현대 나이테 연구에서 기술적 인 관점 - Dendroecological 및 목재 해부학 적 도전을 극복하는 방법

다음 실험의 전반적인 목표는 잘 복제되고 해상도가 높은 목재를 생성하는 것입니다. 나무와 관목의 성장에 대한 시간 및 환경 요인의 영향을 연구하기 위한 해부학적 데이터 세트입니다. 이는 비뉴턴 유체를 사용하여 마이크로톰 절편 중에 식물 세포를 안정화함으로써 달성되며, 두 번째 단계로 샘플에 대한 상세한 현미경 분석을 수행할 수 있습니다.

미세 절편은 리그니화된 세포와 리그니화되지 않은 세포의 분화를 용이하게 하기 위해 이중 염색된 다음 샘플의 디지털 이미지를 촬영합니다. 궁극적으로 식물 성장에 대한 자동화된 세포 기반 분석 및 관련 시계열 분석을 수행하여 관심 있는 목재 해부학적 매개변수를 평가할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 샘플 점수를 보내는 것과 같은 기존 방법에 비해 우리의 기술을 사용하면 셀이 톱밥으로 채워지지 않아 이미지 분석을 위한 훨씬 명확한 품질의 샘플을 얻을 수 있습니다.

또한, 절단하는 동안 세포에 비뉴턴 유체를 추가하면 샘플을 파라핀에 삽입하는 시간 소모적인 기술을 피할 수 있습니다. 비디오에서 볼 수 있는 새로운 마이크로톰은 샹 덥스(Shang Dubs)와 취리히(Zurich)의 중앙 루 네티(Lu Netti)를 통합한 우리 실험실에서 개발되었습니다. 그들은 크고 조밀 한 표본을 절단 할 수있는 가이드의 높은 안정성으로 인해 두드러집니다.

나무 줄기의 핵심 샘플링을 위해. 나무 줄기의 성장하는 축에 수직으로 날카로운 증분 코어를 배치하여 시작합니다. 그런 다음 코어를 돌리고 추출기를 사용하여 트리에서 결과 코어 샘플을 제거합니다.

코어 표면에 부드러운 연필로 표시된 특정 ID로 코어에 레이블을 붙이고 모든 샘플이 수집되면 줄기의 반대쪽에서 절차를 반복합니다. 라벨이 부착된 코어를 적절한 용기에 보관하여 운송 중 손상되지 않도록 보호하십시오. 그런 다음 실험실로 돌아 오면 코어 샘플을 섬유 방향으로 장착하고 방수 목재 접착제로 나무지지 빔에 똑바로 세우고 마이크로 코어 샘플링을 위해 건조시킵니다.

먼저 필요에 따라 끌을 사용하여 껍질의 일부를 제거합니다. 그런 다음 방금 시연 된 줄기의 성장 축에 수직 인 특수 펀칭 장치를 놓고 망치를 사용하여 줄기의 물관부를 약 2cm 깊이로 관통합니다. 펀칭 장치를 돌려 도구 내부의 생성된 마이크로 코어를 파괴합니다.

그런 다음 스템에서 코어를 제거하고 라벨이 붙은 마이크로 원심분리기 튜브에 보관합니다. 코어 샘플의 평평한 표면을 절단하려면 먼저 전체 범위에 걸쳐 코어의 평면 표면을 절단하기 위해 새로 개발된 코어 마이크로톰의 코어 홀더에 관심 있는 증분 코어를 고정하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 코어가 코어 범위에 대한 볼 베어링 가이드에 고정된 블레이드에 약간 닿을 때까지 코어를 들어 올리고 블레이드를 당겨 코어 상단의 첫 번째 부분을 자릅니다.

그런 다음 칼을 코어 뒤로 밉니다. 샘플 홀더를 약 10미크론 들어 올리고 코어의 약 1/3이 될 때까지 절단 절차를 반복합니다. 직경이 줄어들어 연속적인 평탄한 표면이 생성됩니다.

샘플의 해부학적 구조에 대한 자세한 이미지 분석을 위해서는 다른 마이크로톰 유형으로 마이크로 절편을 준비해야 합니다. 먼저, 관심 있는 핵심 샘플을 마이크로톰의 마이크로톰 홀더에 고정합니다. 그런 다음 볼 베어링 안내에 따라 마이크로톰 블레이드를 배치하고 블레이드를 코어 위로 당깁니다.

블레이드를 뒤로 밀어 샘플을 20-30미크론 들어 올립니다. 그런 다음 칼날을 샘플 위로 당깁니다. 다시 말하지만, 샘플 상단에 연속적인 표면이 생성될 때까지 이 과정을 반복합니다.

이제 페인트 브러시를 사용하여 결과 표면을 옥수수 전분 용액으로 덮습니다. 그런 다음 샘플을 15미크론 들어 올리고 브러시 플랜지를 샘플 표면에 놓습니다. s를 향해 블레이드를 천천히 당깁니다.amp전체 섹션이 절단되었을 때 브러시 아래에서 얇은 절단을 시작하고 브러시를 사용하여 블레이드 표면의 섹션을 안내합니다.

