PreOn의 세포 간 이동과 관련된 유전 경로와 비세포 자율 독성을 분리할 수 있습니다. 동기화된 바다 우아함 제어 및 PreOn 도메인 형질전환 라인 및 10% 아그로스 패드를 준비한 후, 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 따라 100나노그램의 폴리스티렌 비드 3마이크로리터와 4밀리몰 리마솔 3마이크로리터를 아그로스 패드에 피펫팅합니다.

백금 와이어를 사용하여 원하는 나이의 웜을 플레이트에서 용액으로 옮기고 커버 슬립을 사용하여 웜을 덮고 세포 내 수준에서 웜을 이미지화합니다. 컨포칼 현미경의 현미경 슬라이드 홀더에 슬라이드를 놓고 63 x 또는 100 x 1.4 NA 오일 대물렌즈를 사용합니다. 그런 다음 METAMORPH를 열고 다차원 획득을 선택합니다.

그리고 메인 탭에서 시간 경과 및 실행 저널 확인란을 선택합니다. 저장 탭에서 파일을 저장할 디렉토리 폴더를 선택하거나 생성하고 파일에 이름을 할당합니다.파장 탭에서 Yoko quad red 또는 MRFP 이미징의 동등한 조명을 사용하고 노출을 100에서 300밀리초 사이로, 카메라 게인을 100에서 300 사이로 조정합니다. 그런 다음 타임랩스 탭에서 시간 간격을 1초로, 지속 시간을 5분으로, 시간 포인트 수를 301로 설정합니다.

저널 탭 아래. 저널의 경우 A FC 세트, Z 홀드 및 A FC 리턴 투 Z 홀드 유형 선택 스페셜 두 번 및 초기 포인트의 경우 시점 시작과 종료 시점을 선택합니다. 설정이 완료되면 acquire를 누릅니다.이 절차에 따라 입자 추적 응용 프로그램과 같은 다른 방법을 사용하여 디스커스의 동적 속성을 측정할 수 있습니다.

프리온 도메인 형질전환 및 유형 선충을 동기화하고 텍스트 프로토콜에 따라 inger RNAI 라이브러리 플레이트를 복사한 후, 복제된 RNAi 플레이트를 섭씨 37도 및 300RPM에서 배양하여 빈 벡터 L 4 4 4 0을 보유한 HT 1 15 E 대장균 박테리아를 대조군으로 사용합니다. 배양 튜브에서 별도로 성장시킨 다음 멀티 채널 피펫을 사용하여 65 마이크로 리터의 배양물을 2 96 웰의 1/4로 옮깁니다. 다중 채널 헤드가 디스펜싱된 자동화된 워크스테이션이 있는 웰 플레이트.

10 마이크로리터의 5, 희석된 IPTG의 밀리몰을 RNAi 박테리아와 대조 플레이트의 각 웰에 넣습니다. 박테리아가 배양하는 동안 3시간 동안 배양하기 전에 다시 밀봉하십시오. 동기화된 야생형 대조군과 형질전환 L 유충 1종과 M 9 버퍼 웰을 혼합하고 5-10 마이크로리터를 유리 현미경에 피펫팅합니다.

슬라이드로 웜을 세고 마이크로리터당 웜 수를 계산합니다. 3시간 동안 박테리아를 배양한 후 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 기생충에게 열 스트레스를 주지 않도록 실온에 두십시오. 다음으로, 텍스트 프로토콜에 따라 M nine 버퍼에 IPTG 콜레스테롤과 항생제를 보충합니다.

그리고 고르게 분포하기 위해 마이크로리터 혼합물당 15개의 웜의 최종 농도에 적절한 양의 PreOn 도메인 형질전환 웜 용액을 추가합니다. 그런 다음 RNAi 플레이트의 각 웰과 빈 벡터 대조 플레이트 중 하나의 웰에 50마이크로리터를 분배합니다. 야생형 웜 용액을 두 번째 제어판에 분배합니다.

그런 다음 모든 플레이트를 밀봉하지 않은 상태로 두어 통기를 허용하고 4-5개의 플레이트를 함께 쌓고 젖은 종이 타월로 감싼 다음 알루미늄 호일로 포장하여 액체 배양액이 증발하지 않도록 합니다. 플레이트를 섭씨 20도 및 200RPM에서 4일 동안 배양합니다. 플레이트에는 모니터가 있는 컴퓨터에 연결된 Falcon four M 60 카메라를 사용하여 대조군 처리된 PreOn 도메인 형질전환 동물과 비교하여 증가된 스래싱을 시각적으로 스크리닝합니다.

자동 액체 취급 워크스테이션을 사용하여 웜을 R RNAi 플레이트에 분배하는 주요 이점은 변동성과 웰당 웜 수를 크게 줄일 수 있다는 것입니다. 고체 플레이트에서 운동성 분석을 수행하고 후보 RNAi 클론을 검증하기 위해 텍스트 프로토콜에 따라 하룻밤 사이에 RNAi 박테리아를 성장시킵니다. 그런 다음 1밀리몰 IPTG를 사용하여 3시간 동안 DS RNA의 발현을 유도합니다.

각 RNAi 박테리아 클론 150마이크로리터를 사용하여 이전에 준비된 NGM 플레이트를 얇은 층으로 퍼뜨리는 시딩합니다. 실체 현미경으로 어두운 곳에서 실온에서 박테리아를 이틀 동안 건조시킵니다. 앞서 설명한 대로 동기화된 웜과 현탁액의 양을 결정하고 각 실험 플레이트에 25-30L의 유충 하나를 추가합니다.

