Name: SDF-1α-키토산 덱스 트란 황산 나노 입자의 제조 및 특성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: 학습하세요 SDF-1α-키토산-덱스트란 황산 나노입자 제조 및 특성 분석 방법을. 줄기세포 유도 인자를 나노입자에 효과적으로 담아 생체 활성을 유지하는 이 기술은 재생의학 연구에 활용됩니다.

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HL671795, HL048743 및 HL108630 :이 작품은 NIH 보조금에 의해 지원되었다.

SDF-1α 글리 칸 나노 입자의 1. 준비 생체 내 전달의 목적으로 인해, 제조에 사용 된 모든 용기, 피펫 팁을 소독. <ol><li> 초순수에서 다음 원액을 준비 : 1 % 덱스 트란 황산; 1 M의 NaOH (PES 막으로 멸균 여과); 0.1 % (0.8 연속적 0.22 μm의 필터를 통해 필터 및 그 후에 NaOH로 pH가 5.5로 조정), 0.2 % 빙초산 키토산; 0.1 M ZnSO 4; 15 % 만니톨; 0.92 ㎎ / ㎖ SDF-1α (80 ° C에서 분취 액에 저장되고, 4 ℃에서 보관 일단 해동 C). </li><li> 0.22 μm의 필터 멤브레인을 통해 재고 솔루션을 소독. 리 물러의 amebocyte 용 해물 (LAL) 젤 응고 분석에 준비된 용액에 독소 수준을 평가합니다. 수준이 &lt;0.06 EU / ㎖ 있는지 확인합니다. </li><li> 자기 교반 막대를 함유하는 1.5 mL 유리 바이알에 0.18 ml의 초순수를 추가한다. 800 rpm으로 교반 속도를 설정합니다. 0.1 ml의 1 %를 추가덱스 트란 설페이트 및 2 분 동안 교반한다. 0.08 mg을 SDF-1α (0.92 Mg를 0.087 ㎖ / ml의 SDF-1α 용액)를 첨가하고, 20 분 동안 교반한다. </li><li> 0.33 ml의 0.1 % 키토산 적가하고 추가 5 분 동안 교반한다. 변경 볶음 최대 속도 (1 분 이상) 0.1 ML의 주사기로 천천히 0.1 ml의 0.1 M ZnSO 4를 추가합니다. </li><li> 800 rpm으로 교반 속도를 반환하고, 30 분 동안 교반한다. 0.4 ml의 15 % 만니톨을 추가하고 5 분 동안 교반한다. 1.5ml의 미세 원심 분리 튜브에 반응 혼합물을 전송. 10 분 동안 4 ° C에서 16,000 XG에 원심 분리기. 주 : 만니톨의 존재는 원심 분리 후 입자의 부유를 용이하게한다. 펠릿의 소형화에 따라 만니톨의 농도는 0 %에서 5 %로 변화 될 수있다. 원심 분리 후, 각 입자의 완전 재현 탁하여 최종 현탁액 응집체를 피하기 위해 중요하다. </li><li> 기음 뜨는 천천히 액체의 마지막 한 방울을 제거하기 위해 피펫을 사용합니다. 0.2 ml의 5 % 만니톨을 추가합니다. 0.5 ml의 펠렛을 일시 중단, 29 G의 옛 성은DLE 주사기. 1 ml의 5 % 만니톨을 추가합니다. 15 분 동안 16,000 XG에 원심 분리기. </li><li> 단계를 반복 1.6. </li><li> 뜨는을 기음. 0.2 ml의 5 % 만니톨 펠렛을 재현 탁. 4 ° C에서 입자 현탁액을 저장합니다. 주 : 입자 현탁액도 저장 -80 ° C에서 동결 또는 동결 건조 될 수있다. 서스펜션 포함 5 % 만니톨 동결 및 해동 후 또는 동결 건조 및 수분 보충 후 입자의 응집을 방지하기 위해 필수적이다. 만니톨 보존 후의 현탁액을 원심 분리에 의해 제거 될 수있다. </li></ol> 입자 크기와 제타 전위 2. 측정 입경 및 제타 전위를 소재리스트에 표시된 입자 분석기로 각각 동적 광산란 및 전기 영동 광 산란에 의해 분석된다. <ol><li> 축적 시간 : 다음 입자 크기 측정을위한 파라미터를 설정 (70); 반복 시간 : 4; 온도 : 25 ° C;희석제 : 물; 강도 조절 : 자동. </li><li> 물 (10 배 희석)와 SDF-1α-DS-CS 샘플을 희석. 이러한 에펜 도르프 베트로 일회용 UV 큐벳에 시료 100 ㎕를 넣습니다. 셀 홀더에 큐벳을 삽입합니다. &quot;최적&quot;(~ 10,000 CPS)에 도달하기 위해 강도 조정 기다립니다. 데이터 수집을 시작합니다. </li><li> 측정이 완료되면, 직경 (㎚) 및 다 분산도 지수 cumulants 결과를 기록한다. 4 반복 판독 각각으로부터 얻어진 결과를 평균치와 표준 편차를 계산한다. </li><li> 로드 제타 전위 측정 플로우 셀에 10 배 희석 한 시료의 입자 500 μL. 