2015년 1월 10일
급성 뇌 절편에서 시냅스로 결합된 뉴런의 패치 클램프 기록 및 동시 세포 내 바이오사이틴 충전을 통해 구조적 및 기능적 특성의 상관 분석을 수행할 수 있습니다. 이 프로토콜의 목적은 뉴런 미세 회로에서 전기생리학적 기록의 필수 기술 단계와 후속 형태학적 분석을 설명하는 것입니다.
다음 실험의 전반적인 목표는 형태학적으로 식별된 뉴런 간의 시냅스 연결이 기능적으로나 구조적으로 어떻게 특성화되는지 보여주는 것입니다. 이것은 특정 시냅스 연결을 연구하는 데 최적화된 급성 뇌 절편을 얻음으로써 달성됩니다. 그런 다음 패치 클램핑을 사용하여 시냅스로 결합된 뉴런을 테스트합니다.
이를 위해 개별 시냅스 후 뉴런을 패치하고 두 번째 피펫을 사용하여 시냅스 연결의 존재를 확인하기 위해 주변 뉴런을 자극합니다. 반응이 보이지 않으면 자극 전극이 움직입니다. 연결이 발견되면 시냅스전 뉴런이 도매 모드에서 재매칭됩니다.
이러한 뉴런의 전기생리학적 기록과 동시 비오틴 충전에 따라 슬라이스를 고정하고 비오틴을 처리하며 뉴런의 컴퓨터 지원 3D 재구성을 수행합니다. 궁극적으로 우리의 방법은 신경 미세 회로의 상관된 정량적 구조 및 기능 분석을 목표로 합니다. 시냅스로 결합된 뉴런의 쌍을 이루는 기록의 주요 장점은 뉴런 마이크로 회로에서 시냅스 전후 뉴런 모두에 대한 상관 구조적 및 기능적 분석을 수행할 수 있다는 것입니다.
훨씬 더 최근에는 뉴런의 광학 자극과 같은 도입된 기술이 지금까지 이를 세부적으로 달성할 수 없습니다. 이 방법을 사용하면 형태학적으로 식별된 뉴런 유형의 흥분 및 억제의 상호 작용과 활성이 조절되는 방법을 연구할 수 있습니다. 애완 동물 녹음 절차를 시연하는 것은 Guan이 맡을 것입니다.
제 연구실에서 박사후 연구원으로 일하고 있는 분입니다. 대상 영역의 슬라이스를 준비한 후,이 시간 동안 배양하도록 허용하고 길고 가느 다란 생크를 가져야하는 패치 피펫을 당깁니다. 실험실에서 백금 하프로 뇌 절편을 고정한 후 기록 피펫에 내부 용액을 채웁니다.
피펫을 프리 앰프에 놓고 칼륨 염이 나트륨 염으로 대체되는 내부 용액으로 채워진 8-10 메가 옴 저항의 검색 패치 피펫을 사용하여 전체 세포 모드에서 추정되는 시냅스 후 뉴런을 패치합니다. 검색 피펫에 부드러운 흡입을 가하여 느슨한 세포의 잠재적인 시냅스전 뉴런을 패치합니다. 첨부된 구성.
전류 클램프 모드에서 느슨한 밀봉 아래의 멤브레인 전위를 음의 30에서 음의 60밀리볼트 사이로 유지합니다. 그런 다음 0.2에서 2 나노 암페어의 큰 전류 펄스를 적용하여 전위 시냅스 전 세포에서 활동 전위를 유도합니다. 이 활동 전위를 전압 응답에서 작은 스파이클릿으로 관찰하십시오.
자극 주파수를 0.1 헤르츠로 설정하여 시냅스후 반응의 런다운을 방지합니다. 시냅스후 뉴런이 테스트된 잠재적으로 시냅스전 뉴런 패치의 자극에 반응하지 않는 경우, 느슨한 밀봉 모드의 새로운 잠재적 시냅스전 뉴런. 이러한 방식으로 최대 30개의 잠재적으로 시냅스전 뉴런을 테스트합니다.
30메가옴 이상의 저항을 가진 씰이 설정될 수 있는 한 동일한 검색 패치 전극을 계속 사용합니다. 느슨한 밀봉 모드에서의 자극으로 인해 시냅스후 뉴런에서 5밀리초 미만의 잠복기를 가진 EPSP 또는 IPSP가 발생하는 경우, 4 - 8메가옴의 저항을 가진 일반 내부 용액을 포함하는 비오틴으로 채워진 기록 패치 전극을 사용하여 시냅스전 뉴런에서 검색 피펫을 제거합니다. 시냅스전 뉴런을 패치하고 전체 세포 전류 클램프 모드로 기록합니다.
시냅스전 뉴런에 전류 주입으로 활동 전위를 유도하고 시냅스후 반응을 기록합니다. 나중에 오프라인 분석을 위해 컴퓨터에 데이터를 저장합니다. 기록 전반에 걸쳐 비오틴은 적절한 염색을 얻기 위해 뉴런으로 확산됩니다.
비오틴이 뉴런의 크기에 따라 최소 15분에서 30분 동안 확산되도록 합니다. 연결 비율이 높은 신경 세포 미세 회로의 경우 검색 전극이 사용되지 않습니다. 차라리 전체 세포 모드에서 시냅스전 뉴런을 직접 패치하는 것으로 시작하십시오.
