Name: 암 세포에 Invadopodia 및 견인 포스 시험 법에 대한 폴리 아크릴 아마이드 젤 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: 학습하세요 폴리아크릴아마이드 젤을 이용한 암 세포의 인바도포디아 활성 및 견인력 분석 방법을. 이 기법은 다양한 기계적 강성에서 암 세포의 침습성과 수축성을 연구하는 데 활용됩니다.

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PaaS를위한 유리 Coverslips는 1. 준비 <ol><li> 낮은 린트 물티슈 청소 12mm의 된 커버. </li><li> 불꽃 12mm 커버 슬립과 핀셋을 사용하여 분젠 버너 불꽃을 통해 전달하여 각 35mm의 유리 바닥 접시의 마이크로 웰의 14mm coverslip에. </li><li> 실온에서 5 분 동안 0.1 N NaOH를 200 μL로 마이크로 웰 치료. </li><li> 공기 대기음을 30 분 동안 마이크로 웰을 건조. </li><li> 흄 후드에서 실온에서 10 분 동안 3- 아미노 프로필 트리 메 톡시 실란의 50 내지 100 μL로 마이크로 웰 치료. 이 화학 물질은 플라스틱과 반응; 따라서, 유리 피펫을 사용하여 플라스틱 접시와의 접촉을 피하기 위해 마이크로 웰 완전히 채워지지 않는다. </li><li> 3 아미노 프로필 트리 메 톡시 실란이 명확해질 때까지 약 10 분 동안 초순수와 마이크로 웰을 세척 할 것. </li><li> 초순수 두 번 스퀴즈 병을 사용와 마이크로 웰을 씻어. </li><li> 초순수의 2 ml로 마이크로 웰을 세척10 분 동안 중간 속도 (~ 1 Hz로) 설정에 로커 t 실온. </li><li> 공기 대기음을 30 분 동안 마이크로 웰을 건조. </li><li> 30 분 동안 중간 속도 (~ 1 Hz로) 설정 로커에 실온에서 0.5 % 글루 타르 알데히드 용액 2 ㎖와 함께 마이크로 웰 치료. </li><li> 10 분 동안 중간 속도 (~ 1 Hz에서) 설정 로커에 실온에서 초순수 2 ㎖와 마이크로 웰을 세척 할 것. 30 분의 총 두 번 더 반복한다. </li><li> 30 분 동안 가파른 각도 (60 ° 이상)에서 건조 마이크로 웰. 참고 : 요리는 데시 케이 터 2 개월 동안 저장할 수 있습니다. </li></ol> Invadopodia 분석 실험을위한 PaaS를 2. 준비 <ol><li> 소프트 PAA (8 %의 아크릴 아미드 및 0.05 % BIS)의 1 ㎖의 용액의 경우, 40 % 아크릴 아미드 200 μL, 2 %의 BIS 25 μL, 및 초순수 574 μL (표 1)를 결합한다. </li><li> 하드 PAA (8 %의 아크릴 아미드 및 0.35 % BIS)의 1 ㎖의 용액의 경우, 40 %의 아크릴 아미드, 175 # 200 μL를 결합181; L ​​2 %의 BIS, 및 초순수 409 μL (표 1). </li><li> 강성 PAA (12 % 아크릴 아미드 및 0.60 % BIS)의 1 ㎖의 용액의 경우, 40 % 아크릴 아미드 300 μL, 2 % BIS 300 μL, 및 초순수 169 μL (표 1)를 결합한다. </li><li> 15 분 동안 용액을 탈기시킨다. 각각, 부드러운 하드, 단단한 PAA 솔루션에 초순수에 1 ㎎ / ㎖ 인간의 플라즈마 피브로넥틴의 200, 215, 230 μl를 추가합니다. 모든 용액의 경우, 10 ㎎ / ㎖ 아크릴산 N 히드 록시 숙신이 미드 (NHS) 에스테르 1 μL, 100 ㎎ / ㎖의 암모늄 퍼 설페이트 5 μL, 및 N, N, N &#39;, N&#39;- 테트라 메틸 에틸렌 디아민 (TEMED 2 μl를 추가 ; 표 1). 부드러운 피펫으로 혼합 및 솔루션에 거품을 만들지 마십시오. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> PAA (1 ml)에 </td><td> 40 % AA (μL) </td><td> 2 % (μL) </td><td> 초순수 물 (μL) </td><td> 1 ㎎ / ㎖ FN (μL) </td><td style="padding-left: 4px; padding-right: 4px;"> 10 ㎎ / ㎖ NHS 에스테르 (μL) </td><td style="padding-left: 4px; padding-right: 4px;"> 100 ㎎ / ㎖ APS (μL) </td><td> TEMED (μL) </td><td> 탄력있는 계수 (PA) </td></tr><tr><td> 부드러운 </td><td> (200) </td><td> (25) </td><td> (574) </td><td> (200) </td><td> (1) </td><td> (5) </td><td> 이 </td><td> 1,023 </td></tr><tr><td> 단단한 </td><td> (200) </td><td> (175) </td><td> (409) </td><td> (215) </td><td> (1) </td><td> (5) </td><td> 이 </td><td> 7307 </td></tr><tr><td> 엄격한 </td><td> (300) </td><td> (300) </td><td> 169 </td><td> (230) </td><td> (1) </td><td> (5) </td><td> 이 </td><td> 22692 </td></tr></tbody></table> 표 1 : 성분 voluMES 및 invadopodia 분석법에 사용 부드럽고 단단한 경질 PAAS 위해 탄성률 얻어진. AA = 아크릴 아미드, FN은 피브로넥틴, APS는과 황산 암모늄 =를 =. <ol start="5"><li> 각 마이크로 웰의 중심에 PAA 용액 8.48 μL 피펫. 참고 :이 볼륨은 이론적으로 두께 75 ㎛의 PAA를 산출한다. </li><li> 조심스럽게 핀셋을 사용하여 마이크로 웰의 물방울에에 12mm 커버 슬립의 골조면을 낮 춥니 다. </li><li> 샌드위치 PAA 솔루션은 15 ~ 30 분 동안 중합 할 수 있습니다. 