누적 시간 : 다음 측정을위한 매개 변수를 설정합니다 (10); 반복 시간 : 5; 온도 : 25 ° C; 희석제 : 물; 강도 조절 : 자동. 제타 전위 (MV)의 결과를 기록한다. (5) 판독 반복의 각각으로부터 얻어진 결과를 평균 및 표준을 계산 deviatioN. </li></ol> 입자의 SDF-1α의 3 정량화 <ol><li> 1.3 램 믈리 샘플 버퍼에 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05 ㎎ / ㎖의 농도 자유 양식 SDF-1α를 희석. 40 μL의 1.3 배 램 믈리 샘플 버퍼 6 μL SDF-1α-DS-CS 샘플을 희석. (나눈다. 작은 분취 량으로 원액을 0.25 M 트리스 -HCl, pH가 7.5, 8 % SDS, 40 % 글리세롤, 0.05 ㎎ / 브로 모 페놀 블루,는 ml 8 % 2- 머 캅토 에탄올을 함유 4X 램 믈리 스톡 완충액을 준비하고 -20 ℃로 유지 단일 사용하기 위해 C를 °.) </li><li> 10 분 동안 100 ℃에서 샘플을 가열한다. 소용돌이 입자를 완전히 해리시키기 위해 10 분 동안 가열 시간 배 샘플 (최대 속도로 10 초 동안 각각). 2 분 동안 RT에 샘플을 냉각. 0.5 분 10,000 XG에 원심 분리기는 응축수를 가져올 수 있습니다. 소용돌이는 다시 잘 섞는다. 참고 :이 시점에서, 시료 용액이 눈에 보이는 침전물 존재와 명확해야한다. </li><li> 로드 10# 181; L 샘플 / 웰에 4-20 %의 SDS 젤. 20 분 동안 200 V의 전기를 실행합니다. 코마시 블루 단백질 얼룩 젤을 얼룩. </li><li> 분자 이미 저와 농도계 분석 소프트웨어를 사용하여 SDF-1α의 단백질 밴드 밀도를 검사합니다. 무료 SDF-1α 표준 구성된 표준 곡선에 대한 입자 SDF-1α의 양을 계산합니다. </li></ol> 생체 외 자료 분석 4. <ol><li> 1 칼슘과 마그네슘 (D-PBS)없이 둘 베코 인산염 완충 생리 식염수와 SDF-1α 글리 칸 입자를 혼합 : 1의 비율 (v / v)로. </li><li> 1.5 ml의 튜브에 0.05 ㎖의 분취 량으로 입자 현탁액을 나눕니다. 튜브의 바닥에 샘플을로드합니다. 기포를 도입 또는 액체의 표면을 방해하지 않도록. 파라 필름으로 튜브의 상단을 밀봉합니다. 주 : 이때, 액체는 튜브 믹서 후속 상하 회전시 하단에 남아있을 것이다. </li><li> 37에서 튜브를 회전# 176; C 회전 마이크로 튜브 믹서에. 지정된 시간에 튜브에서 분취 액을 제거하고 즉시 4 ° C에서 10 분 동안 16,000 XG에서 원심 분리. </li><li> 상층 액과 펠렛을 분리, 0.05 ml의 D-PBS로 펠렛을 재구성. -20 ° C에서 샘플을 저장합니다. 모든 샘플이 수집 된 후 전술 한 바와 같이, SDS 겔상에서 상등액과 펠릿을 조사. </li></ol> 5. 마이그레이션 분석 이 분석은 SDF-1α의 화성 활동을 측정합니다. 세포 표면의 수용체 (CXCR4)와 SDF-1α의 상호 작용은 SDF-1α의 그라데이션으로 세포의 이동을 야기한다. 이 분석에서, 세포는 낮은 잘으로하고 SDF-1α 솔루션 (낮은 우물에서 반투과성 막에 의해 분리) 상부 우물에로드됩니다. <ol><li> SDF-1α 희석 (유리 또는 입자 - 결합 된 형태) -3- FO에서 이주 완충액 (0.5 % 소 혈청 알부민을 함유하는 RPMI-1640 배지)100, 33, 11, 3.7, 1.2, 0.41, 0.14, 및 0.05 ng를 / ㎖의 최종 농도로 용액을 희석 LD. </li><li> 24 웰 플레이트에 웰에 희석 된 SDF-1α 솔루션 또는 마이그레이션 버퍼 만 (대조군)의 0.6 ML을 추가합니다. 잘 (입력 셀 제어)에 0.57 ml의 마이그레이션 버퍼를 추가합니다. 30 분 동안 37 ℃에서 배양한다. 이러한 낮은 잘 위에없이 Transwell (기공 크기 5 μm의 직경 6.5 mm)로 투과 세포 배양 삽입을 놓습니다. 트랜스 웰에 0.1 ml의 된 Jurkat 세포 (5 × 10 5)를 삽입로드. 잘 입력 세포 제어에 직접 0.03 ml의 세포를로드합니다. 5 % CO 2 인큐베이터에서 2 시간 동안 37 ℃에서 플레이트를 인큐베이션. </li><li> 트랜스 웰 인서트를 제거합니다. 4 ml의 폴리스티렌 튜브에 낮은 우물로 마이그레이션 한 세포를 전송합니다. 유량 계측기와 마이그레이션 된 세포를 계산합니다. </li><li> negat에 숫자의 감산 입력 후 세포 수 (X 웰 100/30 입력 셀 컨트롤 세포 수)의 백분율로 계산 이주컨트롤 (에만 이동 완충액을 함유하는 웰에 마이그레이션 셀) 필자. </li></ol>

