인간과 마우스의 뇌실 주위 조직의 측면 심실 및 조직 학적 특성의 3D 모델링

다음 절차의 전반적인 목표는 심실 magaly의 원인과 결과에 대한 조사를 가능하게 하는 수단을 제공하고 뇌실 내 심실 시스템 건강과 중요한 장벽 및 여과 기능을 연구할 수 있는 기술을 강조하는 것입니다. 이는 마우스 뇌의 관상 절편 또는 인간 뇌의 MRI 스캔을 수집하여 심실의 3D 재구성을 생성하고 심실 부피를 계산하여 심실 부피를 계산함으로써 달성됩니다: 심실 정점 표면의 en foss 준비를 포함하는 사후 조직이 세포 특이적 항체로 염색되어 심실 내벽의 세포 무결성을 밝힙니다. 다음으로, 전체 심실 표면의 세포 조직에 대한 몽타주를 준비하고 심실의 3D 모델에 렌더링하여 신경교증 영역과 온전한 부속 세포를 보여줍니다.

결과는 심실의 종방향 3D 모델링을 기반으로 한 심실 확장 영역과 심실 내막의 부속 세포 층이 더 이상 손상되지 않고 신경교 반흔으로 대체된 영역을 보여줍니다. 3D 모델링 데이터를 면역조직화학 데이터와 결합하여, 심실 내막의 세포 구성에 대한 3D 영역별 지도를 생성할 수 있습니다. 이 기술의 의미는 뇌 손상, 알츠하이머병과 같은 신경 퇴행성 질환 및 정상적인 노화의 치료 또는 진단으로 확장되며, 이 모든 것은 일반적으로 일정 수준의 심실 확장을 보여 심실 표면 척추측만증 가능성을 보여줍니다.

마우스에서의 절차를 시연하는 것은 Richard Wolffer이며 우리 실험실의 학부생은 인간 MRI 데이터와 사후 인체 조직을 사용하여 수행 된 절차를 yeun이 시연합니다. 현재 의대생이며 연구실의 대학원생인 Rebecca Chu입니다. 프로토콜의 서면 부분에 설명된 대로 절편, 면역 염색 및 마우스 뇌를 장착하여 이미지화할 슬라이드를 준비합니다.절차를 시작하려면 마우스 측면 심실을 추적하기 위해 직립 형광 현미경과 컴퓨터를 켜고 현미경에는 자동 스테이지와 디지털 CCD 카메라가 장착되어 있어야 합니다.

형광 모드에서 매핑 소프트웨어를 실행하고, 디스플레이 옵션을 열어 추적에 필요한 도구 모음과 도킹 풀 패널을 로드합니다. 그런 다음 옵션을 클릭하고, 옵션 액세서리를 표시하고, 동일한 메뉴에서 기본 도구 모음과 마커 도구 모음을 선택합니다. Docking Pool Panels(도킹 풀 패널)에서 카메라 히스토그램(Camera Histogram), 다중 채널 제어(Multi-channel control), 카메라 설정(Camera Settings) 및 이미지 획득(Image Acquisition)을 선택합니다.

부속 세포를 표지하는 강력한 S 100 베타 형광을 기반으로 측심실을 포함하는 첫 번째 조직 조각을 식별합니다. 외측 심실 내벽. 왼쪽 반구와 오른쪽 반구의 방향을 절편하는 동안 만들어진 작은 절개를 식별하여 지정합니다.

이제 새 데이터 파일을 만들고 좌측 심실 위의 이미지 창을 클릭하여 스테이지 이동에 대한 참조 지점을 지정합니다. 이 참조점을 추적 파일 전체에서 외심실을 기준으로 일관된 위치에 유지합니다. 직렬 복원을 위해 윤곽을 가져올 때 도움이 되도록 윤곽 드롭다운 메뉴에서 적절한 사전 설정 윤곽 유형을 선택합니다.

좌측 및 우측 측심실 트레이싱(left and right lateral ventricle tracings) 각각에 대해 고유한 색상을 사용합니다. 이제 append lining의 전체 정점 표면을 따라 클릭하여 심실의 윤곽을 추적합니다. 화살표 키를 사용하여 추적 창을 이동합니다.

윤곽을 추적한 후 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 윤곽 닫기를 선택합니다. 다른 색상을 사용하여 우심실에 대한 추적을 반복합니다. 그런 다음 왼쪽의 마커 도구 모음에서 적절한 마커를 선택하고 3D 재구성을 위해 연속 윤곽을 정렬하는 데 도움이 되는 중간선을 따라 추적 화면에 마커를 클릭하여 놓습니다.

