화학 유전자 상호 작용의 신속한 식별 사카로 미세스 세 레비 시아

이 절차의 전반적인 목표는 효모 세포를 사용하여 관심 화학 물질이 표적으로 하는 생물학적 과정을 찾는 것입니다. 이는 먼저 효모에 대한 화학 물질의 용량 반응 프로파일을 결정함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 효모 유전자 녹아웃 균주의 완전한 컬렉션을 치사량 이하의 화학 물질과 대조판에서 성장

다음으로 화학 물질에 과민한 효모 돌연변이가 확인됩니다. 이 목록은 화학 물질을 내성을 갖기 위해 필요한 모든 유전자를 밝히기 위해 생물 정보학적으로 분석됩니다. 마지막 단계는 낮은 처리량으로 실험의 생물학적 복제를 수행하는 것입니다.

이것은 발견된 모든 화학적 유전자 상호 작용을 검증합니다. 궁극적으로, 이 고처리량 화학적 유전자 스크리닝 방법은 어떤 유전자 산물과 생물학적 경로가 관심 화학 물질을 내성화하는 데 사용되는지 보여주는 데 사용됩니다. 액체 배양에서 바코드가 있는 돌연변이의 경쟁적 성장과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 분자 생물학 기술이 필요하지 않다는 것입니다.

이 방법은 새로운 작은 분자가 진핵 세포의 성장을 어떻게 억제할 수 있는지와 같은 화학 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 먼저 A-Y-E-P-D 플레이트에 BY 4 7 4 1 세포를 줄무늬를 만들어 하룻밤 동안 효모 배양을 준비하고 섭씨 30도에서 48시간 동안 또는 눈에 보이는 콜로니가 형성될 때까지 배양합니다. 식민지가 준비되었을 때.

단일 콜로니를 선택하고 멸균 용기에 5ml의 YEPD 액체 배지를 접종하여 하룻밤 동안 액체 배양을 준비합니다. 그런 다음 섭씨 30도에서 밤새 지속적인 회전 또는 흔들기로 배양합니다. 다음으로, 테스트 할 화학 물질의 다양한 용량을 포함하는 고체 한천 배지를 준비합니다.

이 작업을 수행합니다. 먼저, 적절한 용매에서 최종 농도의 100배로 관심 화학 물질의 여러 원액을 준비합니다. 그런 다음 각 농도를 테스트할 경우 3ml의 용융된 YEPD 한천을 여러 개의 멸균 배양 튜브에 분취합니다.

한천이 들어있는 튜브를 섭씨 55도의 수조에 넣어 한천의 응고를 방지합니다. 이제 13에서 테스트할 화학 물질의 각 농도에 대해 100 x 화합물을 용융 한천 텍스의 부분 표본으로 백색으로 방출하고 튜브를 2-3초 동안 혼합한 다음 각 튜브에서 1밀리리터를 12 월드 플레이트의 중복 웰에 피펫으로 넣어 플레이트를 실온에서 밤새 굳힐 수 있습니다. 다음 날, 10ml의 YEPD 액체 배지에 2마이크로리터의 포화 야간 효모 배양을 접종합니다.

그런 다음 이 배양액 25마이크로리터를 12개의 고래 플레이트의 우물에 한천을 함유한 화학 물질에 피펫팅하고 멸균 유리 구슬 또는 멸균 막대를 사용하여 균일하게 펴 바릅니다. 접시를 불에서 건조시킨 다음 섭씨 30도에서 48시간 동안 접시를 배양합니다. 배양 시간이 경과한 후 우물에 있는 군체의 총 수와 크기를 평가합니다.

10-15% 이상으로 성장을 억제하지 않는 화합물의 치사량 이하 농도를 확인하여 스크리닝에 사용합니다. G 4 18의 밀리리터당 200마이크로리터를 포함하는 16개의 YEPD 한천 플레이트에 복제하여 플레이트당 384 콜로니의 밀도로 결실 돌연변이 속도를 유지합니다. 3개월마다 미생물 배열 로봇 시스템 또는 수동 고정 도구를 사용합니다.