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<li>Yin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SDF-1alpha+in+glycan+nanoparticles+exhibits+full+activity+and+reduces+pulmonary+hypertension+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">SDF-1alpha in glycan nanoparticles exhibits full activity and reduces pulmonary hypertension in rats.</a> Biomacromolecules. 14 (11), 4009-4020 (2013).</li>
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<li>Xu, J., Amiji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+gene+delivery+and+transfection+in+human+pancreatic+cancer+cells+using+epidermal+growth+factor+receptor-targeted+gelatin+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Therapeutic gene delivery and transfection in human pancreatic cancer cells using epidermal growth factor receptor-targeted gelatin nanoparticles.</a> J Vis Exp. (59), e3612(2012).</li>
<li>Lauten, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoglycan+complex+formulation+extends+VEGF+retention+time+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Nanoglycan complex formulation extends VEGF retention time in the lung.</a> Biomacromolecules. 11 (7), 1863-1872 (2010).</li>
<li>Schatz, C., Domard, A., Viton, C., Pichot, C., Delair, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+and+efficient+formation+of+colloids+of+biopolymer-based+polyelectrolyte+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Versatile and efficient formation of colloids of biopolymer-based polyelectrolyte complexes.</a> Biomacromolecules. 5 (5), 1882-1892 (2004).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

전술 한 바와 같이, DS-CS 나노 입자 폴리 음이온 (DS)과 폴리 양이온 (CS) 분자간 전하 중성화를 통해 형성된다. 전하 상호 작용은 분자 충돌시 쉽게 발생하기 때문에, 혼합 중에 중합체 용액 및 교반 속도의 농도는 생성 된 입자의 크기가 중요하다. 일반적인 경향은 더 DS 및 CS 솔루션 (15) 및 작은 입자의 높은 교반 속도 결과를 희석하고 있다는 것이다. SDF-1α 글리 칸의 나노 입자 제제는 필요에 따라 변경 될 수있다. 예를 들어,이 프로토콜에서 사용되는 SDF-1α / DS / CS의 양 및 비율은 각각 0.08 / 0.33 / 1 (㎎ / ㎎ / MG)이다. SDF-1α 나노 입자의 용도에 따라, 이러한 비율을 변경할 수있다. SDF-1α의 양을 첨가하는 경우는 ~, 입자가 더 작 650 내지 0.04 mg의 대신에 0.08의 Mg (0.04 / 0.33 / 1 ㎎ / ㎎ / MG)이며, SDF-1α 포집 효율이 약간 greater...

