Name: 화학 유전자 상호 작용의 신속한 식별 사카로 미세스 세 레비 시아 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 13 s
Description: 배우세요 Saccharomyces cerevisiae를 이용한 화학 유전자 상호작용 식별 방법으로, 특정 화학물질에 민감한 돌연변이체를 선별하고 내성 유전자를 분석하는 비용 효율적인 기술입니다.

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CJN 실험실에서 연구 NSERC, 캐나다 암 협회 연구소 (CCSRI)와 캐나다 유방암 재단 (BC-유콘 지점)에서 운영 보조금 지원됩니다.

참고 :이 절차의 일반적인 작업은 그림 2에 설명되어 있습니다. 성장 억제 용량 1. 결정 <ol><li> 효모 하룻밤 문화의 준비 참고 :이 프로토콜에 사용되는 효모 추출물 - 펩톤 - 덱스 트로 오스 성장 미디어 (YEPD)는 표준 조리법 (13)이다. <ol><li> BY4741 (마타 HIS3 Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) YEPD 한천 접시에 세포 밖으로 행진 30 ° C 또는 볼 식민지 형성 할 때까지 48 시간 동안 배양한다. </li><li> 하나의 식민지로 무균 배양 용기에 YEPD 액체 매체의 5 mL를 접종하여 하룻밤 문화를 준비합니다. 연속 회전이나 진탕 30 ° C에서 밤새 품어. 문화는 일반적으로 아침 (~ 2 × 10 8 세포 / ㎖)에 의해 포화에 도달 할 것입니다. </li></ol></li><li> 고체 한천 매체 준비 다양한 화학 용량을 포함 <ol><li> 여러 주식을 준비화학 물질은 적당한 용매 100X 원하는 최종 농도에서 시험한다. 참고 : 유효 농도는 화학 물질에 따라 달라집니다, 그리고 경험적으로 결정해야합니다. 높은 mM의 낮은 μM에서, 즉, 그것은 처음에 폭 넓은 최종 농도 범위를 테스트하는 것이 좋습니다. </li><li> 화학 물질의 농도에서 각각 여러 멸균 배양 관에 분취 용융 YEPD 한천 3 ㎖를 시험한다. 55 ° C의 물을 욕조에 장소 응고에서 유지합니다. </li><li> 테스트 할 화학 물질의 농도를 각각 들어 12 웰 플레이트에 중복 우물의 각 쌍에 용융 미디어, 소용돌이에 섞어 2 ~ 3 초, 피펫 1 ml에 100 배 화합물의 30 μl를 추가합니다. 만 제어 차량을 포함해야합니다. 플레이트는 실온에서 하룻밤 설정할 수 있습니다. 여분의 미디어를 폐기하십시오. </li></ol></li><li> 확산 도금 세포 <ol><li> 1 단계로 하룻밤 성장 포화 효모 문화의 2 μL와 YEPD 액체 매체 10 ㎖를 접종.1.2. </li><li> 잘 희석 주당 효모 문화의 25 μL는, 멸균 유리 구슬 또는 막대를 사용하여 균일하게 확산하고 판은 불꽃에서 건조 할 수 있도록 접시입니다. 48 시간 동안 30 ° C에서 접시를 품어. </li><li> 접시에 효모의 성장 (식민지 모두 총 개수 및 크기)을 평가합니다. 화면을 수행하는보다 10 % -15 %의 성장을 저해하지 않는 화합물의 치사량 농도를 선택한다. </li></ol></li></ol> 2. 체계적인 화학 유전자 화면 <ol><li> 소스 플레이트의 삭제 돌연변이 배열의 유지 보수 (DMA) 및 준비 <ol><li> 글리세롤 주식에서 삭제 돌연변이 어레이를 구성에 대한 자세한 설명은 Baryshnikova 등. (14)을 참조하십시오. 삭제 돌연변이가 판 당 384 식민지의 밀도로 배열되고 나면, DMA는 4 ° C에서 몇 달 동안 저장할 수 있습니다. 각각의 콜로니로 성장하는 것을 방지하기 위해 필요한만큼의 G418 200 ㎍ / ml를 함유 YEPD 한천 복제다른. 주 : 복수 직렬 복제가 느린 성장 균주의 손실을 방지하고 억제 돌연변이 출현을 최소화하기 위해 피해야한다. 이 haploids으로 컬렉션을 유지하는 경우에 특히 관련이있다. </li><li> 로봇 시스템의 배열 미생물을 사용하여 모든 복제 도금 단계를 수행합니다. 또한, 수동 피닝 도구를 사용하여 식민지를 배열 조작 할 수 있습니다. 참고 : 효모 삭제 컬렉션 여러 상용 소스에서 haploids 및 diploids로 사용할 수 있으며 일반적으로 96 웰 플레이트에 글리세롤 주식으로 제공됩니다. </li></ol></li><li> 삭제 돌연변이의 배열을 응축 <ol><li> G418 200 ㎍ / ㎖의를 포함 YEPD 한천 미디어 250 ml의를 준비합니다. G418의 유효 농도는 다를 수 있으며, 각각의 많은 경험적으로 테스트해야합니다. </li><li> 접시 당 G418 200 ㎍ / ㎖의를 포함 YEPD 한천의 50 ㎖를 주입하여 다섯 YEPD 한천 플레이트를 준비합니다. 배열을 응축하기 전에이 일일를 수행하고 판을 실온에서 냉각 할 수 있도록erature 하룻밤 다음 평평한 표면에. 참고 : 4 판은 1536 - 변형 밀도에서 수집해야합니다, 다섯 번째 판은 추가로 부어있다. </li><li> 접시 당 384 식민지의 밀도로 돌연변이 삭제 컬렉션을 포함하는 16 개의 배양 접시를 제거하고 실온 (1 ~의 시간)에 올 수 있습니다. </li><li> 섬세한 작업을 닦아 사용하여 각 판의 덮개를 형성하고 응축을 닦으십시오. 