분리 및 설치류 골수의 정맥 주사 유래 단핵구

안녕하세요, 제 이름은 헬렌 쿠스터(Helen Kuster)이고 맥북(MacBook)에 있는 해롤드(Harold) 박사의 심혈관 연구 그룹에서 일하고 있으며 오토 비카 대학교(Auto Vica University)의 교수입니다. 우리는 담보 혈관 성장에서 차량에 사용하기 위해 해양 단핵구의 분리 특성화에 관심이 있습니다. 다음과 같은 주요 단계는 골수 유래 단핵구의 배양, 첫 번째 마우스 마취 및 경추 탈구, 두 번째 추출 및 대퇴골 헹굼에 필요합니다.

세 번째 골수 여과. 넷째, 매체를 사용한 세척 단계, 다섯째, 초저 부착 플레이트에서 세포를 배양합니다. 여섯 번째 유세포 분석.

골수에서 단핵구를 추출하기 위해 마우스는 ISO 불소를 사용하여 마취하고 경추 탈구로 안락사시킵니다. 마우스가 고정되고 양쪽 하지가 스테로이드 메스로 분리됩니다. 대퇴골과 경골을 모두 채취하여 최소 90초 동안 96% 에탄 에탄올로 세척했습니다.

그 후에는 오염을 방지하기 위해 모든 단계를 엄격하게 멸균해야 합니다. 뼈에서 근육이나 힘줄이 제거됩니다. 대퇴골과 경골은 따뜻한 PBS로 여러 번 헹굽니다.

골수를 채취하기 위해 각 뼈의 근위부와 원위부 끝을 가느다란 가위로 자릅니다. 뼈를 헹구기 위해서는 스테로이드 28G 바늘 1개, 주사기 1개, 주사기 1개, 뼈당 10-15밀리리터의 중간 주사기가 필요합니다. 그 후, 미세한 겸자로 뼈를 잡은 채 70마이크로미터 S를 통해 골수를 여과합니다.

뼈가 환상으로 변할 때까지 뼈를 하나씩 헹굽니다. 세포 스트레스를 최소화하려면 주사기의 스탬프에 조심스럽게 압력을 가하십시오. PBS로 시엣을 헹굽니다.

그 후, 세포를 실온에서 10분 동안 250G에서 원심분리합니다. 그리고 reus는 매체로 중단됩니까? 이 단계가 끝나면 단계를 다시 한 번 반복합니다.

천연 골수에서 유래한 골수 유래 단핵구의 경우, 1%의 페니실린과 스트렙토마이신, 10%의 태아 기침 혈청이 함유된 M 199를 사용합니다. 또한 첫날에 밀리리터 INE MCSF당 20나노그램을 추가합니다. 밀리리터 간섭 감마당 8 나노 그램은 배양의 마지막 날에 배지에 첨가됩니다.

MHC 2 상향 조절을 원하는 경우, 세포는 바닥에 영구적으로 부착되는 것을 방지하기 위해 두꺼운 웰이 있는 초저 부착 플레이트에 파종됩니다. 우리는 웰 당 최대 6 밀리리터와 함께 밀리리터당 6 셀에서 1 배 10의 농도를 사용합니다. 재배 기간은 37도의 온도와 5%의 이산화탄소에서 5일입니다.

세포는 5일 후에 60에서 80%까지 세포가 단핵구인 사이에서 매일 검사됩니다. 제 이름은 Martin Bachner이고 저는 Auto Fungi University의 심장학, 해부학 및 연대기학과에서 박사 과정을 밟고 있습니다. 그리고 정맥 주사를 할 때는 단핵구를 적절한 방법으로 적용할 수 없기 때문에 하기 전에 많은 연습을 하는 것이 중요합니다.

실험에 따르면 단핵구는 체계적으로 적용될 때 예술 노화를 개선하는 데 가장 효과적입니다. 전신 약물 적용의 일반적인 방법은 꼬리 WA 주사입니다. 우리의 경우, 250만 개의 단핵구를 주입하는데, 이 단핵구는 재현탁되고 염화나트륨입니다.

배쪽과 등쪽에 있는 쥐 동맥의 꼬리에는 4개의 혈관이 있고 측면에는 2개의 쇠퇴가 있습니다. 따라서 WA 주입을 위해서는 꼬리를 약 90도 회전해야 합니다. 더 쉬운 절차를 위해 약 10분 동안 가열 패드를 사용하여 마우스를 예열해야 합니다.