남은 솔루션을 확인하여 중합을 확인합니다. </li><li> 각각의 접시에 1X PBS 2 ㎖를 추가하고 핀셋으로 12mm 된 커버를 제거합니다. 참고 : 10 배 PBS는 실험실에서 만들어 0.011 M KH 2 PO 4, 1.54 M의 NaCl, 0.056 M 나 2 HPO 4로 구성되어있다. </li><li> 5 분 동안 실온에서 1X PBS로 2 ㎖ 마이크로 웰을 세척한다. 15 분의 총 두 번 더 반복한다. </li></ol> 3. P견인 힘 분석 실험을위한 PaaS를 배상 <ol><li> 소프트 PAA (8 %의 아크릴 아미드 및 0.05 % BIS)의 1 ㎖의 용액의 경우, 40 % 아크릴 아미드 200 μL, 2 %의 BIS 25 μL, 및 초순수 566 μL (표 2)를 결합한다. </li><li> 하드 PAA (8 %의 아크릴 아미드 및 0.35 % BIS)의 1 ㎖의 용액의 경우, 40 % 아크릴 아미드 200 μL, 2 % BIS 175 μL, 및 초순수 401 μL (표 2)를 결합한다. </li><li> 강성 PAA (12 % 아크릴 아미드 및 0.60 % BIS)의 1 ㎖의 용액의 경우, 40 % 아크릴 아미드 300 μL, 2 % BIS 300 μL, 및 초순수 161 μL (표 2)를 결합한다. </li><li> 15 분 동안 용액을 탈기시킨다. 각각, 부드러운 하드, 단단한 PAA 솔루션 1 ㎎ / ㎖ 인간의 플라즈마 피브로넥틴의 200, 215, 230 μl를 추가합니다. 초음파 처리 30 초 200 nm의 적색 형광 마이크로 스피어 (605분의 580 나노 미터의 여기 / 방출)의 8 μL. 각 솔루션의 경우, 200 nm의 적색 형광 마이크로 스피어의 8 μl를 추가10 ㎎ / ㎖ 아크릴산 NHS 에스테르 1 μL, 100 ㎎ / ㎖의 암모늄 퍼 설페이트 5 μL, TEMED 및 (표 2)의 2 μL. 부드러운 피펫으로 혼합 및 솔루션에 거품을 만들지 마십시오. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td style="width:40px"> PAA (1 ml)에 </td><td> 40 % AA (μL) </td><td> 2 % BIS (μL) </td><td style="padding-left: 4px; padding-right: 4px;"> 초순수 물 (μL) </td><td> 1 ㎎ / ㎖ FN (μL) </td><td> 마이크로 분야 (μL) </td><td style="padding-left: 4px; padding-right: 4px;"> 10 ㎎ / ㎖ NHS 에스테르 (μL) </td><td style="padding-left: 4px; padding-right: 4px;"> 100 ㎎ / ㎖ APS (μL) </td><td> TEMED (μL) </td><td> 탄력있는 계수 (PA) </td></tr><tr><td> 부드러운 </td><td> (200) </td><td> (25) </td><td> (566) </td><td> (200) </td><td> 8 </td><td> (1) </td><td> (5) </td><td> 이 </td><td> 1,023 </td></tr><tr><td> 단단한 </td><td> (200) </td><td> (175) </td><td> (401) </td><td> (215) </td><td> 8 </td><td> (1) </td><td> (5) </td><td> 이 </td><td> 7307 </td></tr><tr><td> 엄격한 </td><td> (300) </td><td> (300) </td><td> (161) </td><td> (230) </td><td> 8 </td><td> (1) </td><td> (5) </td><td> 이 </td><td> 22692 </td></tr></tbody></table> 표 2 :. 성분 볼륨과 견인력 세이에 사용 부드럽고 단단한 경질 PAAS 위해 탄성률 얻어진 AA = 아크릴 아미드, FN은 피브로넥틴, APS는과 황산 암모늄 =를 =. <ol start="5"><li> 각 마이크로 웰의 중심에 PAA 용액 8.48 μL 피펫. 참고 :이 볼륨은 이론적으로 두께 75 ㎛의 PAA를 산출한다. </li><li> 조심스럽게 일의 골조 측면을 낮출핀셋을 사용하여 마이크로 웰의 물방울에에 전자 12mm coverslip에. </li><li> 샌드위치 PAA 솔루션은 15 ~ 30 분 동안 중합 할 수 있습니다. 남은 솔루션을 확인하여 중합을 확인합니다. </li><li> 각각의 접시에 1X PBS 2 ㎖를 추가하고 핀셋으로 12mm 된 커버를 제거합니다. </li><li> 5 분 동안 실온에서 1X PBS로 2 ㎖ 마이크로 웰을 세척한다. 15 분의 총 두 번 더 반복한다. </li></ol> Invadopodia 분석 실험을위한 ECM 4. 준비 <ol><li> 37 ° C에 젤라틴 용액 (1 % 젤라틴 1 % 자당)를 가열한다. </li><li> 45 °의 각도로 유리 바닥 요리를 진행할 때 마이크로 웰의 바닥으로부터 신중 흡 인물을 1 분 동안 젤라틴 용액 150 μL로 PAAS 치료. </li><li> 60 분 동안 건조를 최적화하기 위해 가파른 각도 (60 ° 이상)에서 마이크로 웰의 PAAS에 젤라틴의 나머지 얇은 층을 건조. </li><li> i에서 냉장 0.5 % 글루 타르 알데히드 용액 2 ㎖와 마이크로 웰 치료30 분 동안 실온에서 15 분 동안이어서 CE. </li><li> 5 분 1X PBS 2 ㎖와 마이크로 웰을 세척 할 것. 15 분의 총 두 번 더 반복한다. </li><li> 1 분 동안 수소화 붕소 나트륨 용액 2 ml로 마이크로 웰 치료. 조심스럽게 젤라틴의 표면에 형성하는 거품을 제거하기 위해 벤치에 요리를 누르십시오. </li><li> 대기음을 5 분 동안 1X PBS로 2 ㎖ 마이크로 웰을 씻어. 15 분의 총 두 번 더 반복한다. </li><li> 15 분 동안 4 ° C에서 175,000 XG에 50 μg의의 /의 1X PBS와 ml의 원심 분리기에 FITC 표지 인간의 플라즈마 피브로넥틴 솔루션을 희석. 