레이저 캡처 이외에 Microdissection - 개별 도파민 신경 세포의 분리 및 전체 복부 피개 영역의 데모

이 절차의 전반적인 목표는 슬라이드의 조직 섹션에서 도파민 뉴런을 분리하는 것입니다. 이것은 먼저 얼어붙은 복부 중뇌 조직을 양식화된 슬라이드 또는 펜 멤브레인 슬라이드로 절단하여 수행됩니다. 다음으로 도파민 뉴런은 빠른 형광 면역조직화학으로 표지됩니다.

그런 다음 조직을 탈수하여 레이저 캡처 현미경에 로드합니다. 그런 다음 표지된 도파민 뉴런을 적외선 레이저를 사용하여 LCM 캡에 부착하고 관심 RNA 또는 분자를 분리합니다. 결과는 레이저 캡처 현미경을 사용하여 정량적 PCR 측정을 위해 충분한 양과 품질의 RNA를 얻을 수 있음을 보여줍니다.

총체적 박리 또는 마이크로 펀치와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 개별 세포 집단이 고립되거나 매우 분리된 뇌 영역일 수 있다는 것입니다. RNA 분리 딥을 준비하기 위해 셀린 분취 슬라이드 또는 폴리에틸렌 메틸레이트 또는 펜 멤브레인 유리 슬라이드를 오염 제거 용액에 넣고 RNA가 없는 물을 사용하여 등급이 매겨진 일련의 RNA 유리 에탄올을 사용하여 슬라이드를 세 번 세척하고 슬라이드를 탈수한 다음 10미크론 두께의 조직 절편을 저온 유지 장치로 절단하여 30분 동안 진공 건조하고 준비된 RNA에 장착합니다. Free slides는 RNA 품질을 유지하기 위해 절편 중에 샘플을 동결 상태로 유지합니다.

다음으로 면역조직화학을 수행합니다. 소수성 펜을 사용하여 조직의 윤곽을 그리고 일대일 아세톤 메탄올 용액에서 건조시킵니다. 조직을 섭씨 영하 20도에서 10분 동안 고정하고 냉동실에서 조직을 꺼낸 후 100-200마이크로리터의 티로신 하이드록실라제 항체 NPBS와 10% 트리톤으로 섹션을 10분 동안 덮습니다.

그런 다음 Alexa Fluor 4 88로 레테르를 붙인 염소 반대 토끼 IgG의 100-200 마이크로리터로 섹션을 덮기 전에 슬라이드를 헹구기 위해 1%triton과 함께 PBS를 사용하여 5분 동안 잠복한 다음 PBS를 사용하여 슬라이드를 두 번 헹굽니다. 다음으로, 이 비디오의 앞부분에서 설명한 것처럼 각각 30초 동안 일련의 RNA가 없는 샘플을 탈수합니다. 자일렌에서 1분 1초 동안 배양하고 5분 동안 세척합니다.

LCM에 사용하기 직전에 슬라이드를 제거하고 자연 건조시키십시오. LCM 캡과 슬라이드를 로드하고 텍스트 프로토콜에 따라 LCM 시스템을 설정한 후 IR 레이저 캡처를 조정하고 강도를 조준합니다. 캡처 레이저 도구 모음에서 조직에서 떨어진 슬라이드 영역에 캡을 놓습니다.

활성화를 선택하고 레이저의 출력 펄스와 히트 수를 조정합니다. 캡이 티슈가 없는 슬라이드 부분 위에 있을 때 IR 레이저를 발사하고 레이저가 LCM 캡 멤브레인을 충분히 녹이는지 확인합니다. IR 레이저 강도를 조정한 후 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 캡처 레이저를 선택하여 클라인 준비 슬라이드의 개별 도파민 뉴런에서 LCM을 수행하기 위해 레이저를 조준합니다.

세포를 포획하기 위해 관심 영역으로 이동하여 cline prep side에서 개별 세포를 포획하는 것으로 시작합니다. 현미해부 도구 모음에서 LCM 탭을 선택한 다음 단일 점 아이콘을 선택합니다. 다음으로 현미경 도구 모음에서 셔터 탭을 사용하여 형광 필터와 명시야 사이를 전환하여 적절한 필터를 선택하고 대물렌즈 탭을 사용하여 배율을 변경합니다.

관심 셀이 라이브 비디오 창에 표시되면 관심 셀을 표시하는 데 사용되는 스폿 크기를 셀의 대략적인 크기로 조정합니다. 단일 포인트 아이콘을 선택한 다음 셀을 클릭하여 관심 있는 셀을 표시합니다. 세포가 현미해부 도구 모음에 표시되면 go cut and capture 탭을 선택하면 IR 레이저가 선택한 모든 표시된 세포에 자동으로 발사됩니다.

캡을 섹션에서 멀리 떨어뜨려 슬라이드의 열린 영역으로 이동하여 셀이 LCM 캡에 캡처되었는지 확인합니다. 조직 수집이 완료되면 캡을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 Move to and unload를 선택하여 캡을 이동하고, 면역조직화학을 위해 처리된 슬라이드를 가이드로 사용하여 펜 멤브레인의 조직에서 관심 영역을 선택합니다. micro dissection 도구 모음에서 cut and capture(절단 및 캡처) 탭을 선택한 다음 cut line(절단선) 탭을 선택하고 immunohistochemistry(면역조직화학)라고 표시된 슬라이드를 가이드로 사용하여 10 x objective(10 x 대물렌즈) 아래의 관심 영역을 간략하게 설명합니다.

앞에서 설명한 대로 IR 및 UV 레이저를 테스트, 발사 및 조준합니다. 이 비디오의 현저해부 도구 모음에서 go capture and cut 탭을 선택합니다. 그런 다음 조직에서 LCM 캡을 이동하여 조직이 섹션에서 제거되고 캡에 부착되었는지 확인합니다.

캡을 제거하기 위해 조직을 수집하는 작업이 완료되면 캡을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 이동을 선택한 다음 이 그림의 현미경 사진을 언로드하면 LCM이 IR 레이저 또는 IR 및 UV 레이저를 사용하여 개별 티로신 하이드록실라제 면역 반응성 도파민 뉴런을 분리할 수 있음을 보여줍니다. 제시된 절차는 18 S 피크에 비해 RRNA 28 S 피크의 높이가 상대적으로 감소한 것에서 알 수 있듯이 RNA 무결성을 보존하기 위해 최적화되었으며, 면역조직화학 후 무결성이 낮은 LCM 샘플에서 RNA 품질이 감소한 후 전체 뇌 RNA에 비해 아세톤 고정이 수행되었습니다. 식염수 준비 슬라이드에서 배쪽 청록색 영역의 도파민 뉴런으로부터 L-C-M-R-N-A를 통해 획득된 뉴런으로부터 얻은 RNA의 양을 측정하기 위해 마이크로리터당 총 17.3, 24.8 및 50.9 피코그램을 각각 5, 100 및 200 도파민 뉴런에서 분리하였다.

E RNA 품질을 측정하기 위해 QPCR을 사용하여 도파민 뉴런의 전체 뇌 RNA 및 RNA의 농도 범위를 역으로 전사하고 베타 액틴 유전자를 이러한 측정에서 측정했습니다 마이크로리터당 3점 55, 6, 0.82 및 20점 58피코그램의 농도를 각각 5, 100 및 200 도파민 뉴런에서 계산했습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 레이저 캡처 현미경을 사용하여 개별 도파민 뉴런을 분리하거나 도파민 뉴런 영역을 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.