Name: 분리 및 설치류 골수의 정맥 주사 유래 단핵구 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: 배우세요 설치류 골수에서 대량의 단핵구를 분리하는 비용 효율적인 방법을. 이 기술은 심혈관 연구에서 측지혈관 성장 연구에 활용되며 동물 희생을 최소화합니다.

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이 연구는 DFG(Deutsche Forschungsgemeinschaft, 독일 연구 재단) SFB 854(Sonderforschungsbereich, 공동 연구 센터)의 지원을 받았습니다. 
기술 지원을 해 주신 Hans-Holger Gärtner, Audiovisuelles Medienzentrum, Otto-von-Guericke University Magdeburg, Magdeburg, 에게 감사드립니다.

이 연구는 동물 보호 (24D-9168.11-1 / 2008-24)에 대한 독일 법률 제 8 항에있어서, 작센 및 작센 - 안할 트, Regierungspraesidium 드레스덴 / 할레의 국가의 허가 하였다. 1 세포 분리 대퇴골과 경골의 1.1 준비 <ol><li> 폐쇄함에 이소 플루 란을 기화 5 % 이소 플루 란을 이용하여 농도 마우스를 마취. 마우스가 3 초 동안 이동을 중지 한 후, 자궁 경부 전위를 수행합니다. </li><li> 에탄올 (96 %)로 두 다리를 소독. 피부와 근육을 제거하고 멸균 메스와 뼈를 분리합니다. <ol><li> 사타구니 피부 절개로 시작하고 내과쪽으로 절개를 확장하고 낮은 송아지 주위 피부의 원형 절개를 수행합니다. 근위을 벗겨 완전히 다리의 피부를 제거합니다. </li><li> 날카로운 메스와 대퇴골에서 대퇴사 두근 근육을 분리, 전방 peroneus 모두 제거과 비복근의 근육 그룹 및 위치 및 인대를 해부하여 고관절에서 다리 관절이 어긋나 다. </li><li> 전방 시작하고 신중하게하여 관절을 disarticulating, 다리를 회전하고 인대에 병행하여 관절 주위를 진행합니다. </li></ol></li><li> 무균 세포의 준비를 보장하기 위해 90 초 최소 96 % 에탄올로 대퇴골과 경골을 씻으십시오. 에탄올 나머지 씻어 멸균 PBS로 세척 과정을 계속합니다. 참고 : 모든 후속 단계는 오염을 방지하기 위해 멸균해야합니다. </li></ol> 골수의 1.2 수확 <ol><li> 대퇴골과 경골의 축에 접근하도록 미세 가위 뼈 각각의 근위 및 원위 단부를 잘라. 이 뼈는 쉽게 깰 때문에,이 단계에주의하십시오. </li><li> 따뜻한 배지로 뼈에 플러시 (M199 + 10 % 소 태아 혈청 (FCS)을, + 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신). 멸균 28 G 바늘, 1 ML의 주사기, 10 ~ 15 ml의 매체 당 사이에 사용린스 뼈. </li><li> 미세 집게로 뼈를 잡고는 반투명를 꺼질 때까지 하나 하나 씻어. 조심스럽게 세포 스트레스를 최소화하기 위해 주사기 플런저의 단부에 압력을 적용한다. </li><li> 70 ㎛의 나일론 웹을 통해 골수를 여과하고 여액을 수집. 골수의 최대 양을 추출하려면, 근위 끝에서 반복 씻어. </li><li> PBS와 체를 씻어 여과 액을 수집합니다. 조심스럽게 파편과 부드러운 교반과 피펫 팅에 의해 세포 대기업을 제거. </li></ol> 1.3 재배 <ol><li> RT에서 10 분 동안 250 XG에 세포 현탁액을 원심 분리기. 뜨는을 취소하고 매체의 약 25 ml의 세포를 재현 탁. 한 번 반복합니다. </li><li> 2 차 세척 공정 후, 6 ㎖의 배지에서 세포를 재현 탁. 트리 판 블루 50 μL와 세포 용액 50 μl를 섞는다. 광학 현미경 하에서 계수 챔버에서 세포를 카운트. (C)의 수를 계산이 식을 이용하여 용액의 ELL : <img alt="식 (1)" fo:content-width="1.3in" src="/files/ftp_upload/52347/52347eq1.jpg" /></li><li> 플레이트의 저부에 영구 부착을 방지하기 위해 6 웰 초저 부착면 플레이트상에서 세포를 시드. 물론 당 최대 6 ml로 1 ㎖ 당 10 6 세포의 농도를 사용합니다. </li><li> 세포 분화를 촉진하기 위해 20 NG / ㎖의 M-CSF와 서스펜션을 보완. </li><li> 배양은 37 ℃에서 5 일간 세포를 5 % 이산화탄소 및 매일 관찰한다. </li></ol> 세포의 1.4 수확 주의 :이 단계는 얼음을 수행하여야한다. 따라서 1.4.1 또는 1.4.2 중 하나를 진행합니다. <ol><li> 이 시점에서, 그들은 초저 부착면 판하더라도 배양 플레이트에 부착 차별화 된 대 식세포를 포함한 전체 배양 수확. <ol><li> 부드러운 피펫 팅하여 전체 문화를 수확, 4 ° C PB 용액으로 분리S, 0.5 % 소 혈청 알부민 (BSA) 및 2 mM의 EDTA. 