시판 표시 피브로넥틴를 구입하거나 다음과 같이 레이블 : <ol><li> 투석 튜브의 보레이트 완충액 (170 mM의 나트륨 테트라 보레이트 40 mM의 염화나트륨)과 장소 10ml에 피브로넥틴 5mg을 녹인다. </li><li> 자기 교반기에 실온에서 용해 FITC 6 ㎎을 함유하는 보레이트 완충액 200㎖에 배관을 배치하여 피브로넥틴 레이블어둠 속에서 1.5 시간 동안 가장 낮은 설정에서 설정합니다. </li><li> 두 볼륨이 어두운 추운 방 (4 ° C)에서 3 일 동안 가장 낮은 설정으로 설정 자석 교반기에 1X PBS의 500 ml로 투석은 하루 변경됩니다. </li><li> (1 : 200) 희석 된 분취 량의 광학 농도에 기초하여 계산 FITC 표지 된 피브로넥틴 농도가 280 nm 내지 493 nm에서의 AS는 [OD 280 - (0.36 X OD 493)] / 1.4 배 (200)의 2 배의 희석 인자는 (있는 계정 ㎎ / ㎖ 단위로 얻어진 다음 단계에서 피브로넥틴 농축 글리세롤) 미국. </li><li> 4 ° C에서 하룻밤 어둡고 추운 방에서 가장 낮은 설정으로 설정 자석 교반기 50 % 글리세롤 용액에 하룻밤 투석.) </li></ol></li><li> 어둠 속에서 60 분 동안 실온에서 FITC 표지 된 피브로넥틴 용액 150 ㎕를 마이크로 웰과 치료. </li><li> 에서 유리 바닥 요리를 들고 때 조심스럽게 마이크로 웰의 바닥에서 FITC 표지 피브로넥틴 솔루션을 대기음45 ° 각도는 다음 멸균 어두운 세포 배양 후드에서 10 분 동안 실온에서 70 % 에탄올 용액으로 유리 바닥 접시를 채운다. 또한 유리 바닥 접시 뚜껑을 채우거나 70 % 에탄올에 배어 낮은 보풀 물티슈로 닦아. </li><li> 5 분 1X PBS로를 작성하여 바닥이 유리로 요리를 씻으십시오. 15 분 총 1X PBS 2 ㎖와 두 번 더 반복합니다. </li></ol> Invadopodia 시험 법 5. 준비 및 이미징 <ol><li> (1 DMEM 및 5 %의 낮은 단백질 혈청, 10 % 소 태아 혈청, 및 새롭게 추가 된 표피 성장 인자 20 ng를 / ㎖와 함께 RPMI 1640 1) 유리 바닥 마성 및 invadopodia 배지 2 ㎖로 25,000 암세포 추가 하룻밤 배양한다. </li><li> 대기음 세포를 고정을 20 분 동안 실온에서 어두운 곳에서 3.7 % 파라 포름 알데히드 용액 2 ㎖와 함께 마이크로 웰을 처리하고. </li><li> 1X PBS 2 ml의 두 빠른 세척 한 후, 방 템피에서 0.1 % 트리톤 X-100 용액 2 ml로 마이크로 웰을 치료5 분 동안 어둠 속에서 rature는 세포를 Permeabilize 하시려면합니다. </li><li> 1X PBS 2 ㎖로 세척 한 후 바로, 3 % 소 혈청 알부민이 60 분을 차단하는 세포에 대한 실온에서 어두운 곳에서 차단 용액으로 마이크로 웰을 치료. </li><li> 60 분 동안 실온에서 어두운 곳에서 차단 용액에서 : 마우스 항 cortactin 항체 (750 1) 150 μL와 마이크로 웰을 인큐베이션. </li><li> 5 분 1X PBS 2 ㎖와 마이크로 웰을 세척 할 것. 15 분의 총 두 번 더 반복한다. </li><li> (500 1) 및 546 팔로이 딘 (1 : 750) 60 분 동안 실온에서 어두운 곳에서 차단 용액에 150 ㎕의 염소 항 - 마우스 항체 633 마이크로 웰을 인큐베이션. </li><li> 5 분 1X PBS 2 ㎖와 마이크로 웰을 세척 할 것. 15 분의 총 두 번 더 반복한다. </li><li> 각각의 마이크로 웰을 작성하여 22 × 22 커버 슬립 커버하는 매체를 장착 여섯 방울을 추가합니다. </li><li> 이미지 cortactin과 액틴이 647분의 632 나노 미터의 여기 및 방출 필터를 사용하여 invadopodia을 확인하고570분의 556 nm의, 각각, 와이드 - 필드 도립 현미경 높은 NA, 40X 오일 침지 렌즈를 사용. 마찬가지로, 화상 피브로넥틴 518분의 492 nm 인 여기 및 방출 필터를 사용하여 ECM 분해 동정을 행 하였다. </li></ol> 6. 준비 및 견인 힘 분석 실험의 영상 <ol><li> 유리 바닥 요리에 invadopodia 매체의 2 ㎖에 15,000 암 세포를 추가하고 밤새 배양한다. </li><li> 유리 바닥 요리 대기음 매체와 같은 보조제 (5 % 낮은 단백질 혈청, 10 % 소 태아 혈청, 및 새롭게 추가 된 표피 성장 인자 20 ng를 / ㎖), 사전에, L-15 배지 2 ㎖로 대체 37 ° C에 -warmed. </li><li> 거꾸로 현미경 1 시간 동안 습도가 높은 37 ° C로 사전 평형에 환경 챔버의 유리 바닥 요리를 품어. </li><li> 휴대 전화 위치를 표시하기 위해 높은 NA, 자동화 단계와 넓은 필드 거꾸로 현미경에 40 배 렌즈를 사용하여 이미지의 네 세트를 가지고 : <ol><li> 에에 이미지 세포위상차 ( &quot;단계&quot;화상)을 사용하여 (P)의 PAAS. </li><li> PAAS 상단의 마이크로 스피어의 제 1 층까지 아래 셀 중심으로 약간의 645분의 560 nm의 여기 및 방사 필터를 사용하여 형광 이미지의 초점이 미세하게된다 (화상 &quot;스트레스&quot;). </li><li> 또한, (마커로서 미소 구체를 사용하여) PAAS의 바닥에 집중하고 ( &quot;바닥&quot;화상)을 화상. 주 :이 이미지의 목적은 대표 결과에 기재된 견인력 계산을위한 각 위치에서의 실제 두께 PAA 얻을 Z 위치를 기록하는 것이다. </li><li> 이러한 이미지가 여러 위치에서 획득 한 후, 부드럽게 세포를 제거하기 위해 10 % 트리톤-X 솔루션의 220 μL에 섞는다. 앞서 설명한 ( &quot;널 (null)&quot;이미지) 등의 각 위치에서 PaaS를 상단의 이미지 미소. </li></ol></li></ol>