필요할 때까지 플레이트를 섭씨 4도에서 보관하십시오. 그런 다음 동일한 농도의 G, 4, 18 또는 5개의 한천 플레이트로 250ml의 YEPD 한천 배지를 준비하고 평평하고 평평한 표면에서 실온에서 밤새 식힙니다. 섭씨 4도의 보관 장소에서 삭제 돌연변이 컬렉션이 포함된 플레이트를 제거하고 플레이트를 실온에 둡니다.

섬세한 작업용 물티슈를 사용하여 각 플레이트의 뚜껑에 형성된 응결을 제거하여 물방울이 어레이에 침전되고 어레이 돌연변이의 교차 오염을 방지합니다. 미생물 배열 고정 로봇이 삭제 돌연변이 배열을 16개의 페트리 접시에 있는 플레이트당 384개의 콜로니 밀도에서 4개의 페트리 접시에 있는 플레이트당 1,536개의 콜로니로 압축하도록 합니다. 하룻밤 동안 섭씨 30도에서 어레이를 배양한 후 어레이를 검사하여 소스 플레이트에서 콜로니가 균일하게 이동하는지 확인합니다.

어레이에 통합된 여러 개의 빈 위치가 있으며, 이는 삭제 돌연변이 어레이가 올바르게 압축되었다는 가이드 역할을 합니다. 이들은 관심 화합물을 포함하는 배지에 복제하는 데 사용되는 소스 플레이트가 됩니다. 단일 소스 플레이트를 여러 피닝에 사용할 수 있습니다.

또한 많은 로봇에는 오프셋 기능이 있어 매번 비슷한 수의 효모가 전송되도록 합니다. 복제 플레이트 삭제 돌연변이 어레이 수리를 설정하려면 700ml의 제어 차량 전용 및 관심 화학 물질을 포함하는 실험용 YEPD 한천을 설정합니다. 이는 분석을 삼중으로 수행하기에 충분합니다.

대조군과 실험용 한천을 사용하여 플레이트를 붓습니다. 각 플레이트에 50 밀리리터를 추가합니다. 로봇을 사용하여 접시를 평평하고 평평한 표면에서 밤새 실온에서 식히십시오.

이중 돌연변이 어레이를 실험적으로 결정된 농도의 화학 물질이 포함된 플레이트 3세트에 접종하고 차량 제어 장치를 포함하는 플레이트를 재설정합니다. 벤치 탑의 플레이트를 실온에서 총 24-48시간 동안 배양합니다. 플레이트는 뚜껑을 제거하고 평판 스캐너에 앞면이 아래를 향하게 하여 24시간 및 48시간 동안 배양합니다.

최소 300DPI의 해상도로 이미지를 캡처합니다. 또는 디지털 카메라를 사용하여 이미지를 캡처합니다. 이렇게 하면 플레이트를 어두운 배경에 위로 향하게 놓고 뚜껑을 제거하여 이미지를 만듭니다.

그런 다음 ball SGA 도구 및 스크린 밀을 포함한 여러 오픈 소스 프로그램 중 하나를 사용하여 어레이 콜로니 크기의 정량화 및 비교를 수행합니다. 이 단계에서 여러 효모 결실 돌연변이체는 관심 화학 물질에 과민한 것으로 점수를 매겨 효모 결실 컬렉션에서 원하는 과민성 돌연변이를 YEPD로 줄무늬 제거합니다. G 4 18의 마이크로 리터 당 200 마이크로 그램을 포함하는 Ager는 군체가 형성 될 때까지 섭씨 30도에서 배양합니다.

진단, PCR, 아겔 전기영동으로 균주의 유전자형을 확인한 후, 각 균주에 5ml의 YPD 액체를 접종하고 섭씨 30도에서 회전 또는 진탕으로 하룻밤 동안 배양합니다. 각 배양액의 OD 600을 측정하고 각 균주를 멸균 증류수에서 OD 600으로 희석합니다. 이것이 이제 정규화된 효모 배양입니다.