잘 모르는 경우 현미경으로 확인 - 플레이트가 부착 세포를 나머지의 명확한 때까지 반복합니다. </li></ol></li><li> 다른 방법으로, 주로 단핵 세포를 포함하는 현탁액 세포와 상층 액을 수확하여 대 식세포를 폐기합니다. <ol><li> EDTA가없는 PBS 용액 및 0.5 % BSA와 함께 비 - 부착 세포 수확. 온화하게 대 식세포를 빠지 방지하기 위해 너무 많은 힘을 가하지 마십시오. </li></ol></li></ol> 1.5 FACS 분석 (선택 사항) 참고 : MACS의 사용에 의해 CD117 + stem- 및 전구 세포의 세포 현탁액을 고갈시킬 수있다. 이 절차에 대한 제조 업체 프로토콜을 사용합니다. <ol><li> 하나가 1.4.1 또는 1.4.2 단계에 따라 세포를 수확. </li><li> 4 ° C에서 10 분 동안 250 XG에서 세포를 원심 분리기 다시이 단계를 반복합니다. </li><li> FACS (b)의 300 μL에 재현 탁 적어도 25 만 셀프로브 당 uffer. </li><li> 96 웰 플레이트 (물론 당 30 μL)에 세포 솔루션을 전송합니다. </li><li> 4 ℃에서 5 분 동안 250 XG에 세포 현탁액을 원심 분리기. </li><li> 상층 액을 제거하고 각 웰 (사용 제조 업체 희석)에 항체의 25 μl를 추가합니다. </li><li> 단계 후 세포 표현형에 대한 제조 업체 프로토콜 다음 항체 (와 세포 1.5.1-1.5.6. 단핵구 / 대 식세포의 식별을 위해 일반적으로 사용되는 마커는 CD11b, F4 / 80 (그림 3), CD115을 포함 얼룩 (그림 2), GR- 1. 참고 : 셀 솔루션의 또 다른 설명은 CD4, CD8a, 중 CD11c, CD25, CD45, CD45R, CD62L, CD80, CD86, CD145, CD117, MHCⅡ, Ly6C, Ly6G 및 CD192 같은 마커를 사용하는 것이 좋습니다. 휴대 특성은 이전 12 설명했다. </li><li> 4 ° C에서 20 분 동안 프로브를 품어. </li><li> 원심 분리기 4 ° C에서 5 분 250 XG에 프로브 및 FACS 완충액 200 μL에 재현 탁은. 반복 일두 번 단계입니다. </li><li> FACS 튜브에 프로브를 전송하고 FACS 분석 (12)을 수행합니다. </li><li> 세포 분화를 분석 일 0, 3 및 5에서 FACS 분석을 수행한다 (12). </li></ol> 2. 꼬리 정맥 주입 2.1 준비 <ol><li> 약 10 분 동안 37 ℃에서 가열 플레이트에 동물을 따뜻하게. 과열 징후를 인식 할 수 승온하면서 동물을 관찰한다. </li><li> NaCl을 150 μL에, 단계 1.1 및 1.4에 고립 된 단핵 세포를 재현 탁하고, 30G 바늘을 1 ml의 인슐린 주사기로 세포를로드합니다. 가볍게 모든 단핵 세포가 주입 보장하기 위해 주사기를로드하기 전에 솔루션을 소용돌이. 항상 열 매개 부착 및 단핵구의 활성화를 방지하기 위해 얼음에 세포를 처리합니다. </li></ol> 2.2 금지 <ol><li> 정맥 주사에​​ 대한 마우스를 선택할 때 우리에 다른 쥐를 방해하지 마십시오. </li><li> 제한 수단에 마우스를 놓습니다. 너무 많은 홍보를하지 마십시오essure는 뒷다리에주의합니다. (그림 4) 참고 : 다른 방법으로, 동물의 스트레스없는 취급을 보장하기 위해 전신 마취를 사용합니다. </li><li> 마우스가 제한 수단을 닫기 전에 호흡 공간이 있는지 확인하십시오. </li></ol> 2.3 주입 <ol><li> 소독제로 주사 부위를 소독. 마우스의 꼬리에 스프레이를 최소한 1 분간 방치 할 수 있습니다. </li><li> 혈관의 가시성을 위해, 주입 부위의 위 측면 꼬리쪽으로 약간 힘을인가하여 꼬리 정맥 혈류를 중지. </li><li> 주입하기 전에 꼬리를 90도 돌립니다. (그림 5) </li><li> 45도 각도로 주입한다. 천천히 주입 및 g 당 최대 5 μl의 해치는 동물을 피하기 위해. </li><li> 실패한 주입의 표시이다 물집이 있으면 즉시 중단하고 더 근접하게 주사를 반복합니다. </li><li> 부드러운 P를 적용하여 사출 측 지혈약 1 분 동안 ressure. </li><li> 프로 시저의 끝에서, 리 트랙터를 열고 그 장에 ​​마우스를 배치했다. </li><li> 20 분은 동물이 주입에 의해 피해를 입지되지 않아 흉골 드러 누움이 유지되도록하는 마우스를 관찰합니다. 마우스가 충분한 의식을 차릴 때까지 관찰의 시간을 연장합니다. 완전히 회복 된 후에 만​​ 다른 동물의 회사에 마우스를 돌려줍니다. </li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