물방울이 발생할 수 있습니다 그렇게하지 ​​않으면 배열과 배열 된 돌연변이 체의 교차 오염에 증착된다. </li><li> 미생물 배열 달아 로봇을 사용하여, 판 당 1,536 식민지 (4 페트리 접시)에 접시 당 384 콜로니 (16 페트리 접시)의 밀도에서 DMA를 응축. 플레이트 (1) 핀에서 1 차 식민지가 응축 된 배열의 1 열 1 행하기 때문에이 작업을 수행 판 (2)의 1 차 식민지는 1 열 2, 2, 1 열을 행하기 판 (3)의 1 차 식민지를 행 및합니다 판 (4)의 1 차 식민지는 2 행합니다2 열. </li><li> 하룻밤 30 ° C에서 통합 된 배열을 품어. </li><li> 소스 판에서 식민지의 균일 한 전송을 보장하기 위해 배열을 검사합니다. DMA가 제대로 (그림 4A)를 응축 된 보장하기 위해 가이드 역할을 의도적으로 배열에 포함 여러 빈 위치,있을 것이다. 주 :이 시험 화합물을 함유하는 매체 상 복제본 도금 소스 판 것이다. 단일 소스 복수 pinnings 판에 사용될 수있다. 또한 많은 로봇마다 전송되는 효모의 비슷한 번호를 확인합니다 상쇄 기능을해야합니다. </li></ol></li><li> 복제 플레이트 삭제 돌연변이 어레이 <ol><li> 제어 700 ㎖ (차량 만 해당) 및 실험 매체 (화학 물질 함유) 700 ml의를 준비합니다. 이 세중 분석 (조건 당 12 판, 플러스 두 엑스트라)을 수행하기위한 충분하다. </li><li> 시험 물질 또는 플레이트 당 컨트롤을 포함 YEPD 한천의 50 ㎖를 붓고. 플레이트 t 허용오 다음 평평한 표면에 하룻밤 실온에서 냉각. </li><li> 레플리카 플레이트에 로봇을 사용하여, 실험적으로 결정된 농도로 화학 물질을 함유하는 접시의 3 세트뿐만 아니라, 차량 제어를 함유하는 플레이트 상에 세 세트 DMA 접종. 24 ~ 48 시간 동안 실온에서 접시를 품어. </li></ol></li></ol> 3. 이미징 플레이트 및 데이터 분석 <ol><li> 인큐베이터에서 접시를 제거하고 실온 (1 ~의 시간) 이전 영상에 올 수 있습니다. 이 판을 이미징하는 동안 결로 현상을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 뚜껑을 제거하고 플랫 베드 스캐너에 얼굴을 아래로 배치하여 24 및 48 시간에서 이미지 플레이트. 적어도 300 dpi의 해상도로 이미지를 캡처합니다. 다르게는, 이미지를 캡처하는 디지털 카메라를 사용한다. 이렇게하면, 장소 플레이트는 어두운 배경에 닫 얼굴과 이미지에 뚜껑을 제거합니다. 주 : 판의 파일 형식 및 위치가 사용 정량 프로그램에 의존 할 것이다. </li&gt; <li> 정량 Balony 15 SGAtools (16), 및 ScreenMill (17) 등 여러 오픈 소스 프로그램 중 하나를 사용하여 배열을 식민지 크기 비교를 수행합니다. </li></ol> 화면의 4. 검증 참고 :이 단계에서 몇 가지 효모 삭제 돌연변이 관심있는 화학 물질 등의 과민 점수 것입니다. 이러한 화학 물질이 유전 적 상호 작용은 다음 두 가지 방법으로 확인해야합니다. 먼저 민감한 균주의 신원은 PCR에 의해 확인되어야한다. 둘째, 화학 감도는 독립적으로 득점해야합니다. 아래에 설명하는 변형 과민, 효모 생물학에서 일반적인 기술을 검증하기 위해 안보 분석을 수행하기위한 간단한 프로토콜입니다. <ol><li> 킬 밖으로 G418 200 ㎍ / ㎖의를 포함 YEPD 한천에 효모 삭제 컬렉션 (과민) 돌연변이를 원했다. 콜로니를 형성 할 때까지 30 ° C에서 품어. 프라이머에 따라 함께 진단 PCR에 의해 변형의 유전자형 확인제조업체의 프로토콜입니다. </li><li> 각 변형에 대한 YEPD 액 5 mL를 접종하고 회전이나 진탕 30 ° C에서 밤새 품어. </li><li> OD 600을 측정하고 멸균 dH보다 2 O 600 = 1 중독 각 균주를 희석 이들은 지금 정규화 된 효모 문화입니다. </li><li> 96- 웰 플레이트의 웰 A1로 정규화 야생형 효모 (BY4741) 100 ㎕ 배양 디스펜스. 우물 B1-H1에 최대 7 개의 추가 균주의 100 μl를 분배. </li><li> A6-H6를 통해 우물 A2-H2 멸균 dH보다 2 O의 90 μl를 분배하는 멀티 채널 피펫을 사용합니다. 마지막으로, 표준화 된 효모 배양 1:10 희석 시리즈를 준비합니다. 직렬 멀티 채널 피펫으로 열 2 열 1의 10 μl를 피펫 팅에 의해 시작, 6 희석이 이루어질 때까지 96 웰 플레이트에 걸쳐 계속 (즉, 10 0-10 -5). </li><li> 멀티 채널을 사용하여 그리드에 희석 효모 문화의 2-5 μl를 전송화학 및 차량 컨트롤을 포함 YEPD 고체 매체에 피펫. 24 ~ 48 시간 동안 적절한 온도에서 접시를 품어. </li><li> 판을 검사하고 (BY4741 컨트롤을 기준으로) 화학 물질을 선택 돌연변이의 감도를 비교합니다. 이미지 (24) 접시와 단계 3.2에서와 같이 48 시간. 참고 : 관련 유전자 온톨로지 또는 함수 여러 민감한 균주의 동정은 스크린의 유효성을 확신 적합하지만, 유전자의 야생형 카피를 함유하는 플라스미드 과민 결실 균주의 변환은 공식적 유전자 것을 설정하는 데 필요한 관심의 삭제 (그리고 숨겨진 두 번째 사이트 돌연변이) 약물 감도가 발생합니다. </li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