그런 다음 일반 내부 용액으로 채워진 패치 전극을 사용하여 전체 세포 모드에서도 잠재적인 시냅스후 뉴런을 패치하고 두 세포 모두 전류 클램프 제어 하에 있어야 합니다. 시냅스전 세포에서 활동 전위를 유도하고 시냅스후 전위에 대한 장래의 시냅스후 뉴런을 모니터링합니다. 뉴런이 시냅스전 자극에 반응을 보이지 않으면 새 전극을 사용하여 전체 세포 모드에서 새 뉴런을 다시 패치합니다.
연결이 발견되면 패치 피펫을 변경하지 않고 앞에서 설명한 대로 기록을 진행하십시오. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 슬라이스를 고정하고 장착한 후 광학 현미경으로 비오틴 표지된 뉴런을 검사합니다. 축삭 배턴과 수지상 가시가 명확하게 보이는지 확인합니다.
상용 뉴런 추적 시스템을 사용하여 뉴런 또는 시냅스로 결합된 뉴런 쌍을 수동으로 추적할 수 있습니다. 작은 축삭돌기 또는 수지상 담보도 포함해야 합니다. 추적을 사용하여 3D 뉴런 재구성을 얻고, 추적 프로그램의 해당 섹션에서 세 가지 공간 차원 모두에서 수축에 대한 뉴런 재구성을 수정합니다.
임베딩 매체에 대한 수축 보정 계수는 x 및 y 방향의 경우 약 1.1이고 Z 방향의 경우 약 2.1입니다. 가시 모양의 별과 뉴런으로 빠르게 스파이킹하는 것으로 구성된 상호 결합 된 세포 쌍. 피질층에서 4개는 비오틴으로 채워져 있었다.
기록하는 동안 녹색 점은 시냅스 이전 가시 뉴런과 시냅스 후 사이 뉴런 사이의 추정 흥분성 시냅스 접촉을 나타냅니다. 파란색 점은 추정되는 상호 억제 시냅스 접촉을 나타냅니다. 시냅스 접촉의 고출력 이미지가 여기에 나와 있습니다.
녹색 열린 원은 흥분성 접촉을 나타내고 파란색 열린 원은 억제성 접촉을 나타냅니다. 이 상호 연결된 세포 쌍의 신경 명료한 재구성이 여기에 나와 있습니다. inter neurons 축삭은 파란색으로 표시되고 soma와 수상돌기는 빨간색으로 표시됩니다.
가시 뉴런 축삭은 녹색으로 표시되고 소마와 디트는 흰색으로 표시됩니다. 삽입된 부분은 시냅스 전후 뉴런의 소마토 수지상 구획(somato dendritic compartments)을 보여줍니다. 추정되는 시냅스 접촉과 함께, 배럴 윤곽은 급성 뇌 절편으로 만든 저전력 명시야 사진 현미경 사진에서 확인되었습니다.
연결 비율이 매우 낮은 대표적인 시냅스 연결이 여기에 나와 있습니다. 레이어 6 파라메탈 세포의 시냅스 전 활동 전위는 레이어 4 스타 파라메탈 뉴런에서 모노 시냅스 흥분 포스트 시냅스 전위를 불러 일으켰습니다. 여기에 표시된 이 층류 간 연결의 3밀리초 이상의 대기 시간은 로컬 층내 연결에서 관찰되는 약 1밀리초 대기 시간보다 훨씬 깁니다.
10 헤르츠에서 두 개의 활동 전위가 6 개의 파라 메탈 세포에서 유도되어 여기에 표시된 4 개의 스타 파라메탈 뉴런에서 시냅스 후 전위를 트리거했습니다. 단기적인 촉진에 주목하십시오. 슬래싱 조건은 주어진 시냅스 연결에 맞게 최적화되어야 하며, 녹음하는 동안 설정이 절대적으로 안정적이어야 하며 최적의 녹음 이해가 보장된다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.
이 비디오를 시청한 후에는 신피질에 있는 뉴런 마이크로 회로의 구조적 및 기능적 특성에 대한 전반적인 그림을 얻기 위해 전기생리학적 측정과 형태학적 재구성이 어떻게 사용되는지 잘 이해하게 될 것입니다.
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이 프로토콜은 형태학적으로 식별된 뉴런 간의 시냅스 연결의 특성을 전기생리학적 및 구조적 분석을 통해 보여줍니다. 급성 뇌 슬라이스를 사용하여 연구자는 개별 뉴런에 패치 클램프를 적용하고 주변 뉴런을 자극하여 시냅스 연결을 확립할 수 있습니다.
Paired patch-clamp recordings in acute brain slices enable direct, quantitative analysis of synaptic connectivity and functional microcircuit properties, supporting mechanistic de-risking in early neuroscience drug discovery. This approach provides high-resolution correlation between neuronal structure and function, informing target validation and predictive confidence for CNS portfolio decisions. Integrating electrophysiological and morphological data strengthens translational continuity from discovery biology to preclinical model selection.
This method bridges early discovery and preclinical research by providing quantitative, mechanistic insights into neuronal microcircuits, supporting lead identification and translational biomarker development in CNS pipelines.