덱스 트란 황산 (DS)과 키토산 (CS)는 (DS)에 여러 대체 음으로 하전 된 황산 그룹과 폴리 사카 라이드, 또는 양전하 아민 그룹입니다 (CS를 탈 아세틸). 수용액에 혼합 할 때, 두 가지 다당류는 정전 기적 상호 작용을 통해 고분자 전해질 복합체를 형성한다. 얻어진 착물 수용액 (침전물)로부터 상분리한다 큰 응집체 또는 수분 산성 (콜로이드)의 소형 입자를 형성 할 수있다. 이러한 결과에 기여하는 구체적인 조건은 광범위하게 연구되어 왔으며, 최근의 리뷰에서 요약 한 상세히 도시되어있다. 이러한 조건 중에서, 수분 산성 입자를 제조하기위한 두 가지 기본적인 요구 반대로 대전 된 중합체는 1)이 크게 상이한 몰 질량을 가져야이고; 2) 비 화학량 론적 비율로 혼합 될 수있다. 이러한 조건에 의해 생성 된 전하 전하 중성 복합체 중합체 세그먼트를 허용중화는 분리 및 입자의 코어를 형성하고, 여분의 중합체는 외부 쉘을 형성하기 위해 하나한다. 이 프로토콜에 기재된 당쇄 입자는 폐 전달을 위해 의도되고, 음으로 하전 된 순으로 설계되고, 나노 사이즈의. 음극 표면 전하 입자 2,3의 세포 흡수의 가능성을 감소시킨다. 나노 사이즈의 입자는 원위기도 통로를 통해 용이하게한다. 이 목표를 달성하기 위해, 본 제조에 사용되는 DS의 양은 CS 초과 (중량비 3 : 1); 고 분자량은 DS (중량 평균 MW 500,000)와 저분자 CS (MW kDa의 범위 50-190, 75~85% 탈 아세틸)이 사용된다. SDF-1α는 화성 활동을 통해 원점 복귀 기능을 발휘 줄기 세포 호밍 ​​요인이다. SDF-1α는 원점과 골수 조혈 줄기 세포의 유지에 중요한 역할을하고 proge의 모집부상 수리 4,5의 말초 조직에 nitor 세포. SDF-1α는 단백질이 프로테아제 (CD26 / DPPIV) 불활로부터 보호, 헤파린 / 헤파 란 설페이트, 형태 다이머에 결합하고, 세포 표면 수용체를 통해 표적 세포와 상호 작용할 수 있도록 그 단백질 서열에 헤파린 결합 부위를 갖는다 6-8. DS는 헤파린 / 헤파 란 황산과 유사한 구조적 특성이있다; 따라서, DS에 대한 SDF-1α의 결합은 천연 고분자 리간드의 그것과 유사하다. 다음 프로토콜에서 우리는 SDF-1α-DS-CS 나노 입자의 제조 방법을 설명합니다. 절차는 이전에 9를 연구 된 제제 중 하나를 나타냅니다. 프로토콜은 원래 VEGF-DS-CS 나노 입자 (10)의 조사에서 적합하다. 소규모 제조 용이 동일한 스톡 용액 및 제조 조건으로 확장 할 수있는 기술된다. 제조 후, 입자 b를 특징Y는 크기, 제타 전위, SDF-1α 통합의 정도, 체외 방출 시간 및 통합 SDF-1α의 활동을 조사.