화학적 상호 작용 유전자 프로파일을 생성하기위한 방법이 여기에 설명했다. 방법은 간단하다 화학의 유무에 광범위한 유전자 결실 컬렉션 각 균주의 콜로니 크기를 비교하여, 화학적 내성 모독에 필요한 모든 유전자들은 식별된다. 민감한 균주의 결과 목록의 주석 농축 분석은 화학 물질의 작용 모드에 대한 통찰력을 제공하기 위해 사용될 수있다. 이 프로토콜은 효모 신진 위해 최적화되어 있지만, 이는 또한 다른 배열 된 E. 미생물 삭제 모음과 함께 사용하도록 적응 될 수있다 휴대 교란의 (26, 27)의 수백을 조사하기 위해 성공적으로 사용 된 대장균 게이오 컬렉션입니다. 효모 및 기타 생물 화학 - 유전 적 프로파일 링은 잘 확립되어있다. 이러한 연구의 대부분은 마이크로 어레이 분석 또는 높은 처리량 sequ 통해 결실 돌연변이 체를 풀링 재배 적 경쟁 분석법에 의존고유 한 유전자 바코드의 encing. 이 방법은 큰 화학 라이브러리...

유전 도구와 모델 생물 사카로 미세스 세 레비 시아에 이용 가능한 자원 일괄 유전자 네트워크 생물학적 시스템의 요구 사항을 이행하는 방법으로서 기능에 대한 새로운 통찰력을 제공 대규모 기능 유전체학 연구있게되었다. 이러한 도구의 초석은 효모 1, 2의 모든 열려있는 독서 프레임의 비 필수 유전자 결실의 완전한 세트의 공동 제작했다. 눈에 띄는 관찰 표준 실험실 조건에서 haploids로 성장하면 효모의 유전자 만 ~ 20 %가 생존에 필요한 것이 었습니다. 이것은 다른 생물학적 경로의 이용을 통해 게놈 섭동에 대하여 버퍼링 세포의 능력을 강조한다. 유전 개별적으로 가능한 있습니다 돌연변이하지만 조합에 치명적인는 연결 또는 수렴 병렬 생물학적 경로를 신호 및 생물학적 기능을 설명하는 유전자 상호 작용 네트워크를 형성한다. 조건부 TE의 발전과 함께필수 유전자의 mperature에 민감하고 hypomorphic 대립이 기술은 중요하지 않은 유전자 3,4의 연구에 국한되지 않았습니다. 이 개념은 유사한 세포 과정에 관여하는 유전자 (5)가 함께 클러스터링 방법을 설명하는 편견 유전자 상호 작용지도를 생산하는 게놈 규모로 적용되었습니다. 유전자 네트워크의 화학 교란 모방 유전자 결실 (그림 1) 6. 과민성위한 결실 균주의 고밀도 배열 대해 성장 저해 화합물을 조회하면 화학적 스트레스를 허용하는 데 필요한 유전자의리스트, 즉 화학적 상호 작용 유전자 프로파일을 식별한다. 유전 적 상호 작용과 마찬가지로, 화학 라이브러리의 대형 스크린은 액션 함께 클러스터 (7)의 모드를 갖는 화합물과 유사한 것으로 나타났다. 따라서, 화합물의 화학적 상호 작용 유전자 프로파일을 구축하여 작업의 모드는 LAR과 비교하여 추론 할 수있다GE의 규모의 합성 유전자 및 화학 유전자 상호 작용은 8,9 데이터 집합. 화합물의 점수가, 심문하고있는 큰 규모의 화학 유전 스크린, 바코드 경쟁 분석에 의해 수행되었다. 이 방법에서는, 삭제 균주의 풀링 된 컬렉션 화학 물질을 포함하는 미디어의 작은 볼륨에서 여러 세대에 한꺼번에 성장한다. 각 삭제 돌연변이가 고유 한 유전자 바코드를 품고 있기 때문에, 삭제 균주의 풀 내의 개별 돌연변이의 생존 / 성장은 마이크로 어레이 또는 높은 처리량 시퀀싱 (10)에 의해 추적됩니다. 생체 활성 화합물을 함유하는 고체 아가상에서 성장 물리적으로 배열 된 돌연변이 콜로니 크기를 모니터링하여 적응도를 추론하는 것은 화학적 상호 작용 11,12 유전자를 확인하는 효과적인 방법이다. 이 방식은 경쟁 기반 스크리닝에 비용 효율적인 대안을 제공하고, 화학 물질의 작은 라이브러리를 분석하기에 적합하다.여기에 설명 된 S.의 화학적 상호 작용 유전자의리스트를 생성하기위한 간단한 방법이다 생물학 조작 또는 인프라 분자에 의존하지 않는 cerevisiae의는. 그것은 단지 효모 삭제 수집, 로봇 또는 수동 피닝 장치 및 무료로 사용할 이미지 분석 소프트웨어가 필요합니다.