우리는 골수로부터 단핵구 뮤린 다량 격리시키는 간단하고 비용 효율적인 방법을 설명한다. 단구 수율 X10 6 5 1.4을 수득 말초 혈액을 사용하는 다른 프로토콜에 비해, 우리는 단일 공여자 마우스에서 11 × 106 ± 3 × 106 단핵구 높은 수율을 얻을 수있다. 이 방법의 문제점을 고려할 때, 비 멸균 조건 하에서 작업 할 때 오염 가능성을 언급하는 것이 중요하다. 헹굼 다음 세척 단계가 제대로 따라 박테리아 및 진균에 의한 오염 가능성이없는 경우이다. 또한, 골수 과립구, 림프구 및 적혈구 세포를 포함 이종 세포 현탁액로 구성되어 있습니다. 일반적으로 인해 이들 세포 성장 인자의 부족 일 2와 3 사이의 재배 사라진다. 성장 인자 분화 구동 후 마크로파지는 오염의 주요 원인이다. T를 유지대 식세포 및 단핵 세포의 분화를 최소화하기 위해, 초저 부착 플레이트의 사용과 전술 한 세척 단계가 중요 낮은 식세포 그...

단핵구의 분리는 많은 in vitro 및 in vivo 연구에서 중요하고 중요합니다. 이 세포는 말초 동맥 질환, 관상 동맥 심장 질환 또는 기타 허혈성 질환과 같은 질병의 표적이 되는데, 이는 측부 혈관 성장이 국소 염증에 의해 강하게 주도되기 때문입니다. 염증 반응에는 내피 활성화 및 백혈구(주로 단핵구)의 국소 동원이 포함되며, 이 백혈구는 대식세포로 성숙하고 여러 성장 인자를 분비하여 동맥이 기능적 측부 동맥으로 재형성되도록 유도함으로써 고도의 동맥 생성 환경을 조성합니다1-3. 단핵구는 또한 수지상 세포로 성숙하여 면역학 연구4,5 및 암 연구6,7에 자주 사용됩니다.
말초 혈액에서 단핵구를 분리하는 접근법에서 문제가 되는 것은 8 대부분의 분석에서 충분한 양의 단핵구를 생산하는 데 필요한 많은 수의 기증 동물입니다. 이전 프로토콜은 단핵구를 분리할 때 MACS9를 통한 밀도 구배 원심분리 및 세포 고갈과 같은 방법을 설명합니다. 그러나, 이러한 기술은 단핵구의 특성과 기능을 변화시킬 수 있으며, 이는 해석의 어려움을 초래할 수 있습니다10,11. 또한 이러한 방법은 어렵고 실험 재현성을 감소시킬 수 있습니다.
이 프로토콜의 목표는 많은 양의 골수 유래 단핵구를 생성하는 간단하고 비용 효율적인 방법을 제공하는 것입니다. 이 프로토콜에 의해 얻어진 11 x 106 ± 3 x 106 세포의 높은 세포 수율로 인해 골수 유래 단핵구를 분리하는 동안 필요한 마우스 수를 크게 줄일 수 있습니다. 이 절차는 위에서 언급한 것처럼 비싸고 복잡한 기술을 사용하지 않고도 최소한의 시간 내에 완료할 수 있습니다. 여기에서는 기증자 마우스의 천연 골수 현탁액에서 단핵구를 추출하고, 초저 부착 플레이트에서 현탁액을 배양하고, 용액에 20ng/ml M-CFS를 보충합니다. 배양 5일차에 세포를 수확하고 특성화하여 기능적 특성과 표현형 특성을 확인합니다.
동맥 형성 분야의 실험의 경우, 이러한 골수 유래 단핵구를 마우스에 정맥 이식하는 것이 전신 약물 전달의 효과적인 방법이며, 이는 일반적인 말초 동맥 질환 모델에서 대퇴 동맥 결찰술과 결합할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>6-웰-초-저-첨부 플레이트</td>, <td>Corning Incorporated, NY, USA</td><td></td><td>6-웰-초-첨부 플레이트, 캡 포함, 멸균</td></tr><tr><td>8-12주, 수컷, balb/c 마우스&nbsp;</td><td>Charles River, Sulzfeld, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96웰 플레이트</td><td>Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blue dead cell stain</td><td>Life technologies GmbH, 다름슈타트, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>GE Healthcare, Freiburg, Germany</td><td></td><td>Fraction V, pH 7.0</td></tr><tr><td>Canules</td><td>B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany</td><td></td><td>28G, 30G</td></tr><tr><td>CD115</td><td>eBioscience, San Diego, USA</td><td>12-1152</td><td></td></tr><tr><td>CD11b</td><td>eBioscience, San Diego, USA</td><td>53-0112</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 접시</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany</td><td></td> 캡 <td>포함, 멸균</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany</td><td></td><td>Allegra&reg; X-15R 원심분리기</td></tr><tr><td>탈모 크림</td><td>Veet, Mannheim, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>소독제</td><td>Sch&uuml; LKE& Mayr GmbH, Norderstedt, Germany</td><td></td><td>Kodan Tinktur forte</td></tr><tr><td>일회용 메스 No.10&nbsp;</td><td>깃털 안전 면도기 Co.Ltd, 오사카, 일본&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich, 함부르크, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>에탄올 96%&nbsp;</td><td>Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbr&uuml; cken, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>추출 장치 Pipetus</td><td>Hirschmann Laborger&auml; te GmbH & Co.KG, 에버슈타트, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>F4/80</td><td>AbD Serotec, D&uuml; 독일 셀도르프</td><td>MCA497APC</td><td></td></tr><tr><td>FACS 버퍼&nbsp;</td><td>우리 그룹에서 단일 구성 요소</td><td></td><td>PBS, 0.5% BSA, 0.1% NaN3</</td></tr><tr><td>sub>FACS 장치로</td> 