<table><tbody><tr><td>덱스트란 황산염</td><td>Fisher</td><td>BP1585-100</td><td></td></tr><tr><td>키토산, 저분자량&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>448869</td><td></td></tr><tr><td>아연 황산염 헵타하이드레이트</td><td>Sigma</td><td>204986</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma</td><td>M9546</td><td></td></tr><tr><td>초순수&nbsp;</td><td>인비트로젠&nbsp;</td><td>10977-023</td><td></td></tr><tr><td>SDF-1&알파;</td><td>참고 8에 따라 준비되었습니다.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>주사기 필터, PES 멤브레인 0.22&nbsp; &#956; m</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>자석 마이크로 교반 바 (2&nbsp; 엑스&nbsp; 7&nbsp; mm)</td><td>피셔&nbsp;</td><td>14-513-63</td><td></td></tr><tr><td>유리 바이알 키트; SUN-SRI</td><td>피셔&nbsp;</td><td>14-823-182</td><td></td></tr><tr><td>Delsa 나노 C 입자 분석기&nbsp;</td><td>Backman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf UVette Cuvets</td><td>Eppendorf</td><td>952010069</td><td></td></tr><tr><td>4&ndash; 20% Mini-PROTEAN TGX Gel</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1096</td><td></td></tr><tr><td>GelCode Blue Safe Protein Stain</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>PI-24592</td><td></td></tr><tr><td>분자 이미저 VersaDoc MP 4000 시스템</td><td>BioRad</td><td>170-8640</td><td></td></tr><tr><td>Corning Transwell 투과성 지원</td><td>Corning</td><td>3421</td><td></td></tr><tr><td>Accuri C6 유세포 분석기</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' S 인산염 완충 식염수&nbsp;</td><td>시그마</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>피로젠트 플러스 키트</td><td>피셔</td><td>NC9753738</td><td></td></tr></tbody></table>

sdf-1α-키토산 덱스 트란 황산 나노 입자의 제조 및 특성

Preparation and Characterization of SDF-1&#945;-Chitosan-Dextran Sulfate Nanoparticles

키토산(CS)과 덱스트란 설페이트(DS)는 하전 다당류(글라이칸)로, 적절한 조건에서 혼합될 때 고분자 전해질 복합체 기반 나노 입자를 형성합니다. 글라이칸 나노입자는 단백질 인자에 대한 유용한 운반체로, 단백질의 생체 내 전달을 촉진하고 표적 조직에서 단백질의 유지를 유지합니다. 글라이칸 고분자 전해질 복합체는 또한 단백질 전달에 이상적이며, 혼입은 수용액에서 수행되어 단백질의 불활성화 가능성을 줄이기 때문입니다. 헤파린 결합 부위를 가진 단백질은 덱스트란 설페이트에 쉽게 부착되고, 차례로 결합에 의해 안정화됩니다. 이러한 입자는 또한 in vivo에서 전달될 때 염증성과 독성이 적습니다. 아래 설명된 프로토콜에서는 줄기세포 귀환 인자인 SDF-1α(Stromal cell-derived factor-1α)를 먼저 혼합하여 덱스트란 설페이트와 배양합니다. 혼합물에 키토산을 첨가하여 고분자 전해질 착물을 형성한 다음 황산아연을 첨가하여 아연 브리지로 착물을 안정화합니다. 그 결과 생성된 SDF-1α-DS-CS 입자는 크기(직경)와 표면 전하(제타 전위)를 측정합니다. 통합된 SDF-1α의 양을 결정한 후 체외 방출 속도와 입자 결합 형태의 화학주성 활성을 측정합니다.

제조 된 SDF-1α-DS-CS 입자의 크기 및 제타 전위는 입자 분석기로 측정된다. 1 사이즈의 측정 분석을 보여준다. 네 개의 반복 된 측정에 의한 결과로부터 cumulants, SDF-1α-DS-CS 입자의 유체 역학적 평균 직경은 661 ± 8.2 (㎚)이고 분산도는 0.23 ± 0.02이다. 제타 전위 측정의 결과는도 2에 도시되어있다. 다섯 반복 측정에서, SDF-1α-DS-CS 입자의 제타 전위는 -24.8 ± 0.5 MV이다. 전술 한 바와 같이, SDF-1α-DS-CS 입자 현탁액에 5 % 만니톨의 존재는 냉동 및 해동 과정에서 입자의 응집을 예방에 필수적이다.도 3으로 보여 물에 현탁시키고 동결 입자의 크기 측정 -80 ° C. 별개의 집계 피크는 해동 후 볼 수 있습니다. AMOSDF-1α-DS-CS 입자의 SDF-1α의 UNT는 SDS...