<table><tbody><tr><td>효모 추출물</td><td>BioBasic</td><td>G0961</td><td>YEPD 액체/고체 매체의 경우 1% 최종 농도에 추가(w/v)</td></tr><tr><td>티르톤 분말</td><td>BD Biosciences</td><td>211820</td><td>YEPD 액체/고체 매체의 경우 2% 최종 농도에 추가(w/v)</td></tr><tr><td>포도당</td><td>아나케미아</td><td>31096-380</td><td>YEPD 액체/고체 매체의 경우 2% 최종 농도(w/v) &#8212에 추가합니다. 오토클레이브하지 마십시오. 20% 원액을 준비하고, 여과 살균하고, 오토클레이빙 후 매체에 첨가합니다.</td></tr><tr><td>Agar A</td><td>Bio Basic</td><td>FB0010</td><td>YEPD 고체 매체 용 2 % 최종 농도 (w / v)</td></tr> <tr><td>G418</td><td>AG Scientific Inc.</td>에 추가<td>G-1033</td><td>200&nbsp; dH2O의 mg/ml 및 필터 살균.&nbsp;</td></tr><tr><td>12-웰 플레이트</td><td>Greiner Bio One</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 배양 튜브</td><td>Evergreen Scientific</td><td>222-2376-080</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 페트리 디쉬</td><td>VWR</td><td>25384-302</td><td></td></tr><tr><td>ROTOR HDA</td><td>싱어 인스트루먼트&nbsp;</td><td>ROT-001</td><td>고처리량 미생물 어레이 피닝 로봇</td></tr><tr><td>PLUSPLATE&copy; 페트리 디쉬</td><td>싱어 악기&nbsp;</td><td>PLU-001</td><td>200 접시</td></tr><tr><td>상자 384 Short-Pin RePad</td><td>싱어 악기&nbsp;</td><td>RP-MP-384</td><td>1,000 패드 상자</td></tr><tr><td>1536 짧은 핀 RePad</td><td>싱어 악기&nbsp;</td><td>RP-MP-1536</td><td>1,000 패드</td></tr><tr> 상자<td colspan="4">대체 고정 도구:</td></tr> <tr><td>완전 자동화된 Robtic 시스템</td><td>S& P 로봇 공학</td><td>http://www.sprobotics.com</td><td>여러 자동 식민지 처리 로비틱 및 상상 시스템을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>수동 고정 도구</td><td>V& P Scientific</td><td>http://www.vp-scientific.com</td><td>휴대용 복제 도구 및 액세서리.&nbsp;</td></tr></tbody></table>