제조했습니다. <td>Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA BD</td><td></td><td>FACS Canto II</td></tr><tr><td>FACS 튜브&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Falcon&reg; 피펫</td><td>Becton Dickenson Labware, NY, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>태아 송아지 혈청</td><td>Sigma Aldrich, Hamburg, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fine binps</td><td>Rubis, Stabio, Switzerland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gloves</td><td>R&ouml; sner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gr1</td><td>eBioscience, San Diego, USA</td><td>53-5931</td><td></td></tr><tr><td>가열판&nbsp;</td><td>라보텍트 GmbH, G&ouml; 팅겐, 독일&nbsp;</td><td></td><td>핫 플레이트 062</td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany</td><td></td><td>Incu safe</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Baxter Deutschland GmbH, Unterschlei&szlig; heim, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>가벼운 현미경</td><td>Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, 독일</td><td></td><td>Axiovert 40 &deg; C</td></tr><tr><td>대식세포-군집 자극 인자</td><td>Sigma Aldrich, 함부르크, 독일</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/srp3110?lang=de&amp; region=DE">SRP3110&nbsp; </a></td><td></td></tr><tr><td>기계식 쉐이커</td><td>IKA, 슈타우펜, 독일</td><td></td><td>ms2 미니쉐이커</td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria</td><td></td><td>Warm in 37 &deg; C 사용 전 수조</td></tr><tr><td>마이크로 시험관</td><td>Eppendorf AG, 함부르크, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>미생물 작업대</td><td>Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany</td><td></td><td>Hera safe</td></tr><tr><td>Monocyte wash buffer&nbsp;</td><td>단일 구성 요소</td><td></td><td>PBS, 0.5% BSA, 2mM EDTA</td></tr><tr><td>마우스 억제</td>기로 당사 그룹에서 제조 <td>다양한</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Berlin Chemie AG, 베를린, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaN3 (sodium acide)</td><td>Sigma Aldrich, 함부르크, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neubauer counting chamber</td><td>Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-K&ouml; nigshofen, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>나일론 cellsieve</td><td>Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA</td><td></td><td>Cell strainer, 70 &micro; m 메쉬 크기</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>시그마 Aldrich, 함부르크, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>Life technologies GmbH, 다름슈타트, 독일</td><td></td><td>pH 7.4, 멸균</td></tr><tr><td>피펫</td><td>Eppendorf AG, 함부르크, 독일</td><td></td><td>10&micro; L/100&마이크로; L/200&마이크로; l/1,000&마이크로; l</td></tr><tr><td>피펫팅 헤드</td><td>Eppendorf AG, 함부르크, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>혈청학 피펫</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany</td><td></td><td>Cellstar 5 ml, 10 ml</td></tr><tr><td>흡입 장치</td><td>Integra bioscience, Fernwald, Germany</td><td></td><td>Vacusafe comfort</td></tr><tr><td>Surgical scissors</td><td>Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>주사기</td><td>B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany</td><td></td><td>1 ml Omnifix&reg; -F insuline syringe</td></tr><tr><td>Tubes with cap</td><td>Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany</td><td></td><td>15 ml/50 ml Cellstar tubes</td></tr><tr><td>Warm water bath</td><td>Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach, Germany</td><td></td><td>Julabo SW22</td></tr></tbody></table>