이 프로토콜의 목적은 줄기세포 귀환 인자인 SDF-1α를 덱스트란 황산염-키토산 나노입자에 통합하는 것입니다. 생성된 입자는 크기와 제타 전위뿐만 아니라 나노 입자에서 SDF-1α의 함량, 활성 및 체외 방출 속도에 대해 측정됩니다.

SDF-1α-키토산 덱스 트란 황산 나노 입자의 제조 및 특성

Chitosan (CS) and dextran sulfate (DS) are charged polysaccharides (glycans), which form polyelectrolyte complex-based nanoparticles when mixed under ...

다음 실험의 전반적인 목표는 SDF-1$\alpha$ 및 dextran sulfate 나노입자를 제조하고 특성을 분석하는 것입니다. 나노입자의 제조는 먼저 줄기세포 호밍 인자인 stromal cell derived factor one alpha(SDF-1$\alpha$)를 dextran sulfate와 혼합하여 음전하를 띤 글리칸에 결합하도록 함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계로 양전하를 띤 글리칸인 chitosan을 혼합물에 첨가하여 dextran sulfate와 함께 폴리전해질 복합체(poly electrolyte complex)를 형성합니다.다음으로 아연 가교를 통해 복합체를 안정화하기 위해 황산아연을 첨가합니다. 결과적으로 생성된 입자는 음전하를 띤 껍질로 둘러싸인 조밀한 코어를 갖게 됩니다. 이후 입자의 크기와 제타 전위를 측정하며, 나노입자 내 SDF-1$\alpha$의 함량과 활성을 측정합니다. SDF-1$\alpha$ 글리칸 나노입자의 주요 장점은 포함된 SDF-1$\alpha$가 입자에서 방출되지 않고도 완전히 활성 상태를 유지한다는 점입니다.따라서, 이 입자들은 줄기세포 치료에서 고정된 헤르민 신호로 활용될 수 있을 것입니다. 우선 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 스톡 용액을 준비하고 0.22 micron 필터 막을 통해 멸균하십시오. 준비된 용액의 엔도톡신 수준을 ulu amoeba cyte lysate 겔 응고법으로 평가하십시오.엔도톡신 수치가 mL당 0.06 EU 미만인지 확인하십시오. 다음으로, 마그네틱 스터 바가 들어 있는 1.5 mL 유리 바이알에 초순수 0.18 mL를 넣습니다. 교반 속도를 800 RPM으로 설정한 후, 1% dextran sulfate 0.1 mL를 첨가하고 2분 동안 교반하십시오.SD F1 alpha 0.08 milligrams를 첨가하고 20분 동안 교반합니다. 0.1% tizen 0.33 milliliters를 한 방울씩 첨가하고 5분 동안 교반합니다. 교반 속도를 최대값으로 변경하고 가스 밀폐형 주사기를 사용하여 zinc sulfate 0.1 milliliters를 천천히 첨가합니다.교반 속도를 800 RPM으로 되돌리고 30분 동안 교반합니다. 그다음 15% mannitol 0.4 milliliters를 첨가하고 5분 후에 교반합니다. 반응 혼합물을 1.5 milliliter fuge tube로 옮기고 16, 000 Gs, 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다.원심분리 후, 상층액을 흡입하고 피펫을 사용하여 마지막 한 방울의 액체까지 제거합니다. 5% mannitol 0.2 milliliters를 천천히 가하고 29 gauge 바늘 시린지를 사용하여 펠릿을 현탁합니다. 그런 다음 원심분리 전 5% mannitol 1 milliliter를 추가로 넣습니다.16,000 GS에서 15분 동안 두 번째로 원심분리합니다. Resus 현탁액 원심분리 과정을 반복한 후, 상층액을 흡입하여 제거하고 펠렛을 0.2 milliliters의 5%mannitol에 재현탁합니다. 입자 크기와 제타 전위는 각각 동적 광산란법(dynamic light scattering)과 전기영동 광산란법(electrophoretic light scattering)으로 분석합니다.먼저, 동적 광산란을 통한 입자 크기 측정 파라미터가 포함된 SOP 목록에서 작업 절차를 선택하십시오. 텍스트 프로토콜에 기술된 대로, SD F1 alpha 입자 샘플을 증류수로 희석합니다. 그다음 Einor Q Vet과 같은 일회용 UV Q Vet에 샘플 100 µL를 로딩하십시오.Q vet을 셀 홀더에 삽입하고 데이터 수집을 시작하기 전 강도 조절이 최적 값에 도달할 때까지 기다립니다. 측정이 완료되면 직경과 다분산 지수의 누적 결과를 기록합니다. 네 번의 반복 측정에서 얻은 결과의 평균을 내고, 전기영동 광산란을 통한 제타 전위 측정의 표준 편차를 계산합니다.10배 희석된 입자 시료 500 µL를 플로우 셀에 로딩합니다. 텍스트 프로토콜에 기재된 측정 파라미터가 포함된 제타 전위 SOP 목록에서 작동 절차를 선택합니다. 제타 전위 측정 결과를 기록합니다.그런 다음 5회 반복 측정하여 얻은 결과의 평균을 내고 표준 편차를 계산합니다. 1x 샘플 버퍼에 희석된 유리 및 입자 결합 SD F1 alpha 샘플을 100 °C에서 10분 동안 가열합니다. 입자를 완전히 해리시키기 위해 10분간의 가열 과정 중 샘플을 두 번 볼텍싱합니다. 샘플을 실온에서 2분 동안 냉각시킨 후, 10,000 ×g에서 0.5~1분 동안 원심 분리하여 응결된 물방울을 가라앉힙니다. 