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</ol>

이 작품은 상 수 K25CA143412에서 국립 보건원 (NIH)의 국립 암 연구소 (Parekh 씨)에 의해 지원되었다. 우리는 추가 지원이 이비인후과의 부서에서 제공 한 것을 인정하고 싶습니다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 대변하지 않습니다.

우리는 침습적 수축성 셀룰러 동작과 상관시킬 invadopodia 견인력 분석의 기초로서 사용될 수있다 PAAS을 제조하는 방법을 제시한다. PaaS를 오래 세포에 강성 효과를보고 견인력 18,24,27를 계산하는 데 사용되었지만,이 프로토콜은 매트릭스에 대한 응답으로 침략과 수축 세포 행동의 상관 관계를 같은 경직성와 PaaS를 기반으로 병렬 분석을 개발하는 최초 기계적 특성. 제대로 바닥이 유리로 요리 된 커버를 활성화하면 PaaS를 그들에 결합 떨어져 오지 않을 것을 보장한다. 우리가 다른 사람이 과거 4,12,28에 PAAS의 표면에 젤라틴을 바인딩 같은 술포 SANPAH 및 아크릴산 NHS 에스테르 시약에 의존 다하고 있지만, 이들 방법은 피브로넥틴 확실 균일 표면층을 생성하지 않았 음을 발견 . 실시 따라서, 피브로넥틴 아크릴산 NHS 에스테르를 사용하여 매립 PAAS 걸쳐 가교시켰다다른 그룹 (29, 30)에 의해. 그러나, 피브로넥틴의 농도 증가는, 경질...