분리 및 설치류 골수의 정맥 주사 유래 단핵구

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

백혈구의 아형이자 대식세포의 전구자인 단핵구는 유기체의 많은 중요한 과정에 관여하며 종종 생물 의학의 다양한 분야의 주제입니다. 아래에 설명된 방법은 이질적인 골수에서 쥐 단핵구를 분리하는 간단하고 효과적인 방법입니다.
Balb/c 마우스의 대퇴골과 경골에서 채취한 골수는 인산염 완충 식염수(PBS)로 플러싱하여 채취합니다. 세포 현탁액은 대식세포-콜로니 자극 인자(M-CSF)로 보충되고 단핵구의 접착에 의한 분화를 방지하기 위해 초저 부착 표면에서 배양됩니다. 단핵구의 특성과 분화는 다양한 간격으로 특성화됩니다. CD11b, CD115 및 F4/80과 같은 마커를 사용하는 FACS(Fluorescence activated cell sorting)는 표현형 분석에 사용됩니다. 재배가 끝나면 현탁액은 45%± 12% 단핵구로 구성됩니다. 접착성 대식세포를 제거하면 순도를 최대 86%± 6%까지 높일 수 있습니다. 분리 후 단핵구는 다양한 방법으로 활용될 수 있으며, 생체 내 전달을 위한 가장 효과적이고 일반적인 방법 중 하나는 꼬리 정맥 주사입니다. 
이 분리 및 적용 기술은 특히 염증 또는 면역학 분야에서 마우스 모델 연구에 중요합니다. 단핵구는 또한 마우스 질병 모델에서 치료적으로 사용할 수 있습니다.

뮤린 골수로부터 추출 된 세포 용액은 다양한 종류의 세포로 구성된다. 주요 종류의 세포는 림프구, 과립구와 단핵구 수 있습니다. 세포 유형은 분화 5 일 후에 수확 네이티브 현탁 세포도 1에 도시되어 크기 및 입도 (granularity)에 의해 추정 될 수있다. 재배 동안 이동 셀룰러 조성합니다. 그러나 인구의 정확한 분류는 세포 마커의 독특한 표현에 의존해야합니다. MPS-시스템의 셀들을 식별하는 데 가장 중요한 마커는 M-CSF 수용체로서 작용하고 특별히 전구 세포, 단구, 대 식세포 및 단핵구상에서 발현되는 CD115이다. 따라서, MPS-독특한 서브 세트를 식별하는 데 사용되지 않을 수도 있지만 확실 단핵구 / 대 식세포로 분화 구동 세포의 절대 양을 추정 할 수있다. 다른시 CD115 발현의 타임 라인은 그림 2를 참조하십시오entiation. 성숙 마커...

여기에서는 번역 응용을 위해 이질적인 골수에서 다량의 쥐 단핵구를 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 다른 방법과 비교했을 때, 이 새로운 방법은 높은 구배 자기 세포 분리(MACS)와 같은 값비싼 방법을 피함으로써 희생되는 동물의 수를 줄이고 비용을 절감하는 데 도움이 됩니다.