이 절차를 반복하여 두 번째 표시를 만듭니다. 파일 데이터 저장을 선택하여 조직 추적을 저장하고 새 폴더를 만들고 파일 이름 번호, 규칙 슬라이드 번호, 대시 조직 번호에 따라 추적을 생성하여 연속 섹션에서 추적을 쉽게 식별할 수 있습니다. 그런 다음 심실을 포함하는 모든 절편에 대해 방금 표시된 절차를 반복합니다.

외측심실 3D 재건을 수행합니다. 3D 재건 프로그램을 엽니다. 그런 다음 파일 열기를 클릭하고 첫 번째 추적 일련 섹션의 윤곽 파일을 선택합니다.

좌심실 및 우심실의 모든 윤곽 추적과 추가된 마커를 가져옵니다. 프로토콜의 서면 부분에 있는 지침에 따라 윤곽을 정렬합니다. 그런 다음 왼쪽 패널에서 모든 윤곽을 선택한 다음 3D 시각화 버튼을 클릭하여 최종 3D 재구성을 표시합니다.

이 이미지는 S 100 베타 면역 반응성 부속 세포로 윤곽이 그려진 외측 심실을 포함한 관상 마우스의 뇌 단면을 보여줍니다. 별표는 외측심실을 나타냅니다. 괄호는 접착력을 나타내고 눈금 막대는 500미크론을 나타냅니다.

마우스 측심실은 윤곽으로 추적되고 하위 세그먼트 섹션으로 배열됩니다. 뇌실 내 영역이 체적 분석을 방해하지 않도록 제거됩니다. 이 이미지는 외심실 윤곽의 최종 3D 재구성을 보여줍니다.

노란색은 외측심실을 포함하는 관심 영역에 걸쳐 있는 전체 뇌 부피의 윤곽을 나타냅니다. 코로나 절편 뇌 조직의 3D 심실 재구성을 만드는 방법을 잘 이해해야 합니다. 3D 이미지 재구성 및 측면 심실의 체적 정량화를 생성하고 종방향 오버레이 분석을 사용하여 시간 경과에 따른 체적 변화를 평가하기 위해 프로토콜이 나열되어 있으므로 MR의 일관성에 유의하는 것이 중요합니다. R 데이터 수집 및 획득 후 처리는 데이터 세트를 포함하기 위한 매우 중요한 기준입니다.심실 분할을 수행하기 위해 ITK SNAP을 사용하여 고해상도 T 1 가중치 MR 이미지에서 심실을 분할합니다. 프로그램을 시작한 후 회색조 이미지를 열고 원하는 파일을 선택한 다음 멋진 파일로 엽니다.

그런 다음 각 해부학적 평면을 스크롤하여 코 부위, 크거나 작은 측두부 뿔 또는 이와 유사한 것과 같은 심실 이상을 기록합니다. 다음으로 기본 도구 상자에서 snake, ROI tool을 클릭합니다. 그런 다음 3D를 분할하고 강도 영역 옵션을 선택합니다.

이제 사전 처리 이미지를 클릭하고 위를 선택하십시오. 슬라이딩 바를 사용하여 최대 강도를 기록합니다. 그런 다음 임계값을 최대 강도의 15%로 설정하고 이 값을 기록합니다.

이렇게 하면 ROI가 흰색으로 강조 표시됩니다. smoothness 매개변수를 10으로 설정합니다. 확인을 클릭합니다.

그리고 다음. 다음으로, 각 심실에 10-12개의 작은 크기의 2개의 거품을 추가합니다. 2개는 전방 전두뿔에, 7개는 외측심실체의 상면을 따라 균일한 간격으로 분포되어 있으며, 1개는 후두뿔에, 1개는 외측심실의 측두각에 있습니다.

그런 다음 매개변수를 선택하고 곡률력을 0.4로 설정합니다. 그런 다음 재생 기호를 클릭하여 활성 윤곽선 진화를 시작합니다. 이제 메쉬 업데이트를 클릭하여 표면을 시각화합니다.

그런 다음 자동 업데이트를 확인하십시오. 외측심실의 모든 영역이 관심 영역에 포함될 때 분할 과정을 중지합니다. 제3심실을 포함하지 마십시오.

마지막으로 마침을 클릭하고 세분화 결과를 멋진 파일 형식으로 저장합니다. 총 심실 부피를 얻으려면 segmentation, volume 및 statistics를 선택하여 설정된 색상 레이블을 사용하여 심실의 총 부피를 얻습니다. 이 부문에서는 mango 소프트웨어를 사용하여 종적 ROI를 오버레이하여 시간 경과에 따른 피험자 내 심실 용적의 변화를 정성적 및 정량적으로 보여줍니다.

소프트웨어를 연 후 열기를 클릭하고 파일을 열어 이전에 저장된 멋진 파일을로드합니다. 이미지 파일이 로드된 후 파일 로드 ROI를 클릭하고 기준선 ROI 시점의 ROI를 녹색으로 로드합니다. 파일 로드 ROI를 클릭하고 두 번째 ROI 시점을 빨간색으로 로드합니다.