화학 유전자 상호 작용의 신속한 식별<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

생리 활성 화학 물질의 작용 모드를 결정하는 학술, 제약의 넓은 범위에 관심, 산업 과학자이다. 사카로 미세스 세 레비 시아, 또는 신진 효모, 모델 진핵 생물이되는 ~ 6,000 유전자 삭제 돌연변이 hypomorphic 필수 유전자의 전체 모음 돌연변이 체는 시판되고있다. 이러한 돌연변이의 수집 체계적 화학 견딜 필요 유전자 화학적 상호 작용, 즉 유전자를 검출하는데 사용될 수있다. 이 정보는, 차례대로, 화합물의 작용 가능성 모드에보고한다. 여기에서 우리는 효모 신진 화학 - 유전자 상호 작용의 신속한 식별을위한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 액션의 잘 정의 된 메커니즘이 화학 요법 제 5- 플루오로 우라실 (5-FU)을 사용하는 방법을 보여준다. 우리의 결과는 핵 TRAMP가 엑소 및 DNA 복구 효소 이전 m과 일관성이 5-FU의 존재하에 증식에 필요한 RNA 보여기반 바 코딩 화학 유전 적 접근과 5-FU에 악영향을 모두 RNA 및 DNA 신진 대사에 영향을 미치는 것을 지식을 icroarray. 이러한 높은 처리량 스크린 필요한 검증 프로토콜은 또한 기술된다.

이 방법의 유효성으로서 우리는 위에서 설명한 프로토콜은 다음 화학 요법 제 5- 플루오로 우라실 (5-FU)의 대표적인 화학적 상호 작용 유전자 스크린을 수행 하였다. 5-FU는 티미 신타뿐만 아니라 DNA와 RNA 대사 (18)을 방해하는 것으로 알려져있다. 5-FU의 화학적 유전 적 상호 작용은 공부 잘하고 이질 동형 접합 삭제 컬렉션 8,19를 모두 사용하여 효모 바코드 마이크로 어레이 기술에 의해 조사되었다. 여기서 우리는 유사한 결과가 돌연변이 콜로니 크기의 정량 비교함으로써 얻어 질 수 있음을 보여준다. 그것은 수행 화면 비 필수 유전자의 결실 반수성 컬렉션을 이용하는 것을 유의해야한다. 이 유형의 스크린은 또한 필수 유전자 돌연변이의 포함을 허용 이배체 균주, 온도에 민감한 돌연변이 및 hypomorphic 대립 유전자를 사용하여 수행 될 수있다. 반수체 삭제 컬렉션을 활용 장점 중 하나는 약물 센스티브을 증가목표 경로의 성...

여기에서는 발아 효모에서 화학적-유전적 상호 작용을 정의하기 위한 비용 효율적인 방법을 제시합니다. 이 접근 방식은 효모 분자 생물학의 기본 기술을 기반으로 하며 중소 규모의 화학 물질 및 기타 매체 환경에 대한 기계론적 조사에 매우 적합합니다.

