방법은 가연성 담배 제품 준비의 세포 독성 및 면역 억제를 평가하기

이 절차의 전반적인 목표는 P BMC에 의한 사이토카인 분비 및 표적 세포 사멸에 대한 담배 제품 제제의 효과를 평가하는 것입니다. 이는 먼저 배양된 P BMC를 전체 연기 상태, 배지 또는 니코틴으로 처리한 다음 처리된 p BMC의 세포 내 염색을 수행하여 사이토카인 생성을 측정함으로써 수행됩니다. 대안적으로, CFSE 표지 K 5 62 세포는 전체 연기 조절 배지 처리된 PBMC 효과기 세포와 공동 배양되며 K 5 62 세포의 생존력은 7개의 A a d 염색으로 검증됩니다.

궁극적으로, 두 분석법의 P BMC에 대한 가연성 담배 제품 제제의 효과는 유세포 분석으로 측정됩니다. 크롬 방출 분석 또는 ALI 스폿과 같은 기존 방법 또는 당사 기술의 주요 장점은 처리량이 많고 방사성이 없으며 세포 기능을 측정할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 담배 제품 제제의 생물학적 영향에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

또한 염색 절차를 시작하기 전에 PBMC 효과기 세포의 tolike 수용체 매개 및 STIC 기능에 영향을 미치는 다른 화합물의 평가에 적용할 수 있습니다. 전체 연기 상태, 중간 및 니코틴을 나열된 농도로 희석합니다. RPMI에서는 96웰 플레이트에서 웰당 총 부피 100마이크로리터의 매체를 완성합니다.

그런 다음 웰당 총 부피 200마이크로리터에 대해 웰당 6개의 셀에 1배10의 농도로 완전한 배지에 현탁된 100마이크로리터의 P BMC를 추가합니다. 다음으로, 플레이트를 덮고 섭씨 37도, 5%CO2에서 배양합니다. 3시간 후 세포를 세척하고 상층액을 흡인합니다.

그런 다음 플레이트를 다시 덮고 소용돌이를 일으켜 펠릿을 분리하십시오. 세포를 두 번 더 세척하되, 한 번은 얼음처럼 차가운 완충액에서, 한 번은 두 번째 세척 후 완전한 매체에서 세척합니다. 골지 플러그와 LPS가 보충된 완전한 매체의 웰당 200마이크로리터로 섭씨 37도 및 5%CO2에서 6시간 동안 처리합니다.

그런 다음 얼음 차가운 러닝 버퍼로 세포를 세척하고 20 분 후 섭씨 4 도에서 웰 당 100 마이크로 리터의 사이토 픽스로 처리하고 얼음 차가운 파마 세척으로 세포를 세 번 씻습니다. 그런 다음 각 웰에 45마이크로리터의 사이토 펌을 추가한 다음 나열된 각 항체 5마이크로리터를 추가합니다. 섭씨 4도에서 30분 후 세포를 세 번 세척하고 200마이크로리터의 차가운 포름알데히드에 고정합니다.

그런 다음 세포를 12 x 75mm 튜브로 옮기고 유세포 분석기에서 샘플을 분석합니다. 방금 시연된 바와 같이 pbmc를 처리한 담배 제품 한 접시를 준비한 후, 10ml의 DPBS에서 80%co 유창성으로 수확한 K 5 62 세포 배양액을 세척합니다. 소생. 펠릿을 5ml의 DPBS에 현탁시키고 세포를 계수합니다.

그런 다음 1ml의 완전한 배지에 있는 7번째 K 5 62 세포에 1-2배 10배의 갓 준비된 CFSE 작업 용액 1ml를 추가하고 볼텍싱으로 세포 염색을 분산시킵니다. 정확히 2분 후에 실온에서 세포를 배양하고 FBS 200마이크로리터를 첨가한 다음 세포를 다시 와류로 배결시켜 2분 더 배양합니다. 두 번째 배양 후, 10 밀리리터의 완전한 배지로 세포를 세척 한 다음 펠릿을 또 다른 10 밀리리터의 완전한 배지에 재현탁시키고 세포를 계수합니다.

이제 담배 처리 된 BMC를 원심 분리하고 상층액을 디캔팅합니다. 그런 다음 덮개를 교체하고 와류로 세포를 재현탁시킨 다음 웰당 200마이크로리터의 완전한 배지로 세척합니다. 사멸 분석을 시작하려면 K 5 62 세포로 표시된 CFSE를 1:15 비율로 pbmc에 추가하고 섭씨 37도 및 5%CO2에서 공동 배양을 배양합니다.

5시간 후, 세포를 스핀다운하고 상층액을 버립니다. 와류에 의해 펠릿을 현탁시킨 다음 웰 당 200 마이크로 리터의 러닝 버퍼로 셀을 세척 한 다음 95 마이크로 리터의 러닝 버퍼를 첨가 한 다음 웰 당 100 마이크로 리터의 총 부피에 대해 7 A a d의 5 마이크로 리터를 추가합니다. 마지막으로 실온에서 15분 동안 어두운 곳에서 세포를 배양합니다.

그런 다음 각 웰에 100마이크로리터의 러닝 버퍼를 추가하고 전체 볼륨을 적절한 해당 팩스 튜브로 전송하여 7개의 a, a, D 및 CFSE 양성 세포의 백분율을 결정합니다. 유세포 분석에 의해, 세포 사멸의 용량 의존적 증가는 24시간에 전체 연기 조절 배지에서 관찰되며, 말린 니코틴 단위의 밀리리터당 4마이크로그램에서 거의 80%의 세포가 죽습니다. 그러나 p BMC를 3시간 동안만 처리하면 24시간에 전체 연기 조절 매체의 말 니코틴 단위당 5마이크로그램에서도 심각한 독성이 발생하지 않습니다.

3시간 후 1밀리리터당 3000마이크로그램의 니코틴으로 처리하기 전에 비슷한 정도의 세포 사멸이 관찰되지 않았으며, 니코틴 처리는 전체 연기 상태, 매체 및 니코틴으로 밀리리터당 2000마이크로그램 농도 처리 전에 측정 가능한 세포 사멸을 일으키지 않았으며, LPS에 의한 TLR 4 수용체의 자극은 분비된 사이토카인의 용량 의존적 감소를 초래합니다. 억제 정도는 개별 사이토카인에 따라 다르지만. 또한, 세포를 LPS와 골지막으로 6시간만 유아용 침대로 처리한 경우, 니코틴 노출에 비해 낮은 에퀸 니코틴 단위 농도에서도 전체 연기 상태 매질에 노출된 후 세포 내 사이토카인 양성 세포의 수가 감소하는 것이 관찰됩니다.

실제로, 이 사멸 분석의 결과는 전체 연기 상태 매체의 밀리리터당 1.56마이크로그램에 노출되면 대조군 및 낮은 선량 농도에 비해 이펙터 PBMC 집단의 사멸 능력이 크게 감소한다는 것을 보여줍니다. 고농도 또는 저농도의 니코틴 처리는 이러한 절차를 시도하는 동안 효과기 PBMC 집단의 사멸 능력을 방해하지 않습니다. CFSE 라벨링과 항체 희석액, 라벨링 시간 및 배양 온도를 정확하게 표시하는 것이 중요합니다.

이 동영상을 시청한 후에는 담배 제품 제제 또는 기타 치료법이 말초 혈액 단핵 세포에 미치는 영향을 결정하기 위해 유세포 분석에서 항체 라벨링 기술을 활용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.