다시 볼텍싱하여 잘 섞어줍니다.이 단계에서 시료 용액은 가시적인 침전물이 없는 투명한 상태여야 합니다. 그다음 4~20% sodium ESAL sulfate 또는 SDS 겔의 각 웰에 시료 10 µL를 로딩합니다. 200 V에서 20분 동안 전기영동을 수행한 후, kumasi blue 단백질 염색액으로 겔을 염색합니다.분자 이미저와 밀도 분석 소프트웨어를 사용하여 SDF-1$\alpha$의 단백질 밴드 밀도를 확인합니다. 유리 SDF-1$\alpha$ 표준품으로 작성된 표준 곡선을 기준으로 입자 내 SDF-1$\alpha$의 양을 계산하여 in vitro 방출 분석을 수행합니다. SDF-1$\alpha$ 글리칸 입자와 칼슘 및 마그네슘이 없는 듀로코스 인산염 완충 식염수(DPBS)를 1:1 비율로 혼합합니다. 입자 현탁액을 1.5 mL 튜브에 0.05 mL씩 분주합니다.튜브 바닥에 샘플을 분주합니다. 기포가 발생하거나 액체 표면이 흐트러지지 않도록 주의하십시오. 파라필름으로 튜브 상단을 밀봉합니다.그다음 회전식 마이크로 튜브 믹서를 사용하여 37 °C에서 튜브를 회전시킵니다. 정해진 시간에 튜브에서 일정량을 분취하고, 즉시 4 °C에서 16,000 Gs로 10분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 상층액과 펠렛을 분리합니다.그 다음 0.05 milliliters의 DPBS로 펠렛을 재구성합니다. 모든 샘플 수집이 완료되면, SDS 젤에서 상청액과 펠렛을 확인합니다. 이전과 마찬가지로, 이 분석은 S df의 화학주성 활성을 측정합니다.S df one alpha와 그 수용체의 한 가지 alpha 상호작용은 SD F1 alpha 농도 구배를 향한 세포의 이동을 유발합니다. 우선, 유리 형태 또는 입자 결합 형태의 SD F1 alpha를 이동 완충액(migration buffer)으로 3배 연속 희석하여 텍스트 프로토콜에 기재된 최종 농도로 만듭니다. 음성 대조군을 위해 24웰 플레이트의 웰 하나에 희석된 SD F1 alpha 용액 0.6 milliliters를 첨가합니다.마이그레이션 버퍼에 대해서도 동일하게 수행한 다음, 입력 세포 대조군용 웰에 마이그레이션 버퍼 0.57 milliliters를 추가합니다. 플레이트를 37 degrees Celsius에서 30분 동안 배양합니다. 그 후, Transwell과 같은 투과성 세포 배양 인서트를 아래쪽 웰 위에 배치하고, Transwell 인서트에 jerk hat 세포 0.1 milliliters를 로딩합니다.그 다음 0.03 milliliters의 세포를 입력 세포 대조군 웰에 직접 로딩합니다. 플레이트를 5% carbon dioxide 인큐베이터에서 37 degrees Celsius로 2시간 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 세포 배양 인서트를 제거합니다.하단 웰로 이동한 세포들을 4 mL 폴리스티렌 튜브로 옮깁니다. 유세포 분석기로 이동한 세포 수를 측정합니다. 마지막으로, 음성 대조군의 수치를 뺀 후 투입 세포 수 대비 이동 세포의 백분율을 계산합니다.여기에서는 SD F1 alpha dextran sulfate ozan 입자 크기 측정 분석 결과가 제시되어 있습니다. CUMUL 결과에 따르면 입자의 수력학적 직경은 671 nanometers이며, 다분산 지수는 0.24입니다. 이 스크린샷은 SD F1 alpha DExT strand sulfate ozan 입자의 제타 전위를 5회 반복 측정하여 얻은 결과 중 하나를 보여줍니다.제타 전위는 -24.7 mV입니다. S df one alpha dextran sulfate ozan 입자 내의 S df one alpha 양은 SDS gel 전기영동으로 추정합니다. 여기에는 SD F1 alpha 표준품, dextran sulfate kaizan 대조군 나노입자 및 SD F1 alpha dextran sulfate kaizan 나노입자 샘플이 로딩된 kumasi 염색 SDS gel이 표시되어 있습니다.SD F1 Alpha 표준 밴드의 밀도 분석을 통해 표준 곡선을 작성합니다. 표준 곡선으로부터 계산한 결과, SDF one alpha 나노입자 샘플 내의 S DF one alpha 농도는 0.03 mg/mL인 것으로 나타났습니다. 나노입자로부터 S DF one alpha의 in vitro 방출 속도를 결정하기 위해, 상층액에 방출된 S DF one alpha의 양과 펠릿에 입자 결합된 sdf one alpha의 양을 SDS 젤의 쿠마시 염색 후 사이토메트리 분석을 통해 측정하였습니다. 입자 결합된 S DF one alpha의 활성은 이동성 분석(migration assay)으로 측정하며, 여기에 표시된 것과 같이 유리 SDF one alpha와 비교합니다.입자에 결합된 SDF one alpha는 측정된 모든 농도에서 유리 SDF one alpha와 동일한 정도의 이동을 유도했습니다. 이 절차를 수행할 때 글리칸 단백질 입자의 제형을 변경할 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 특정 응용 분야에 따라 다른 단백질을 통합할 수 있으며, 입자 크기를 다양하게 하기 위해 서로 다른 제형을 사용할 수 있습니다.본 영상을 통해 나노입자 수집 준비의 기본 기술과 이에 통합된 SDF one alpha의 기능적 분석 방법을 습득하시길 바랍니다.