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

이 절차의 전반적인 목표는 효모 세포를 사용하여 관심 화학 물질이 표적으로 하는 생물학적 과정을 찾는 것입니다. 이는 먼저 효모에 대한 화학 물질의 용량 반응 프로파일을 결정함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 효모 유전자 녹아웃 균주의 완전한 컬렉션을 치사량 이하의 화학 물질과 대조판에서 성장시키는 것입니다.다음으로 화학 물질에 과민한 효모 돌연변이가 확인됩니다. 이 목록은 화학 물질을 내성을 갖기 위해 필요한 모든 유전자를 밝히기 위해 생물 정보학적으로 분석됩니다. 마지막 단계는 낮은 처리량으로 실험의 생물학적 복제를 수행하는 것입니다.이것은 발견된 모든 화학적 유전자 상호 작용을 검증합니다. 궁극적으로, 이 고처리량 화학적 유전자 스크리닝 방법은 어떤 유전자 산물과 생물학적 경로가 관심 화학 물질을 내성화하는 데 사용되는지 보여주는 데 사용됩니다. 액체 배양에서 바코드가 있는 돌연변이의 경쟁적 성장과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 분자 생물학 기술이 필요하지 않다는 것입니다.이 방법은 새로운 작은 분자가 진핵 세포의 성장을 어떻게 억제할 수 있는지와 같은 화학 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 먼저 A-Y-E-P-D 플레이트에 BY 4 7 4 1 세포를 줄무늬를 만들어 하룻밤 동안 효모 배양을 준비하고 섭씨 30도에서 48시간 동안 또는 눈에 보이는 콜로니가 형성될 때까지 배양합니다. 식민지가 준비되었을 때.단일 콜로니를 선택하고 멸균 용기에 5ml의 YEPD 액체 배지를 접종하여 하룻밤 동안 액체 배양을 준비합니다. 그런 다음 섭씨 30도에서 밤새 지속적인 회전 또는 흔들기로 배양합니다. 다음으로, 테스트 할 화학 물질의 다양한 용량을 포함하는 고체 한천 배지를 준비합니다.이 작업을 수행합니다. 먼저, 적절한 용매에서 최종 농도의 100배로 관심 화학 물질의 여러 원액을 준비합니다. 그런 다음 각 농도를 테스트할 경우 3ml의 용융된 YEPD 한천을 여러 개의 멸균 배양 튜브에 분취합니다.한천이 들어있는 튜브를 섭씨 55도의 수조에 넣어 한천의 응고를 방지합니다. 이제 13에서 테스트할 화학 물질의 각 농도에 대해 100 x 화합물을 용융 한천 텍스의 부분 표본으로 백색으로 방출하고 튜브를 2-3초 동안 혼합한 다음 각 튜브에서 1밀리리터를 12 월드 플레이트의 중복 웰에 피펫으로 넣어 플레이트를 실온에서 밤새 굳힐 수 있습니다. 다음 날, 10ml의 YEPD 액체 배지에 2마이크로리터의 포화 야간 효모 배양을 접종합니다.그런 다음 이 배양액 25마이크로리터를 12개의 고래 플레이트의 우물에 한천을 함유한 화학 물질에 피펫팅하고 멸균 유리 구슬 또는 멸균 막대를 사용하여 균일하게 펴 바릅니다. 접시를 불에서 건조시킨 다음 섭씨 30도에서 48시간 동안 접시를 배양합니다. 배양 시간이 경과한 후 우물에 있는 군체의 총 수와 크기를 평가합니다.10-15% 이상으로 성장을 억제하지 않는 화합물의 치사량 이하 농도를 확인하여 스크리닝에 사용합니다. G 4 18의 밀리리터당 200마이크로리터를 포함하는 16개의 YEPD 한천 플레이트에 복제하여 플레이트당 384 콜로니의 밀도로 결실 돌연변이 속도를 유지합니다. 3개월마다 미생물 배열 로봇 시스템 또는 수동 고정 도구를 사용합니다.필요할 때까지 플레이트를 섭씨 4도에서 보관하십시오. 그런 다음 동일한 농도의 G, 4, 18 또는 5개의 한천 플레이트로 250ml의 YEPD 한천 배지를 준비하고 평평하고 평평한 표면에서 실온에서 밤새 식힙니다. 섭씨 4도의 보관 장소에서 삭제 돌연변이 컬렉션이 포함된 플레이트를 제거하고 플레이트를 실온에 둡니다.섬세한 작업용 물티슈를 사용하여 각 플레이트의 뚜껑에 형성된 응결을 제거하여 물방울이 어레이에 침전되고 어레이 돌연변이의 교차 오염을 방지합니다. 미생물 배열 고정 로봇이 삭제 돌연변이 배열을 16개의 페트리 접시에 있는 플레이트당 384개의 콜로니 밀도에서 4개의 페트리 접시에 있는 플레이트당 1,536개의 콜로니로 압축하도록 합니다. 하룻밤 동안 섭씨 30도에서 어레이를 배양한 후 어레이를 검사하여 소스 플레이트에서 콜로니가 균일하게 이동하는지 확인합니다.어레이에 통합된 여러 개의 빈 위치가 있으며, 이는 삭제 돌연변이 어레이가 올바르게 압축되었다는 가이드 역할을 합니다. 이들은 관심 화합물을 포함하는 배지에 복제하는 데 사용되는 소스 플레이트가 됩니다. 단일 소스 플레이트를 여러 피닝에 사용할 수 있습니다.또한 많은 로봇에는 오프셋 기능이 있어 매번 비슷한 수의 효모가 전송되도록 합니다. 복제 플레이트 삭제 돌연변이 어레이 수리를 설정하려면 700ml의 제어 차량 전용 및 관심 화학 물질을 포함하는 실험용 YEPD 한천을 설정합니다. 이는 분석을 삼중으로 수행하기에 충분합니다.대조군과 실험용 한천을 사용하여 플레이트를 붓습니다. 각 플레이트에 50 밀리리터를 추가합니다. 