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

안녕하세요, 제 이름은 Helen Kuster이며 MacBook에 위치한 Auto Vica 대학교의 Dr. Harold 심혈관 연구 그룹에서 근무하고 있습니다. 저희는 측부 혈관 성장을 위한 매개체로 사용하기 위해 해양 단핵구의 분리 및 특성 분석에 관심을 가지고 있습니다. 골수 유래 단핵구를 배양하기 위해서는 다음과 같은 주요 단계가 필요합니다. 첫째, 마우스 마취 및 경추 탈골, 둘째, 대퇴골 추출 및 세척입니다.골수의 3차 여과. 4차로 배지를 이용한 세척 단계, 5차로 초저부착 플레이트에서의 세포 배양. 6차로 유세포 분석.골수에서 단핵구를 추출하기 위해, 마우스에 ISO fluorine을 사용하여 마취를 실시한 후 경추 탈골법으로 안락사시킵니다. 마우스를 고정한 뒤 멸균 메스로 양쪽 뒷다리를 분리합니다. 양쪽 대퇴골과 경골을 적출하여 96% ethanol로 최소 90초 동안 세척합니다.이후 모든 단계는 오염을 방지하기 위해 엄격하게 무균 상태로 진행해야 합니다. 뼈에서 근육이나 힘줄을 제거합니다. 대퇴골과 경골을 따뜻한 PBS로 여러 번 헹굽니다.골수를 채취하기 위해, 각 뼈의 근위단과 원위단을 미세 가위로 절단합니다. 뼈를 세척하기 위해서는 28 G 스테릴 니들 1개, 1 mL 주사기 1개, 그리고 뼈당 10~15 mL의 배지가 필요합니다. 그 후, 미세 핀셋으로 뼈를 잡은 상태에서 골수를 70 µm 여과망을 통해 여과합니다.뼈가 투명해질 때까지 하나씩 헹굽니다. 세포 스트레스를 최소화하기 위해 시린지 플런저에 조심스럽게 압력을 가하십시오. PBS로 부위를 헹굽니다.그 후, 세포를 상온에서 250 G로 10분 동안 원심분리합니다. 그리고 배지로 다시 현탁합니다. 이 단계가 끝나면, 해당 과정을 한 번 더 반복합니다.천연 골수 유래 단핵구를 위해, 1% penicillin 및 streptomycin과 10% fetal cough serum이 포함된 M 199를 사용합니다. 또한, 배양 첫날에 20 ng/mL MCSF를 첨가합니다. 배양 마지막 날에는 배지에 8 ng/mL interferon gamma를 첨가합니다.MHC II 상향 조절이 필요한 경우, 세포가 바닥에 영구적으로 부착되는 것을 방지하기 위해 웰이 깊은 초저부착 플레이트에 세포를 분주합니다. 세포 농도는 1 × 10⁶ cells/mL로 하며, 웰당 최대 6 mL까지 사용합니다. 배양 기간은 37°C, 5% CO₂ 조건에서 5일입니다.5일 후부터는 세포의 60%에서 80%가 단핵구(monocytes)가 될 때까지 매일 세포 상태를 확인합니다. 저는 여기 Auto Fungi University의 심장학, 혈관학 및 만성질환 학과에서 공부하고 있는 의대생 마틴 바흐너(Martin Bachner)입니다. 정맥 주사를 시행할 때는 사전에 충분히 연습하는 것이 중요한데, 그렇지 않으면 단핵구를 적절한 방식으로 투여할 수 없기 때문입니다.실험 결과, 단핵구(monocyte)를 전신적으로 투여했을 때 관절 무형성증(art agenesis) 개선에 가장 효과적인 것으로 나타났습니다. 전신 약물 투여의 일반적인 방법은 꼬리 정맥 주사(tail vein injection)입니다. 본 실험에서는 염화나트륨에 재현탁시킨 250만 개의 단핵구를 주사합니다.마우스 꼬리 동맥의 복측과 배측에는 각각 4개의 혈관이 있으며, 외측에는 2개의 정맥이 있습니다. 따라서 외측 정맥(WA) 주사를 위해서는 꼬리를 약 90도 정도 돌려야 합니다. 절차를 더 쉽게 진행하기 위해, 가열 패드를 사용하여 마우스를 약 10분 동안 가온시켜야 합니다.