SDF-1α-키토산 덱스 트란 황산 나노 입자의 제조 및 특성

다음 실험의 전반적인 목표는 SD F1 Alpha Chias 및 dextran sulfate 나노 입자를 준비하고 특성화하는 것입니다. 나노 입자의 제조는 먼저 줄기 세포 귀환 인자 기질 세포 유래 인자 1 알파 또는 S df 1 알파를 덱스트란 설페이트와 혼합하여 음전하를 띤 글라이칸에 결합을 허용함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계인 오잔으로, 양전하를 띤 글라이칸을 혼합물에 첨가하여 덱스트란 설페이트와 고분자 전해질 복합체를 형성합니다.

다음으로 아연 브리지로 복합체를 안정화하기 위해 황산 아연을 첨가합니다. 생성된 입자는 음전하를 띤 껍질로 둘러싸인 조밀한 코어를 가지고 있습니다. 입자는 이후에 크기와 제타 전위뿐만 아니라 나노 입자에서 S df one alpha의 함량 및 활성에 대해 측정됩니다 SDF one alpha glycan nanoparticles의 주요 장점은 통합 된 SDF one alpha가 입자에서 방출되지 않고 완전히 활성화된다는 것입니다.

따라서 입자는 줄기 세포 치료에서 고정 헤르민 신호로 유용 할 수 있습니다. 먼저 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 원액을 준비하고 0.22미크론 필터 멤브레인을 통해 멸균합니다. 울루 아메바 세포 용해물 겔 응고 분석으로 준비된 용액의 내독소 수치를 평가합니다.

수준이 밀리리터당 0.06 내독소 단위 미만인지 확인합니다. 다음으로 0.18ml의 초순수를 자기 교반 막대가 들어 있는 1.5ml 유리 바이알에 넣습니다. 교반 속도를 800RPM으로 설정한 다음 0.1ml의 1%덱스트란 설페이트를 넣고 2분 후에 저어줍니다.

SD F1 알파 0.08mg을 넣고 20분 동안 저어줍니다. 0.33ml의 0.1%타이젠을 적가하고 5분 동안 저어줍니다. 교반 속도를 최대로 변경하고 가스 밀폐 주사기로 0.1ml의 황산아연을 천천히 첨가합니다.

교반 속도를 800RPM으로 되돌리고 30분 동안 저어줍니다. 그런 다음 0.4ml의 15% 만니톨을 넣고 5분 후에 저어줍니다. 반응 혼합물을 1.5 밀리리터 퍼지 튜브와 원심분리기로 16, 000 Gs 및 섭씨 4도에서 10분 동안 옮깁니다.

원심분리 후 상층액을 흡인하고 피펫을 사용하여 마지막 액체 한 방울을 제거합니다. 0.2ml의 5%만니톨을 천천히 첨가하고 0.5ml의 29게이지 주사기로 펠릿을 현탁시킵니다. 그런 다음 원심분리 전에 5% 매니톨 1ml를 추가로 첨가합니다.

두 번째는 16, 000 GS에서 15분 동안 사용합니다. Resus 현탁액 원심분리 과정을 반복한 후 상등액을 흡입하고 펠릿을 0.2ml의 5%만니톨로 재현탁합니다. 입자 크기와 제타 전위는 각각 동적 광 산란과 전기 영동 광 산란에 의해 분석됩니다.

시작하려면 동적 광 산란을 통한 입자 크기 측정을 위한 매개변수가 포함된 SOP 목록에서 작업 절차를 선택합니다. 텍스트 프로토콜에 나열된 대로 SD F1 알파 입자 샘플을 물로 희석합니다. 그런 다음 100마이크로리터의 샘플을 Einor Q Vet과 같은 일회용 UV Q Vet에 로드합니다.

Q vet을 셀 홀더에 삽입하고 데이터 수집을 시작하기 전에 강도 조정이 최적에 도달할 때까지 기다립니다. 측정이 완료된 후 직경 및 폴리 분산도 지수의 적란 결과를 기록합니다. 4번의 반복 판독 각각에서 얻은 결과의 평균을 구하고 전기영동 광 산란을 통한 제타 전위 측정을 위한 표준 편차를 계산합니다.

500마이크로리터의 10배 희석된 입자 샘플을 플로우 셀(flow cell)에 로드합니다. 텍스트 프로토콜에 나열된 대로 측정을 위한 매개변수를 포함하는 Zeta 전위 SOP 목록에서 작동 절차를 선택합니다. 제타 전위의 결과를 기록합니다.

그런 다음 5개의 반복된 판독값 각각에서 얻은 결과의 평균을 구하고 표준 편차를 계산합니다. laly 샘플 버퍼에 있는 자유 및 입자 결합 SD F1 알파의 희석된 샘플을 섭씨 100도에서 10분 동안 가열합니다. 와류는 2 분 동안 실내 온도에 표본을 2 분 동안 냉각한 후에 입자를 완전하게 해리하기 위하여 표본 2 분 동안에 표본을 두번 두번 보았습니다, 분리기에는 10, 0.5에서 1 분 동안 000 Gs가 잘 섞기 위하여 물 응축수 와동을 다시 내려오는 것이 있었습니다.