종양 관련 ECM의 강성 액토 마이 오신의 수축성 1-3을 증가시켜 악성 동작을 운전에 중요한 요소로 확인되었습니다. 이 효과는 주로 유방암 세포로 입증되었지만, 매트릭스 강성 암의 다른 유형에 중요한 역할을 할 수 있음 종양 강성을 제안 암 4-8 다양한 유래의 세포의 침입 특성을 변경하는 것으로 밝혀졌다. 침습성 마이그레이션 중 가교 결합 조직을 관통하도록, 암세포는 국소 적 ECM 9 저하 테이나 지역화 invadopodia라고도 액틴 풍부한 접착제 돌출부들을 이용한다. Invadopodia 침략 세포의 특징으로 간주되며 암세포 침윤 및 전이 10,11에 연루되어있다. 이전 작업은 매트릭스 강성이 invadopodia 번호를 조절할 수있는 것으로 나타과 미오신 II 활동과 mechanosensitive 단백질 (12)를 통해 ECM 저하 4,12 관련 지을 수 있고 있습니다. 주어진종양 및 암 밀도 공격성 13,14 사이의 상관은, 이러한 결과는 암 세포 액토 마이 오신 수축력 통해 침윤 및 전이를 구동하는 강성 종양 조직에 응답 할 수있는 메커니즘을 제시한다. 시험관 ECM 강성 및 생체 조직 밀도가 암세포의 침습 1,15-17 행동을 조절하는 것으로 나타났다. 액토 마이 오신 수축력이 과정에서 중요하게 나타나는 반면, 전이성 용량이 증가하는 상관 관계 또는 수축력 6,18-20을 감소 여부에 현재 연구 충돌합니다. 또한, 이러한 힘이 직접 invadopodia 활성 여부 (21)를 매개 알려지지 않았다. 우리는 최근에 암 세포의 수축력이 매트릭스 강성에 의존했고, invadopodia 5 ECM 저하의 예측 것을 발견했다. 이러한 결과는 셀룰러 힘 invadopodia 교류를 매개하여 암의 진행에 중요한 역할을 할 수 있음을 시사종양 미세 환경의 기계적 특성에 대응 tivity. 암세포 (5)의 침입 및 수축 특성을 상관하기 위해, 우리는 이전에 의존 강성 invadopodia 4,12,22 활성을 조사하기 위해 사용 된 서로 다른 강성으로 PAAS 생성을위한 프로토콜을 개질. 화학적 PAAS 걸쳐 인간 혈장 피브로넥틴 가교함으로써, 하이드로 겔이 변형 된 세포는 모두 실험 5와 동일한 강성을 경험하도록 invadopodia 및 견인력 분석 모두에 대한 기준으로 이용 될 수있다. invadopodia 내 분석, 피브로넥틴 매트릭스 열화를 검출하기 PAAS에 포개어 ECM을 연결하기위한 젤라틴 천연 결합 도메인을 제공한다. 견인력 내 분석, 피브로넥틴 세포 견인력을 계산하는 데 사용되는 미세 변위를 검출하는 직접적인 세포 부착을위한 리간드를 제공한다. 우리가 하드, 소프트라는 것을이 Methods,정상 및 암 조직 (23)에 대해보고 기계적 특성의 범위에 걸쳐있는 파 5 1023, 7307 및 22692의, 유리 바닥 요리에 바인딩 및 탄성 계수, E가된다 엄격한 PAAS.