preparation-characterization-sdf-1-chitosan-dextran-sulfate

Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

현재 줄기 세포 치료에서 주요 장애물은 호스트 조직으로 이들 세포를 전달하는 가장 효과적인 방법을 결정합니다. 지방 파생 줄기 세포들이 multipotency을 유지할 수 있도록하면서 여기에서, 우리는 효과적이고 접근 간단 키토산 기반의 전달 방법을 설명합니다.

줄기 세포 - 로드된 키토산 Microspheres의 배달을 위해 콜라겐 히드로겔을 구축

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ASC의 분화를 제어하는​​ Bilayered 히드로겔 꾸민

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간단한 균질화를 사용하여 신경 성장 인자를 캡슐화하기위한 고밀도의 고밀도 지단백질 모방 나노 입자를 제조 하였다. 과제, nanoparticle 준비, 시험관 특성 및 생체 내 연구에 대한 자세한 프로토콜은이 문서에서 설명합니다.

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조직 공학 응용 분야를 위한 크기 조절 및 무유제 키토산-제니핀 마이크로젤 제조

학습하세요 SDF-1α-키토산-덱스트란 황산 나노입자 제조 및 특성 분석 방법을. 줄기세포 유도 인자를 나노입자에 효과적으로 담아 생체 활성을 유지하는 이 기술은 재생의학 연구에 활용됩니다.

SDF-1α-키토산 덱스 트란 황산 나노 입자의 제조 및 특성

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