다른 브러시와 물을 사용하여 블레이드에서 조직을 제거하고 유리 슬라이드에 올려 놓아 리그니파이드 구조와 비리그화 구조를 구별할 수 있도록 합니다. 피펫을 사용하여 글리세롤을 물로 씻어냅니다. 다음으로, 사프란 인과 아스트로 블루의 혼합물 몇 방울로 젖은 부분을 덮습니다.

5분 후 염료를 물로 씻어낸 다음 즉시 연속적인 에탄올 처리로 섹션을 탈수합니다. 탈수 에탄올 처리 후 100% xol에서 섹션을 반복적으로 헹굽니다. xol이 사라지자마자.

티슈를 100% 캐나다 발삼 한 방울과 커버 유리로 덮고 기포가 생기지 않도록 주의합니다. 그런 다음 생성된 마이크로 슬라이드를 두 개의 내열 플라스틱 스트립 사이에 놓고 금속판에 놓습니다. 슬라이드 위에 추를 올려 섹션을 평평하게 유지한 다음 슬라이드를 섭씨 60도의 오븐에 넣습니다.

12시간 후 슬라이드를 실온으로 식힌 다음 추와 플라스틱 스트립을 제거합니다. 마지막으로, 다양한 크기와 형태의 모든 종류의 샘플을 준비하기 전에 제시된 절편 및 염색 절차에 따라 면도날을 사용하여 슬라이드를 청소하고 용기 분석을 위한 코어 표면의 디지털 이미지를 생성하기 위해 특수 홀더를 사용합니다. 먼저, 방금 시연한 대로 코어 마이크로톰으로 코어 표면면을 절단하고 펠트 마커를 사용하여 생성된 표면을 검게 염색합니다.

염료가 마르면 흰색 분필로 심면을 문지른 다음 손가락으로 분필을 세포에 누릅니다. 잉여 분필을 제거한 다음 코어의 한쪽에서 시작하는 디지털 카메라가 장착된 양안 현미경의 스테이지에 코어를 놓습니다. 이제 전체 표면이 캡처될 때까지 약간 겹치는 이미지 시퀀스를 획득합니다.

그런 다음 단일 이미지를 함께 연결하여 코어 표면의 완전한 이미지를 만들고 마이크로 슬라이드에서 디지털 이미지를 만듭니다. 현미경 스테이지에 슬라이드를 놓고 분석할 구조에 적합한 배율을 선택합니다. 마지막으로, 코어 표면 샘플에 대해 방금 시연된 것처럼 청소된 마이크로 슬라이드에 장착된 섹션의 겹치는 이미지를 획득하고 이미지를 함께 연결하여 섹션의 하나의 완전한 이미지를 만듭니다.

열린 세포를 가질 수 있는 능력은 해부학적 dendro 생태 구조를 시계열 분석에 적용하기 위한 첫 번째 중요한 단계입니다. 침엽수의 초기 목재 또는 후기 목재 트랙치에 대한 보다 자세한 분석을 위해서는 여기에 고품질 미세 섹션이 필요합니다. 세포벽 파손과 같은 잠재적인 인공물은 피해야 합니다.

방금 시연된 옥수수 전분 용액과 같은 비뉴턴 유체를 샘플에 적용하면 세포 구조의 안정성을 지원할 수 있습니다. 마이크로 섹션을 사용하면 연간 순위를 보다 안전하게 결정할 수 있습니다. 이것은 자연적인 한계에서 자라는 침엽수의 경우 특히 그렇습니다.

여기에서 볼 수 있듯이 매우 좁은 고리는 빈번하지만 거시적으로 감지하기는 어렵습니다. 극단적인 경우, 고리는 하나 또는 두 개의 세포 행으로 구성되며, 이는 마이크로 단면을 사용할 때만 보일 수 있습니다. 고배율에서 이미지를 분석할 때 단일 세포를 볼 수 있습니다.

반자동 분석 소프트웨어를 사용하면 이미지 내에서 볼 수 있는 모든 고리에 대해 세포벽 두께와 같은 단일 매개변수의 변화를 결정할 수 있으며, 이는 확장된 시계열 분석의 필요성을 나타냅니다. 마이크로 단면을 이중 염색하면 리그니피케이션의 여러 단계를 시각화할 수 있습니다. 그런 다음 이 정보를 각 식생 기간의 환경 데이터와 연결하여 발달 후 보다 자세한 기후 성장 관계를 결정할 수 있습니다.

이 기술은 DRO 생태학 분야의 연구자들이 나무와 관목의 다양한 해부학적 매개변수를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 방법을 사용하면 큰 고품질 섹션을 제작하는 데 필요한 시간을 크게 줄일 수 있습니다. 이 절차를 수행하는 동안 흄 후드 아래에서 작업하고 장갑을 착용하는 것과 같은 예방 조치를 항상 취해야 합니다.

이 비디오를 시청한 후에는 시계열 분석을 지원하기 위해 해부학적 데이터 세트를 넣기 위해 잘 복제되고 해상도가 높은 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.