다음으로, 4 7 4 1 효모 배양에 의해 정규화된 야생형 100 마이크로리터를 웰 A 96 웰 플레이트 중 하나에 분배하고, 최대 7개의 추가 균주 100 마이크로리터를 웰에 분배하고, B 1 내지 H 1 웰에 분배합니다. 다음으로, 90 마이크로 리터의 멸균 물을 우물에 분배합니다 (A 2에서 H 2에서 6에서 H 6). 마지막으로 정규화된 G 조각품의 1-10 희석 시리즈를 준비합니다.

멀티채널 피펫으로 10마이크로리터의 컬럼 1에서 컬럼 2까지 연속으로 피펫팅하는 것으로 시작하고 6회 희석이 이루어질 때까지 96웰 플레이트를 가로질러 계속합니다. 그런 다음 멀티 채널 피펫을 사용하여 화학 물질 및 차량 제어 장치를 포함하는 고체 매체인 YEP D의 그리드에서 2-5마이크로리터의 희석된 효모 배양액을 측정합니다. 배양 후 24-48시간 동안 적절한 온도에서 플레이트를 배양합니다.

플레이트를 검사하고 24시간 및 48시간에 BY 47 41 대조군 이미지 플레이트와 관련하여 선택한 돌연변이의 화학적 민감도를 비교합니다. 이전과 마찬가지로 다음 이미지는 화학 물질의 subin 억제 농도를 측정하는 절차의 결과를 보여줍니다. 첫 번째 이미지는 포화 BY 4 7 4 1 배양액을 1 내지 5, 000으로 희석하고 5 플루오로 우라실의 농도 증가에 도금한 것을 보여준다.

10 마이크로몰 농도는 sub-in 억제 용량으로 선택됩니다. 이 이미지는 5개의 플루로 우라실을 포함하는 액체 배지에서 BY 4 7 41 세포의 성장 곡선을 보여줍니다. 4개의 세포에 대해 약 4배, 10을 3배로 증착하고, 5개의 플루오로우라실과 광학 밀도의 농도 증가를 22시간 동안 10분마다 측정하였다.

다시 말하지만, 10 마이크로몰 용량이 subin 억제 용량임을 알 수 있습니다. 다음 이미지는 5개의 플루오로 우라실(fluoro uracil)의 화학적 유전학 녹색의 결과를 보여줍니다. 여기서, 오른쪽에는 10 micromolar five Fluor uracil을, 왼쪽에는 DMSO control을 포함하는 YPD 한천에 복제된 S sachar visier deletion 돌연변이 어레이가 표시되어 있습니다.

이 그래프는 10 마이크로 몰에서 돌연변이의 상대적 성장 인 화학 유전학 녹색의 결과를 보여줍니다. DMSO 제어와 비교하여 5개의 Fluor uracil은 여기에서 광선 위치에 따라 정렬됩니다. 10 micromolar, 5 flora uracil에서 돌연변이의 상대적 성장은 DMSO 대조군과 비교하여 colony size ratio에 따라 정렬됩니다.

0.8 미만의 비율 임계값이 두 그래프에 모두 표시됩니다. 이 최종 이미지는 세 가지 검증 분석의 결과를 보여줍니다. 여러 개의 분리된 돌연변이 균주의 연속 희석을 왼쪽의 DMSO 대조군, 중앙의 10마이크로몰, 5개의 플루오로 UIL, 오른쪽의 0.015% 메틸 메탄 설포네이트에서 성장시켰습니다.

이 절차를 시도하는 동안 효모 탐지 분석 또는 효모 사체 해부와 같은 독립적인 방법론을 사용하여 결과를 검증하기 위해 deletion mutant array의 신뢰할 수 있는 복사본으로 작업하고 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 이 기술은 저분자 연구 분야의 과학자들이 발아 효모에서 시스템 수준 접근 방식을 사용하여 화합물의 작용 방식을 탐구할 수 있는 효율적인 수단을 제공합니다.