동물들은 보온 상태에서 관찰되어야 합니다. 이는 과열 징후를 인식하는 데 중요합니다. 또한, 1 mL 인슐린 주사기에 이 감염원과 30게이지 바늘 세트가 필요합니다.동물을 보정기에 주의 깊게 고정하십시오. 이렇게 하면 꼬리 정맥 주사가 훨씬 수월해집니다. 시린지에 용액을 넣기 전, 마우스가 충분히 호흡할 수 있는 공간이 있는지 확인하십시오. 모든 단핵구가 주입될 수 있도록 단핵구 용액을 볼텍싱하십시오.감염을 방지하기 위해 주사 부위를 소독하고, 엄지와 검지로 꼬리를 잡습니다. 가장 말단 지점에 바늘을 평평한 각도로 삽입합니다. 정맥에 제대로 위치했다면 단핵구 용액을 매우 쉽게 주입할 수 있습니다.수포가 형성되었다면 이는 주입이 잘못되었음을 나타내는 징후입니다. 즉시 중단하고 다시 시도하십시오. 근위부의 경우, 항상 천천히 주입해야 하며 g당 5 µL를 초과하지 않도록 하십시오.주입이 성공적이었다면, 주입 부위를 약 1분 동안 가볍게 압박하여 지혈합니다. 절차가 끝나면 리트랙터를 열고 마우스를 케이지로 옮겨 단구(monocyte)의 특성을 분석합니다. 우리는 CD 11 B, F four 80, CD 115 및 GL one의 항원 조합을 사용하여 효과를 분석합니다.이러한 항원들의 발현은 단핵구를 분석하기 위한 발달 단계와 상관관계가 있습니다. 0일, 3일, 5일 및 7일에 분석을 수행했으며, 5일째에 단핵구 순도가 최대 90%까지 증가했습니다. 이러한 순도를 달성하기 위해서는 강력한 부착성 대식세포를 제거하는 것이 중요합니다.EDTA가 없는 세척 버퍼를 사용하여 비테린 세포(non terrine cells)를 제거합니다. 테린 세포(terrine cells)를 제거하기 위해 EDTA가 포함된 세척 버퍼와 부드러운 파이펫팅을 사용합니다. 이 도식은 그들의 원엔 배양(one end culture)을 위한 주요 세포 유형을 보여줍니다.표시된 서로 다른 세포 유형은 1 림프구, 2 단핵구, 3 과립구이며, 배양 5일 이후 단핵구 순도가 증가합니다. 배양 중 세포 구성이 변화함에 따라 세포 집단에 1 단핵구와 2 대식세포가 포함됨에 유의하십시오.그림 2, 분화 과정 중 CD 115 발현의 타임라인입니다. 분화 5일 후 모든 세포의 95% 이상이 CD 115 양성이며, 이는 대다수의 세포가 단핵구 또는 대식세포임을 나타냅니다. 분류는 세포 크기와 과립성에 근거할 수 있으나, 특정 세포 마커가 더 신뢰할 수 있습니다.그림 3, 단핵구 대식세포 성숙도의 발현 증가. 마커 F4/80, 5일 차, 단핵구 표현형과 일치하는 중간 정도의 F4/80 발현을 보이는 세포군의 출현에 주목하십시오. 7일 차, 대식세포 성숙과 일치하는 F4/80 발현의 우측 이동에 주목하십시오.단핵구의 분리는 많은 인비트로(in vitro) 및 인비보(in vivo) 연구에 있어 필수적입니다. 이러한 세포들은 예를 들어 허혈과 관련된 말초 동맥 질환이나 관상동맥성 심장 질환과 같은 질병과 관련하여 흥미로운 표적이 됩니다. 생검용 마우스의 대퇴골과 경골에서 골수를 채취하기 위해 따뜻한 배지로 뼈를 세척하며, 세포 현탁액에 MCSF를 첨가하고 단핵구의 부착 유도 분화를 방지하기 위해 초저부착 표면에서 배양합니다. 단핵구의 특성과 분화는 CD 11 b, CD 115, FO 80과 같은 마커를 사용하여 다양한 시간과 조건에서 확인하며 세포의 표현형을 분석합니다.전신 약물 전달이 필요한 경우, 정맥 주사는 이를 위한 쉽고 효과적인 방법입니다. 본 연구에서는 간단하고 비용 효율적인 방식으로 골수에서 다량의 MI 단핵구를 분리하는 방법을 설명하였습니다. 이 새로운 방법을 통해 마우스 한 마리당 약 11 million 개의 단핵구를 생성할 수 있습니다.