<table><tbody><tr><td>3-Aminopropyltrimethoxysilane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide (40%)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0140</td><td></td></tr><tr><td>아크릴산 NHS 에스테르</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8060</td><td>흄 후드에서 신선하게 준비 DMSO</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 phalloidin</td>에서 10mg/ml <td>Life Technologies</td><td>A22283</td>은 로다민 과황산 암모늄 Bio-Rad<td>도 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td></td><td>.</td><td>161-0700</td><td>1x PBS</td></tr><tr><td>Aqua Poly / Mount</td><td>Polysciences</td><td>18606</td>에서 신선한 10 % 용액을 준비하고 마이크로 웰 BIS (2 %)<td>를 채우기 위해 6 방울을 사용하십시오</td></tr> <tr><td></td><td>Bio-Rad</td><td>161-0142</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>RPI</td><td>A30075</td>는 <td>1x PBS에서 차단 용액을 위해 3 %를 만들고 4 &deg에 보관합니다. C</td></tr><tr><td>Coverslips (12 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-80</td><td></td></tr><tr><td>투석 튜빙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9777</td><td>15 - 30 분 동안 붕산염 완충액에서 사전 평형</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td>사용 invadopodia 매체</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>아크릴 산 NHS 에스테르 용액을 만드는 데 사용</td></tr><tr><td>표피 성장 인자</td><td>생명 </td><td>PHG0311</td>기술은 초순수로 70%<td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30070.03</td>을 <td>사용하여 invadopodia 매체</td></tr> 에<tr><td>탄올</td><td>PHARMCO-AAPER</td><td>E200</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>을 만드는 데 사용할 수 있습니다.전형적으로 PBS에 있는 1% 자당/1% 젤라틴 해결책의 10 ml를 만들고 4°C에 저장하십시오; C(젤라틴을 쉽게 녹이기 위해 PBS 예열)</td></tr><tr><td>유리 바닥 접시(35mm 커버슬립)</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-14-C</td><td>커버슬립은 코팅되지 않은</td></tr><tr><td>글루타르알데히드(25%)</td><td>Polysciences</td><td>01909 0.5</td><td>%염소</td></tr> <tr><td>안티 마우스 Alexa Fluor 633 항체</td><td>Life Technologies</td><td>A21050</td><td></td></tr><tr><td>인간 플라즈마 피브로넥틴</td><td>Life Technologies</td><td>33016-015</td><td>초순수 5ml를 넣어 1mg/ml를 만듭니다. 과도한 동결 및 해동 주기를 피하기 위한 사용에 따른 부피 분취</td></tr>량 <tr><td>KH2PO4</td><td>EMD Millipore</td><td>PX-1565-1</td><td>10x PBS 재고</td></tr><tr><td>마우스 항코르tactin 4F11 항체</td><td>EMD Millipore</td><td>05-180</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>EMD Millipore</td><td>SX-0720-1</td><td>10x PBS 재고 만들기 위해 사용</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>RPI</td><td>S23020</td>은 <td>10x PBS 스톡 및 붕산염 완충액</td></tr><tr><td>NaOH (1 N)</td>를 만드는 데 사용합니다.<td>Sigma-Aldrich</td><td>S2770</td>은 <td>초순수로 0.1 N</td></tr><tr><td>Nu-Serum (저단백질 혈청)</td>으로 희석합니다.<td>BD Biosciences</td><td>355500</td>은 <td>invadopodia 매체</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Acros</td><td>416785000</td>를 만드는 데 사용합니다.<td>전형적으로 1x PBS에 있는 10% 주식을 만들고, 증기 두건에서 준비하고, 파라포름알데히드를 쉽게 녹이기 위하여 그 후에 강한 HCl)PBS (메마른)를 가진 PH 7.4로 다시 가져오기 위하여 강한 HCl)</td></tr><tr><td>PBS (메마른)</td> <td>Cellgro</td><td>21-040-CV</td>를 <td>위한 사용 세포 배양</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Cellgro</td><td>10-040-CV</td><td>사용을 vadopodia 매체 나트륨</td></tr><tr><td>borohydride</td><td>시그마-알드리치</td><td>452882</td><td>증기 두건에서 신선한 1개 mg/ml 1x PBS에 있는</td></tr> 준비하기 위하여<tr><td>나트륨 메타 붕산염 사수화물</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>S0251</td><td>붕산염 완충액을 만드는 데 사용</td></tr><tr><td>설탕</td><td>RPI</td><td>S24060은</td><td>일반적으로 PBS에서 1 % 자당 / 1 % 젤라틴 용액 10ml를 만들고 4 °C에 보관합니다. C (젤라틴을 쉽게 녹이기 위하여 PBS를 예열하십시오)</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0800</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Alfa Aesar</td><td>A16046</td>은 <td>1x PBS에 10%의 재고를 만들고 견인력 분석에서 세포 제거를 위해 그대로 사용하거나 염색을 위해 1x PBS로 희석</td></tr></tbody></table>합니다.

암 세포에 invadopodia 및 견인 포스 시험 법에 대한 폴리 아크릴 아마이드 젤

Polyacrylamide Gels for Invadopodia and Traction Force Assays on Cancer Cells

리지드 종양 조직 강하게 암 세포 이동 및 침입 조절에 연루되어왔다. 가교 조직을 통해 침략 마이그레이션은 단백질 가수 분해 세포 외 기질 (ECM)을 저하 invadopodia라는 굴지의 풍부한 돌출부에 의해 촉진된다. Invadopodia 활성은 강성 신호 액토 마이 오신 수축력을 통하여 이러한 세포 내 구조를 조절할 수 있음을 시사 ECM 강성 암세포 수축력에 의존하는 것으로 밝혀졌다. 암세포의 침윤성 및 수축 특성은 서로 다른 강성의 폴리 아크릴 아마이드 젤 (PAAS)에 기초 invadopodia 및 견인력 세이를 이용하여 시험 관내에서 상관 될 수있다. 암세포의 침윤성 및 수축 특성은 서로 다른 강성의 폴리 아크릴 아마이드 젤 (PAAS)에 기초 invadopodia 및 견인력 세이를 이용하여 시험 관내에서 상관 될 수있다. 두 분석 사이에 변동이 존재하지만, 여기에 제시된 프로토콜 번째 PAAS를 만들기위한 방법을 제공한다AT는 두 분석에서 쉽게 사용될 사용자의 특정 생물학적 및 기술적 요구에 적응할 수있다.