로봇을 사용하여 접시를 평평하고 평평한 표면에서 밤새 실온에서 식히십시오.이중 돌연변이 어레이를 실험적으로 결정된 농도의 화학 물질이 포함된 플레이트 3세트에 접종하고 차량 제어 장치를 포함하는 플레이트를 재설정합니다. 벤치 탑의 플레이트를 실온에서 총 24-48시간 동안 배양합니다. 플레이트는 뚜껑을 제거하고 평판 스캐너에 앞면이 아래를 향하게 하여 24시간 및 48시간 동안 배양합니다.최소 300DPI의 해상도로 이미지를 캡처합니다. 또는 디지털 카메라를 사용하여 이미지를 캡처합니다. 이렇게 하면 플레이트를 어두운 배경에 위로 향하게 놓고 뚜껑을 제거하여 이미지를 만듭니다.그런 다음 ball SGA 도구 및 스크린 밀을 포함한 여러 오픈 소스 프로그램 중 하나를 사용하여 어레이 콜로니 크기의 정량화 및 비교를 수행합니다. 이 단계에서 여러 효모 결실 돌연변이체는 관심 화학 물질에 과민한 것으로 점수를 매겨 효모 결실 컬렉션에서 원하는 과민성 돌연변이를 YEPD로 줄무늬 제거합니다. G 4 18의 마이크로 리터 당 200 마이크로 그램을 포함하는 Ager는 군체가 형성 될 때까지 섭씨 30도에서 배양합니다.진단, PCR, 아겔 전기영동으로 균주의 유전자형을 확인한 후, 각 균주에 5ml의 YPD 액체를 접종하고 섭씨 30도에서 회전 또는 진탕으로 하룻밤 동안 배양합니다. 각 배양액의 OD 600을 측정하고 각 균주를 멸균 증류수에서 OD 600으로 희석합니다. 이것이 이제 정규화된 효모 배양입니다.다음으로, 4 7 4 1 효모 배양에 의해 정규화된 야생형 100 마이크로리터를 웰 A 96 웰 플레이트 중 하나에 분배하고, 최대 7개의 추가 균주 100 마이크로리터를 웰에 분배하고, B 1 내지 H 1 웰에 분배합니다. 다음으로, 90 마이크로 리터의 멸균 물을 우물에 분배합니다 (A 2에서 H 2에서 6에서 H 6). 마지막으로 정규화된 G 조각품의 1-10 희석 시리즈를 준비합니다.멀티채널 피펫으로 10마이크로리터의 컬럼 1에서 컬럼 2까지 연속으로 피펫팅하는 것으로 시작하고 6회 희석이 이루어질 때까지 96웰 플레이트를 가로질러 계속합니다. 그런 다음 멀티 채널 피펫을 사용하여 화학 물질 및 차량 제어 장치를 포함하는 고체 매체인 YEP D의 그리드에서 2-5마이크로리터의 희석된 효모 배양액을 측정합니다. 배양 후 24-48시간 동안 적절한 온도에서 플레이트를 배양합니다.플레이트를 검사하고 24시간 및 48시간에 BY 47 41 대조군 이미지 플레이트와 관련하여 선택한 돌연변이의 화학적 민감도를 비교합니다. 이전과 마찬가지로 다음 이미지는 화학 물질의 subin 억제 농도를 측정하는 절차의 결과를 보여줍니다. 첫 번째 이미지는 포화 BY 4 7 4 1 배양액을 1 내지 5, 000으로 희석하고 5 플루오로 우라실의 농도 증가에 도금한 것을 보여준다.10 마이크로몰 농도는 sub-in 억제 용량으로 선택됩니다. 이 이미지는 5개의 플루로 우라실을 포함하는 액체 배지에서 BY 4 7 41 세포의 성장 곡선을 보여줍니다. 4개의 세포에 대해 약 4배, 10을 3배로 증착하고, 5개의 플루오로우라실과 광학 밀도의 농도 증가를 22시간 동안 10분마다 측정하였다.다시 말하지만, 10 마이크로몰 용량이 subin 억제 용량임을 알 수 있습니다. 다음 이미지는 5개의 플루오로 우라실(fluoro uracil)의 화학적 유전학 녹색의 결과를 보여줍니다. 여기서, 오른쪽에는 10 micromolar five Fluor uracil을, 왼쪽에는 DMSO control을 포함하는 YPD 한천에 복제된 S sachar visier deletion 돌연변이 어레이가 표시되어 있습니다.이 그래프는 10 마이크로 몰에서 돌연변이의 상대적 성장 인 화학 유전학 녹색의 결과를 보여줍니다. DMSO 제어와 비교하여 5개의 Fluor uracil은 여기에서 광선 위치에 따라 정렬됩니다. 10 micromolar, 5 flora uracil에서 돌연변이의 상대적 성장은 DMSO 대조군과 비교하여 colony size ratio에 따라 정렬됩니다.0.8 미만의 비율 임계값이 두 그래프에 모두 표시됩니다. 이 최종 이미지는 세 가지 검증 분석의 결과를 보여줍니다. 여러 개의 분리된 돌연변이 균주의 연속 희석을 왼쪽의 DMSO 대조군, 중앙의 10마이크로몰, 5개의 플루오로 UIL, 오른쪽의 0.015% 메틸 메탄 설포네이트에서 성장시켰습니다.이 절차를 시도하는 동안 효모 탐지 분석 또는 효모 사체 해부와 같은 독립적인 방법론을 사용하여 결과를 검증하기 위해 deletion mutant array의 신뢰할 수 있는 복사본으로 작업하고 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 이 기술은 저분자 연구 분야의 과학자들이 발아 효모에서 시스템 수준 접근 방식을 사용하여 화합물의 작용 방식을 탐구할 수 있는 효율적인 수단을 제공합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 유전자 - 약물 및 유전자 - 환경 상호 작용을 이해하는 포괄적인 불편 게놈 - 와이드 스크린을 개발했습니다. 이러한 돌연변이 컬렉션을 검사 방법이 제공됩니다.