isolation-intravenous-injection-murine-bone-marrow-derived

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

골수 이식은 골수 유래 세포의 유전자형을 변경하는 방법을 제공합니다. 관심 유전자는 골수 유래 세포 및 비 골수 유래 세포 모두에 표현되어있는 경우, 골수 이식이 아닌 골수 유래 세포 유전자형을 변경하지 않고 다른 유전자형에 골수 유래 세포를 변경할 수 있습니다.

골수 이식으로 마우스 대장염에서 면역 및 비 면역 세포에서 유전자 발현의 기능 역할을 차별화

이 비디오에서는 박테리아 지질다당류와 면역글로불린 정맥 주사에 대한 반응으로 골수 유래 대식세포가 활성화되는 것을 보여줍니다.

항체에 반응하는 마우스 골수 유래 대식세포의 활성화(Activation of mouse bone marrow-derived macrophages in response to antibos)

우리는 밀도 기울기 원심 분리하여 및 CellTracker 염료를 사용하여 호중구 라벨링 마우스 골수에서 호중구의 분리 및 정제를위한 프로토콜을 설명합니다. 이 스트림 기능 연구 또는 입양 전송 및 추적 실험 호중구의 큰 숫자를 얻기위한 간단하고 빠른 재생하고 경제적 인 방법을 나타냅니다.

분리, 정제 및 기능 연구 및 입양 전송 실험 쥐의 골수 호중구의 라벨링

Monocytes는 주변 동맥 질병의 맥락에서 arteriogenesis의 중요 한 중개자. 지하실 막 같은 매트릭스 및 intravital 현미경 검사 법을 사용 하 여,이 프로토콜 대 퇴 동맥 결 찰 murine 모델에 monocyte 주입 후 monocyte 유도 및 종양 관련 신생을 조사 합니다.

Intravital 현미경 Monocyte 유도 및 주변 동맥 질병의 Murine 모델에서 종양 관련 신생의

Monocyte 파생 된 DC (MoDC) 위험 관련 된 분자의 작은 금액을 느낄 수 및 따라서 쉽게 끝났다. 우리는 혈액과 종양과 그들의 조기 활성화를 피하기 위해 고려해 야 하는 주요 조치를 강조 하면서 면역성이 있는 복합물으로 그들의 활성화에서 MoDC의 격리에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다.

마우스 Monocyte 파생 된 모 수석 세포 및 종양 면역 단지와 활성화 후속 생체 외에서 그들의 격리 프로토콜

이 프로토콜은 NO-산화환원 생물학을 연구하기 위해 테트라하이드로바이오프테린(BH4)- 및 유도성 일차 뮤린 대식세포-결핍 일차 뮤린 대식세포를 배양하기 위해 확립되었다. 이 연구는 실험 결과와 결과의 해석을 혼동 할 수있는 전통적인 격리 및 배양 방법에서 발견되는 BH4 및 기타 유물의 잠재적 오염을 줄이는 데 중점을 둡니다.

NO-Redox 생물학의 연구를 위한 골수 유래 대식세포의 분리 및 시험관내 배양

여기에서는 10 ng / mL GM-CSF / IL-4로 7 일 배양 한 후 마우스에서 고순도 골수 유래 수지상 세포를 분리하고 생성하는 경제적이고 효율적인 방법을 제시합니다.

마우스로부터 골수 유래 수지상 세포를 분리하고 배양하기 위한 경제적이고 효율적인 프로토콜

본 프로토콜은 마우스에서 골수 유래 대식세포의 분리 및 배양을 설명합니다.

Isolation and Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages from Mice

이 프로토콜은 쥐 이종 이식 모델에서 유전자 편집 세포를 포함한 몇 가지 조혈 또는 백혈병 줄기 세포의 대퇴 내 주사를 설명하며, 이를 통해 세포의 빠르고 안전한 이식뿐만 아니라 골수의 연속 분석도 가능합니다.

살아있는 마우스를 사용한 간소화된 대퇴강 주사로 지속적인 골수 분석 가능

이 프로토콜은 7-9일 된 신생아 마우스 골수 세포를 분리하고 L929 세포의 상층액을 과립구 집락 자극 인자(M-CSF)의 공급원으로 사용하여 분화된 대식세포를 생성하는 비효소적이고 간단한 방법을 설명합니다. 골수 유래 대식세포는 표면 항원 F4/80, CD206, CD11b 및 기능적 역량에 대해 추가로 분석되었습니다.

신생아 마우스 골수 분리 및 골수 유래 대식세포의 준비

배우세요 설치류 골수에서 대량의 단핵구를 분리하는 비용 효율적인 방법을. 이 기술은 심혈관 연구에서 측지혈관 성장 연구에 활용되며 동물 희생을 최소화합니다.

분리 및 설치류 골수의 정맥 주사 유래 단핵구

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