파일 저장 ROI를 선택하여 세로 오버레이를 저장하고, 이제 화면에 표시된 규칙에 따라 각 이미지에 파일 이름을 할당합니다. 그런 다음 ITK 스냅을 엽니다. 그런 다음 세로 볼륨 데이터를 얻기 위해 이미지 결합 ROI 파일에서 세분화 로드를 선택하여 결합된 ROI를 그레이 스케일 이미지 로드 결합 ROI로 다시 열고 다음 세분화 볼륨 및 통계를 실행합니다.

라벨 1 빨간색은 팽창 볼륨과 같고 라벨 2 녹색은 협착 볼륨 라벨 3 파란색은 기본 볼륨과 같으며, 최대 6 주 동안 10 % 포르민에 고정 된 손상되지 않은 반구부터 시작하여 미세 수술 메스를 사용하는 큰 칼을 사용하여 전체 반구에 걸쳐 0.1 몰 PBS 슬라이스, 1.5cm 두께의 관상 절편으로 철저히 헹굽니다. 전체 측벽에 대해 하나의 연속적인 단면을 유지하면서 심실 벽을 1cm 깊이로 절개하고 필요에 따라 벽을 세분화하여 염색을 위한 적절한 크기의 단면을 만듭니다. 심실 벽의 반대편에 있는 부분을 잘 노치합니다.

superior inferior orientation을 식별하려면 immunohisto chemistry를 수행하고 서면 프로토콜에 따라 절편을 장착합니다. 해부 범위 아래에서 미세 수술 찌르기 칼로 핀을 사용하여 조직을 고정하고, 외측 심실 벽의 균일하게 얇은 부분을 만들고, 슬라이드에 페넴을 옆에 장착합니다.슬라이드가 완전히 건조되면 면역 형광 컨포칼 현미경으로 섹션을 검사합니다. 심실 표면의 이미징 초점면을 정점 부착 마커인 beta-catenin의 사용에 의해 결정되도록 설정합니다.

부속 세포의 접합 단백질. 그런 다음 뇌실 표면의 GFAP 염색에 따라 append cell coverage 및 surface astro gliosis의 영역을 묘사하여 전체 심실 표면을 문서화하고 몽타주합니다. 전체 표면의 겹치는 이미지를 사용하여 연속 이미지의 몽타주를 만듭니다.

Adobe Photoshop을 열고 파일 자동화 자동 이머지 대화형 레이아웃을 사용하여 오버레이할 이미지를 선택하고 필요한 경우 수동으로 조정합니다. 몽타주를 추적할 새 레이어를 만들어 그대로 만화 표현을 생성합니다. 세포 커버리지 또는 심실 표면 G 척추측만증에 의존하고, 모든 섹션을 컴파일하여 심실 벽의 지도를 재구성하고 MRI 재구성의 해당 영역에 연결합니다.

이것은 여기에서 인간 MR 이미지의 어셈블리입니다. 외측심실(lateral cortricle)은 빨간색으로 표시된 관심 영역으로 정의되었습니다. 여기에 표시된 3D 이미지 재구성을 통해 외측심실의 체적 정량화 및 정성적 시각화가 가능합니다.

이 이미지는 노인 환자의 종심실 확장 평가를 보여줍니다. 여러 지점에서 촬영한 종방향 MRI를 정렬하고 오버레이하여 시간 경과에 따른 피험자 내 심실 부피 확장을 시각화하고 정량화할 수 있습니다. 이 마지막 세 이미지는 인체 측심실 표면의 면역조직화학적 평가 및 지역 매핑을 보여줍니다. 여기.

베타 카틴(beta catine)과 염색(staining)으로 윤곽이 그려진 온전한 부속 세포(intact append cells) 영역은 별표로 표시된 조약돌 모양을 보여주며, GFAP 염색으로 윤곽이 그려진 심실 표면의 astro gliosis(astro gliosis) 영역에서 점선으로 구분됩니다. 연속 컨포칼 이미지는 지역 몽타주를 생성하기 위해 오버레이되고 Adobe Photoshop 또는 심실 표면의 세포 조직을 만화로 표현한 것을 사용하여 추적됩니다. 이 몽타주의 만화 이미지는 해당 MRI 기반 3D 심실 재구성에서 심실 표면에 매핑됩니다.

그림과 같이 녹색은 손상되지 않은 append와 gliosis의 빨간색 영역을 나타냅니다. 이 절차를 수행하는 동안 세포 무결성의 연속 재구성 및 매핑을 수행하기 위해 각 조직 샘플에 대한 주의 깊은 문서화를 유지하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라, 시간 경과에 따른 부위 특이적 확장에 관한 추가 질문에 답하기 위해 외측 심실의 하위 세분화와 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.