invadopodia 분석에서, invadopodia은 전형적 전지 본체 내의 구조에 점 모양 cortactin 액틴과 같은 마커 (도 1)의 colocalization을함으로써 식별된다. 모두 적극적으로 저하 및 비 분해 invadopodia는 카운트 될 수 있으며, 이러한 구조는 FITC 표지 된 피브로넥틴 (도 1)에 형광 신호가없는, 검은 부분으로 colocalized 여부에 의해 구별된다. Invadopodia 수동 계산하고, 셀당 ECM 분해 수동 셀 내에 윤곽선이 검정색 영역을 임계 화에 의해 결정된다. 견인력 분석에서, 네 개의 이미지가 무대 위치 (그림 2)로 표시 한 각 세포의 위치에 캡처됩니다. 먼저, &quot;상&quot;및 이미지의 관심 대상의 모든 셀이 고려되고 &quot;스트레스&quot;. PAA의 &quot;바닥&quot;이미지는 하이드로 겔 두께를 계산...

종양 미세 환경에서 기계 강성이 invadopodia 활동을 증가시키고 수축력을 액토 마이 오신으로 악성 동작을 운전에 중요한 역할을한다. 사용하는 폴리 아크릴 아미드 겔 (PAAS)는, invadopodia 및 견인력 분석은 강성 매트릭스에 응답하여 암세포의 침윤 및 수축 특성을 연구하기 위해 이용 될 수있다.

암 세포에 Invadopodia 및 견인 포스 시험 법에 대한 폴리 아크릴 아마이드 젤

Rigid tumor tissues have been strongly implicated in regulating cancer cell migration and invasion. Invasive migration through cross-linked tissues is ...

이 절차의 전반적인 목표는 암세포의 침습성 및 수축 특성을 연구하기 위해 인베이더(invader), 포디아(podia) 및 견인력 분석(traction force assay) 모두에 사용할 수 있는 폴리아크릴아마이드 겔을 제작하는 것입니다. 이를 위해 먼저 폴리아크릴아마이드 겔이 유리에 잘 결합되도록 유리 블로섬 디쉬(glass blossom dishes)의 14 millimeter 커버 슬립을 활성화합니다. 그다음, 서로 다른 강성 또는 기계적 특성을 가진 겔을 얻기 위해 두 가지 분석 모두에 사용할 폴리아크릴아마이드 용액을 준비합니다.그 다음, 분해 여부를 감지하기 위해 형광 표지된 세포외 기질을 얇게 도포하여 침입 위족 분석법을 준비합니다. 마지막으로, 암세포를 파종하여 하룻밤 동안 배양한 후, 침입자 및 위족 플레이트를 고정 및 염색하고 견인력 플레이트의 살아있는 세포를 이미징합니다. 최종적으로 형광 현미경을 사용하여 침입자, 위족 및 세포외 기질의 분해 정도를 이미징합니다.견인력 계산을 위해 마이크로구체와 세포를 각각 이미징하는 데 형광 및 광시야 현미경이 사용되며, 본 실험 절차의 시연은 저희 실험실의 연구 보조원인 Rachel Jarrell이 맡아 진행하겠습니다. poly equi mite 겔 제작을 위한 유리 커버슬립을 준비합니다. 먼저 보풀 없는 와이프를 사용하여 12 mm 커버슬립을 닦아냅니다. 핀셋으로 12 mm 커버슬립과 14 mm 커버슬립이 들어 있는 35 mm 유리 바닥 디쉬를 잡고 분젠 버너 불꽃에 통과시켜 멸균합니다.마이크로웰에 0.1 N 수산화나트륨 200 µL를 넣고 실온에서 5분 동안 처리합니다. 그 다음, 마이크로웰의 액체를 흡입하여 제거하고 30분 동안 공기 중에서 건조시킵니다. 이어서 흄 후드 내에서 유리 피펫을 사용하여 3-아미노프로필트리메톡시실란(3-aminopropyltrimethoxysilane) 50~100 µL를 마이크로웰에 도포하고 실온에서 10분 동안 배양합니다.그 다음, 세 가지 아미노 프로필 트리메틸이 깨끗해질 때까지 초순수로 10분 동안 마이크로 웰을 세척합니다. 이후, 초순수가 담긴 세척병을 사용하여 마이크로 웰을 두 번 헹굽니다. 마이크로 웰에 초순수 2 mL를 넣고 상온에서 중간 속도로 설정한 로커(rocker) 위에 10분 동안 둡니다.그런 다음 마이크로웰의 액체를 흡입하여 제거하고 30분 동안 공기 건조시킵니다. 각 마이크로웰에 0.5% glu

polyacrylamide-gels-for-invadopodia-traction-force-assays-on-cancer

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 비디오에서는, 우리는 세포 배양에 적합 규격, 세포외 매트릭스 (ECM) 코팅 기판을 조작하는 데 사용되는 실험 기법을 설명하고, 견인 힘 현미경 의무가 있으며, 세포 행동 ECM의 강성의 영향을 관찰하는.