이 시점에서 샘플 용액은 눈에 보이는 침전물이 없는 깨끗해야 합니다. 그런 다음 웰당 10마이크로리터의 샘플을 4-20%sodium ESAL sulfate 또는 SDS gel에 로드합니다. 겔을 kumasi blue 단백질 염색으로 염색하기 전에 200볼트에서 20분 동안 전기영동을 실행합니다.

분자 이미저 및 밀도 측정 분석 소프트웨어를 사용하여 SD F1 alpha의 단백질 밴드 밀도를 검사합니다. 자유 SDF 단일 알파 표준물질로 구성된 표준 곡선에 대해 입자 내 S DF 1 알파의 양을 계산하여 시험관 내 방출 분석을 수행하고, 칼슘 및 마그네슘이 없는 도코스 인산염 완충액 식염수 또는 DPBS를 1:1 비율로 혼합합니다. 입자 현탁액을 1.5ml 튜브에서 0.05ml 분취량으로 나눕니다.

샘플을 튜브 바닥에 로드합니다. 기포가 유입되거나 액체 표면을 방해하지 마십시오. 파라폼으로 튜브 상단을 밀봉합니다.

그런 다음 회전하는 마이크로 튜브 믹서에서 튜브를 섭씨 37도로 회전시킵니다. 지정된 시간에 튜브에서 부분 표본을 제거하고 즉시 원심분리 후 섭씨 4도에서 10분 동안 16, 000Gs로 샘플을 원심분리합니다. 상등액과 펠릿을 분리합니다.

그런 다음 펠릿을 0.05밀리리터의 DPBS로 재구성합니다. 모든 샘플을 채취한 후 SDS 겔의 상층액과 펠릿을 검사합니다. 이전과 마찬가지로 이 분석법은 S df의 화학주성 활성을 측정합니다.

S df의 알파 상호작용 1개, 수용체와 알파 1개의 상호작용은 세포가 SD F1 알파 구배를 향해 이동하도록 합니다. 먼저, 이동 버퍼가 있는 SD F1 알파 형태를 텍스트 프로토콜에 나열된 최종 농도로 3배 연속 희석하여 희석합니다. 0.6 ml의 희석된 SD F1 알파 용액을 24 웰 플레이트의 웰에 첨가하여 negative control을 생성합니다.

마이그레이션 버퍼에 대해서만 동일한 작업을 수행한 다음 입력 셀 제어를 위해 0.57ml의 마이그레이션 버퍼를 웰에 추가합니다. 플레이트를 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 transwell과 같은 투과성 세포 배양 삽입물을 하단 웰 위에 놓고 0.1ml의 저크 햇 세포를 트랜스웰 인서트에 로드합니다.

그런 다음 0.03밀리리터의 셀을 입력 셀 컨트롤에 직접 로드합니다. 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도의 플레이트를 2시간 동안 배양합니다. 배양 후 세포 배양 삽입물을 제거합니다.

아래쪽 웰로 이동한 세포를 4밀리리터 폴리스티렌 튜브로 옮깁니다. 유세포분석기로 마이그레이션된 세포를 계수합니다. 마지막으로, 음수 대조군의 숫자를 뺀 후 입력 셀 번호의 백분율로 마이그레이션을 계산합니다.

여기에 표시된 것은 SD F1 알파 덱스트란 황산염 오잔 입자 크기 측정의 분석입니다. CUMUL 결과는 입자의 유체역학적 직경이 671나노미터이고 폴리 분산도가 0.24임을 보여줍니다. 이 스크린샷은 SD F1 알파 DExT 가닥 황산염 오잔 입자의 제타 전위에 대한 5개의 반복 측정 중 하나를 보여줍니다.

제타 전위는 마이너스 24.7밀리볼트입니다. S df 1 알파 덱스트란 황산염 오잔 입자에서 S df 1 알파의 양은 SDS 젤 전기 이동법에 의해 추정된다. 여기에 표시된 것은 SD F1 알파 표준 덱스트란 황산염 카이잔 제어 나노 입자 및 SD F1 알파 덱스트란 황산염 카이잔 나노 입자 샘플이 로드된 쿠마시 염색 SDS 겔입니다.

표준 곡선은 SD F1 알파 표준 대역의 밀도 분석에서 구성되며, 표준 곡선에서 계산하면 SDF 1 알파 나노 입자 샘플의 S DF 1 알파 농도가 밀리리터당 0.03 밀리그램임을 나타냅니다. 나노 입자로부터 S DF 1 알파의 시험관 내 방출 속도를 결정하기 위해, 상층에서 방출 된 S DF 1 알파의 양과 펠릿 내 입자 결합 sdf 1 알파의 양을 SDS 겔의 kumasi 염색에 이어 세포 분석 분석에 의해 결정했다. 입자 결합 S DF 1 알파의 활성은 이동 분석에 의해 측정되고 여기에 표시된 바와 같이 자유 SDF 1 알파와 비교됩니다.

입자 결합 SDF 1 알파는 측정 된 모든 농도에서 자유 s DF 1 알파와 동일한 이동 범위를 유도했습니다. 이 절차를 시도하는 동안 글라이칸 단백질 입자의 제형이 변경될 수 있음을 기억하는 것이 중요합니다. 특정 응용 분야에 따라 다른 단백질을 통합할 수 있으며 다른 제형을 사용하여 입자 크기를 변경할 수 있습니다.

이 비디오가 나노 입자를 채취하기 위한 기본 기술과 통합된 SDF 원 알파의 기능 분석을 시연하기를 바랍니다.