선충이 도달할 때까지 섭씨 20도에서 4일 동안 부화시킵니다. 성인이 된 지 2일째가 되면 웜 운동성을 정량화하고 카메라와 간단한 PCI 이미징 소프트웨어를 켭니다. 카메라 아이콘을 클릭하면 이미징 조건을 조정할 수 있습니다.

다음으로, 이미징 조건을 다음과 같이 설정합니다. 게인을 제로 조명 모드로 설정하고 고속 인덱스를 1로, 비닝을 2로 설정합니다. 그런 다음 라이브 및 자동 노출을 클릭하고 현미경 미러와 밝기 및 대비 다이얼을 움직여 조명 조건을 조정합니다.

시간을 클릭하고 스캔하여 폴더와 파일 이름을 입력하고 필드 지연을 20밀리초로 설정하고 시간 중지를 30초로 설정합니다. 라이브 리뷰를 눌러 녹음할 플레이트 영역을 선택합니다. 그런 다음 스테이지에서 접시를 서너 번 두드립니다.

시야각에서 해당 위치를 빠르게 확인하고 동영상 녹화가 완료된 후 시작을 누르고 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭한 다음 Export Montage Sequence를 선택하여 동영상을 CXD 형식에서 A VI 파일로 내보냅니다. 이동성 비디오를 분석하려면 이미지 J를 열고 플러그인 탭을 선택한 다음 웜 트래커를 선택하고 웜 트래커 배치를 선택한 다음 웜 트래커의 기본 입력 창에서 분석할 모든 파일이 포함된 디렉토리를 선택하고 여기에 설명된 대로 입력 값을 일괄 로드합니다. 각 매개변수에 대한 설명은 플러그인과 함께 제공되는 지침에서 찾을 수 있습니다.

확인을 클릭하고 이동 분석을 실행하도록 허용합니다. 마지막으로, 결과를 선별하기 위해 감지된 모든 트랙이 실제 바다의 우아함에서 온 것인지 확인하고 아티팩트를 제거합니다. 각 영화에 대해 생성된 TXT 파일을 열고 정보를 데이터 분석 소프트웨어 파일에 복사합니다.

생성된 라벨 zip 파일을 열고 결과 라벨 TIFF를 실행하여 잘못된 웜 트랙을 수동으로 확인하고 제거합니다. 연구실의 전 박사후 연구원인 Yesper Peterson은 독성에 대한 판독인 CL Elegance motil의 수동 평가를 대체하기 위해 웜 추적기에 대한 아이디어를 처음 떠올렸습니다. 웜 추적기를 사용하면 사용자 편향 없이 자동화된 방식으로 이러한 실험을 수행하는 동시에 타임랩스 이미징을 사용하여 더 짧은 시간에 더 많은 조건을 평가할

RFP는 세뇨관 소포에 축적되는 R two E 2 태그를 붙였으며, 접힘 센서 또는 스트레스 리포터를 발현하는 coex에 의해 세포 내부 및 세포 간에 운반되는 것을 보았습니다. 단백질 세포와 같은 PreOn과 함께 자율 및 비세포 자율 효과를 평가할 수 있습니다. 근육 세포에서 R two E two의 발현은 장에서 Q 44 응집의 조기 발병으로 이어지며, R two E 2 의 proteostasis에 대한 비세포 자율 효과가 있음을 밝히고, R 2 E 2의 공동 발현은 SOD 3 PGFP 전사 산화 스트레스 리포터로 다른 조직에서 리포터의 상향 조절로 이어집니다. PreOn 도메인이 전체 게놈 스크리닝을 자율적으로 따라 비세포에서 산화 스트레스 반응을 유도한다는 것을 보여줍니다.

이 영화는 컴퓨터 화면의 고해상도 이미징 및 시각화를 통해 플레이트의 1/4을 동시에 스크리닝할 수 있음을 보여줍니다.일단 마스터하면 이러한 스크리닝 프로토콜은 세션당 25개의 플레이트로 구성된 12라운드로 수행할 수 있습니다. 일주일에 두 번의 세션을 수행하는 경우 전체 RNAi 라이브러리를 6주 이내에 스크리닝할 수 있습니다. 웜 트래커는 여기에서 볼 수 있듯이 C 엘레강스 운동성을 정량화하는 데 사용되었습니다.

웜 트래커는 원본 비디오를 바이너리 형식으로 변환하고 각 웜에 트랙을 할당합니다. 처리된 비디오는 아티팩트를 수동으로 제거하기 위해 겹쳐진 트랙으로 볼 수 있습니다. 초당 몸체 길이 매개변수는 잠재적인 크기 차이를 정규화합니다. 선충류.

이 방법은 대조군 처리된 웜에 비해 운동성 표현형을 최소 133%에서 최대 256%까지 증가시킨 PreOn 유도 독성의 35가지 억제 인자를 식별했습니다. 웜 추적기를 임대하는 동안 웜 추적 획득을 수동으로 확인하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 소프트웨어는 벌레를 식별하는 데 큰 역할을 하지만 때로는 배경이 여전히 동물로 잘못 식별될 수 있습니다.

따라서 웜 추적기를 실행한 후 비디오를 확인하는 것을 잊지 마십시오. 이러한 방법은 특정 질병 연결 단백질이 세포에서 세포로 퍼질 수 있는지, 유사한 prence인지 또는 세포 간 전달과 이러한 단백질의 복잡한 독성 사이에 연결이 있는지 여부와 같은 신경 퇴행성 질환 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 아이.