세포 수축을 Quantifying에 대한 불만 사항 매트릭스의 준비

우리는 invadopodia로 인한 매트릭스 저하를 시각화를위한 형광 젤라틴으로 코팅 현미경 coverslips를 생산을위한 원형 방법을 설명합니다. 사용 가능한 소프트웨어를 사용하여 전산 기술이 혼합 된 인구 내에 전체 미세 필드를 포함한 다세포 그룹에 대한 하나의 세포 매트릭스 proteolysis의 결과 수준을 정량화를 위해 제공됩니다.

단일 및 다세포 상황에서 Invadopodia로 인한 세포 외 기질 Proteolysis의 양적 측정

이 비디오는 견인력 현미경 분석에 대해 설명합니다. 이 분석은 형광 비드가 내장된 연질 탄성 하이드로겔에 존재하는 세포외 기질에서 인간 대장암 세포의 세포 견인을 측정합니다. 형광 비드의 결과 변위는 적절한 소프트웨어를 사용하여 측정됩니다.

견인 세포 분석 분석: ECM에서 암세포가 가하는 견인력을 정량화하는 방법

일반적으로 사용되는 체외에서 세포의 이동 및 침윤을 조사하기위한 고도의 접근 방법이 설명되어 있습니다. 첫 번째 방법은 세포 운동성을 측정하는 세포 상처 폐쇄 분석이다. 두 번째 방법은 화성과 세포의 침략적인 능력을 평가하는 트랜스 웰 마이그레이션 및 침입 분석이다.

체외 세포 이동 및 내습 분석 실험에서

본 연구실은 더 세포 기능에 티슈 강성 변조의 효과를 이해하는 DNA 가교 폴리 아크릴 아미드 하이드로 겔, 하이드로 겔 동적 시스템을 개발했다. 여기서, 우리는 이러한 하이드로 겔을 제조하기위한 회로도, 설명, 및 프로토콜을 제공한다.

DNA-가교 폴리 아크릴 아미드 하이드로 겔의 제조

외과적 결장 종양 및 정상 조직에서 일차 인간 세포를 추출하기 위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 그런 다음 분리된 세포를 세포외 기질 단백질에 의해 기능화되고 형광 마이크로비드가 내장된 부드럽고 탄력 있는 기질(폴리아크릴아미드 하이드로겔)에서 배양합니다. 견인 세포 분석은 세포 수축 응력을 평가하기 위해 수행됩니다.

수술 조직에서 기본 인간 대장 종양 세포의 분리 및 견인 세포 계측법 부드러운 탄성 기판에 직접 배양

여기에서는 멀티웰 플레이트 형식의 폴리아크릴아미드 겔을 빠르고 효율적이며 저렴하게 준비할 수 있는 방법에 대해 설명합니다. 이 방법은 특수 장비가 필요하지 않으며 모든 연구 실험실에서 쉽게 채택할 수 있습니다. 경직성 의존적 세포 반응을 이해하는 데 중점을 둔 연구에 특히 유용할 것입니다.

간단한 폴리 아크릴 아미드 기반 강성 의존 세포 반응의 연구를위한 멀티 웰 강성 분석

세포 분화를 모두 매트릭스 조성물과 기판의 재료 특성을 포함한 미세 환경 요인의 호스트에 의해 조절된다. 우리는 여기에 세포 분화 및 미세 환경 콘텍스트의 함수로서 생체 역학적 세포 기질 상호 작용 모두를 평가 견인력 현미경과 함께 세포의 마이크로 어레이를 이용하는 방법을 설명한다.

세포 분화 및 견인 힘의 상관 관계 분석을위한 높은 처리량 세포 마이크로 어레이 플랫폼

개발에 집단 세포 이동, 상처 치유, 그리고 암 전이 종종 성장 인자 또는 신호 분자의 그라데이션에 의해 유도. 여기에 설명된 견인 현미경과 미세 유체 시스템을 결합한 실험 시스템과 생화학 구이도하에서 집단 이동의 역학을 정량화하는 방법에 대한 데모입니다.

화학적 집단 이동을 위한 미세 유체와 통합된 견인 현미경 검사법

진급하려면 성장 콘이 외부 환경에 대한 견인력을 발휘해야 합니다. 견인력의 생성은 액틴 역학 및 클러치 커플링에 의존합니다. 본 연구는 성장 콘 발전을 위한 액틴 역학, 클러치 커플링 및 견인력을 분석하는 방법을 설명합니다.

액틴 다이내믹스, 클러치 커플링, 성장 콘 발전을 위한 견인력 분석

우리는 소프트 하이드로젤 상의 세포외 매트릭스 단백질의 도트 어레이의 단일 감산 패터닝 단계를 사용한 마이크로접촉 프린팅을 기반으로 세포 견인력을 측정하는 표준 방법에 대한 개선을 설명합니다. 이 방법은 세포 군집 모양을 제어하는 데 필수적인 섬 패턴을보다 간단하고 일관되게 제작할 수 있습니다.

마이크로패턴 견인 현미경을 위한 패턴 생성

학습하세요 폴리아크릴아마이드 젤을 이용한 암 세포의 인바도포디아 활성 및 견인력 분석 방법을. 이 기법은 다양한 기계적 강성에서 암 세포의 침습성과 수축성을 연구하는 데 활용됩니다.

암 세포에 Invadopodia 및 견인 포스 시험 법에 대한 폴리 아크릴 아마이드 젤

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