Barcoded 효모 게놈 라이브러리의 경쟁력 화면

체계적인 대규모 합성 유전자 (유전자 유전자 또는 epistasis) 상호 작용 화면은 유전 이중화 및 경로 간 대화를 탐험하는 데 사용할 수 있습니다. 여기, 우리는 높은 처리량 정량 합성 유전자 배열 검사 기술을 설명, eSGA 우리는 epistatic 관계를 elucidating과의 유전 적 상호 작용 네트워크를 탐험하기 위해 개발이...

에 박테리아 기능 네트워크 및 경로를 매핑<em&gt; 대장균</em&gt; 합성 유전자 배열을 사용하여

이 비디오에서는 표적 DNA와 상호 작용하는 여러 단백질을 검출하는 변형된 효모 단일 하이브리드 분석을 시연합니다. 형질전환된 효모 세포는 리포터 유전자의 상류에 있는 표적 DNA 염기서열을 포함합니다. 또한, 그들은 전사 인자 단백질을 발현합니다. 단백질이 복합체를 형성하고 표적 DNA에 결합할 때 리포터 유전자가 발현되고 효소로 검출될 수 있습니다.

이질체 단백질 복합체-DNA 상호작용을 검출하기 위한 Modified Yeast-One 하이브리드 분석

우리는 micrococcal nuclease (MNase) 융합 단백질로 게놈 전체 단백질 바인딩 사이트를 매핑하기위한 염색질 immunoprecipitation (ChIP) - 직교 방식 높은 처리량 시퀀싱 (ChEC - seq)와 결합 염색질 내생 절단을 설명합니다.

ChEC-seq와의 단백질 - DNA 상호 작용의 게놈 전체 매핑<em&gt; 사카로 마이 세스 세레 비시 애</em

선물이 분열에 간단한 억압 화면 프로토콜 효 모. 이 방법은 효율적, 돌연 무료이 고 단일 게놈 소재 시에 자주 발생 하는 돌연변이 대 한 선택적입니다.  프로토콜은 진압 완화 돌연변이 또는 약물에 의해 발생 하는 액체 문화에서 성장 결함 격리 적합 합니다.

분열 효 모 Schizosaccharomyces pombe 에 깊은 시퀀싱 지원, 자발적인 억압 화면

시퀀싱 (RH-seq)을 통한 상호 반심은 종 간의 특성 차이의 유전적 기초를 매핑하는 강력한 새로운 방법입니다. hemizygotes의 풀은 트랜스포종 돌연변이 발생에 의해 생성되고 그들의 체력은 높은 전반에 걸쳐 시퀀싱을 사용하여 경쟁적인 성장을 통해 추적됩니다. 결과 데이터의 분석은 특성의 근본적인 유전자를 찾아낸다.

게놈 전체 상호 Hemizygosity 분석을 통해 사카로 마이스 효모의 종 간의 열내성 차이의 유전 매핑

세균성 병원체는 중요한 생물학 프로세스를 표적으로 하는 호스트로 단백질을 은닉합니다. 세균성 이펙터 단백질에 의해 표적으로 한 호스트 통로를 확인하는 것은 분자 병인을 해결하는 열쇠입니다. 여기서, 독성 세균 이펙터 단백질에 의해 표적화된 숙주 경로를 해명하기 위해 변형된 효모 억제기 및 독성 스크린을 사용하는 방법이 기재되어 있다.

효모 독성 및 억제기 스크린을 사용하여 세균 효과 단백질에 의해 표적으로 한 호스트 통로의 확인

샤페론-샤페론과 샤페론 기판 상호 작용을 연구하기 위해, 우리는 온화한 돌연변이와 결합된 RNA 간섭을 사용하여 Caenorhabditis elegans에 있는 합성 상호 작용 스크린을 능력을 발휘하고 chaperones의 과잉 발현및 유기체 수준에서 조직 특정 단백질 기능 장애를 감시합니다.

조직별 샤페론 상호 작용을 위해 검사하기 위해 Caenorhabditis elegans를 사용

여기서는 크로스링커가 있는 글리세롤 그라데이션 원심분리인 그라픽스(Gradient Fixation)의 활용을 설명하여 쌍향적인 복합체에 일시적으로 결합하는 접합 요인 간의 상호 작용을 식별합니다.

사카로미세스 세레비시아스 스플리케소터 서브콤플렉스의 과도성 행위자 검출을 위한 그라픽스의 활용

이 연구는 Schizosaccharomyces pombe에서 다중 복제 억제 유전자 스크리닝을위한 프로토콜을 설명합니다. 이 스크린은 게놈 전체 플라스미드 라이브러리를 사용하여 질의 돌연변이 균주와 관련된 기능 상실 표현형의 억제인자 클론(들)을 식별합니다. ell1 null 돌연변이체의 신규한 유전자 억제인자를 이 스크린을 사용하여 확인하였다.

Schizosaccharomyces pombe에서 다중 복제 억제 인자의 식별을위한 유전자 스크리닝

D-루프 포획(DLC) 및 D-루프 확장(DLE) 분석은 정량적 PCR과 함께 근접 결찰 원리를 활용하여 사카로마이세스 세레비시아에서 유도성 이중 가닥 절단 부위에서 D-루프 형성, D-루프 확장 및 생성물 형성을 정량화합니다.

사카로마이세스 세레비시아에서 근접 결찰 및 정량적 PCR을 통한 상동 재조합 중간체의 검출

배우세요 Saccharomyces cerevisiae를 이용한 화학 유전자 상호작용 식별 방법으로, 특정 화학물질에 민감한 돌연변이체를 선별하고 내성 유전자를 분석하는 비용 효율적인 기술입니다.

화학 유전자 상호 작용의 신속한 식별

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