동물은 온난화를 통해 관찰해야 합니다. 이것은 과열의 징후를 인식하는 데 중요합니다. 더욱이, 우리는 이 감염원과 1밀리리터 인슐린 주사기에 30개의 유전자 바늘이 필요합니다.

동물을 구속기에 조심스럽게 고정하면 꼬리 방향으로 주입하기가 훨씬 쉬워집니다. 용액을 주사기에 넣기 전에 마우스가 숨을 쉴 수 있는 충분한 공간을 확보했는지 확인하십시오. Vortex, 모든 단핵구를 주입할 수 있도록 하는 단핵구 용액.

감염을 피하기 위해 주사 부위를 소독하고 쿵쿵 거리기와 검지 손가락 사이의 꼬리를 잡으십시오. 가장 원위 지점에서 바늘은 평평한 각도로 삽입됩니다. 정맥에 삽입하면 단핵구 용액을 주입하는 것이 매우 쉽습니다.

물집이 생기면 잘못된 주사의 신호입니다. 즉시 중지하고 더 시도해야 합니다. 근위부, 항상 천천히 주입하고 그램 당 5 마이크로 리터를 넘지 않도록 하십시오.

주입에 성공한 경우 약 1 분 동안 부드러운 압력을 가하여 주입 부위의 출혈을 멈 춥니 다. 절차가 끝나면 견인기를 열고 마우스를 케이지에 넣어 단핵구를 특성화합니다. 우리는 항원, 즉 CD 11 B, F 4 80, CD 115 및 GL 1의 조합과 함께 효과를 사용합니다.

이러한 항원의 발현은 단핵구를 분석하기 위한 발달 단계와 관련이 있습니다. 우리는 0일, 3일, 5일, 7일에 사실을 확인했고, 단핵구 순도는 5일째에 90%까지 증가했습니다. 이러한 순도를 달성하려면 테린 대식세포를 강력하게 고갈시키는 것이 중요합니다.

비테린 세포는 EDTA 프리 세척 버퍼를 사용하여 고갈됩니다. 테린 세포를 고갈시키기 위해 우리는 세척, 완충액 및 부드러운 p 페팅이 포함된 EDTA를 사용하고 있습니다. 이 다이어그램은 한쪽 말단 배양의 주요 세포 유형을 보여줍니다.

표시된 다양한 세포 유형은 림프구 1개, 단핵구 2개, 과립구 3개이며 5일째 이후 단핵구 순도가 증가합니다. 그리고 문화. 배양 세포 집단 중 이동하는 세포 구성에는 1개의 단핵구와 2개의 대식세포가 포함됩니다.

그림 2, 분화 중 CD 115 발현의 타임라인. 모든 세포의 95% 이상이 분화 5일 후 CD 115 양성이며, 이는 대다수의 세포가 단핵구 또는 대식세포임을 나타냅니다. 분류는 세포 크기와 입도를 기반으로 할 수 있지만 특정 세포 마커가 더 신뢰할 수 있습니다.

그림 3, 단핵구 대식세포 성숙도의 발현 증가. 마커 F four 80, day five는 단핵구 표현형과 일치하는 중간 F four 80 발현을 가진 집단의 출현을 주목합니다. 7일째, 대식세포 성숙과 일치하는 F four 80 발현의 오른쪽 이동에 주목하십시오.

단핵구의 분리는 많은 in vitro 및 in vivo 연구에 필수적입니다. 이러한 세포는 예를 들어 허혈과 관련된 말초 동맥 질환 또는 관상 동맥 심장 질환과 같은 질병과 관련하여 흥미로운 표적입니다. FEMA의 골수와 생검 마우스의 경골을 따뜻한 배지 세포 현탁액으로 뼈를 세척하여 채취하고, MCSF를 보충하고, 접착을 피하기 위해 초저 부착 표면에서 배양하고, 단핵구 특성의 분화 및 단핵구의 분화를 다른 시간에 확인하며, CD 11, b, CD 115 및 FO 80과 같은 마커를 사용하여 세포를 표현형화하는 데 사용합니다.

전신 약물 전달이 필요한 경우 정맥 주사가 쉽고 효과적인 방법입니다. 우리는 간단하고 비용 효율적인 방법으로 골수에서 많은 양의 MI 단핵구를 분리하는 방법을 설명했습니다. 이 새로운 방법을 통해 마우스당 약 1,100만 개의 단핵구를 생성할 수 있습니다.