Name: 줄기의 네트워크 문화 생물 신경 독소의 기능 평가 중추 신경계 신경 세포가 유래 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 5 s
Description: 배우세요 마우스 배아 줄기세포에서 뉴런으로 분화시키고 Clostridial 신경독소가 시냅스 전달에 미치는 영향을 전기생리학으로 정량화하는 방법을. 이 기법은 보툴리즘과 파상풍 병리 연구에 활용됩니다.

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공동 과학 기술 사무실, 의료 S &amp; T 부문 (승인 번호 CBM.THRTOX.01.10 -이 작품은 보건 국립 알레르기 전염병 연구소 (IAA 번호 AOD12058-0001-0000)과 국방 위협 감소 기관의 국립 연구소에 의해 투자되었다 .RC.023 및 CBM.THRTOX.01.RC.014). PB는 국방 위협 감소 기관 - 국가 연구위원회 연구 Associateship 상을 개최 KH는 국가 연구위원회 연구 Associateship 상을 개최하면서이 연구를 수행 하였다. 우리는 안젤라 애드킨스 및 기술 지원을 Kaylie Tuznik (USAMRICD를) 감사합니다; 및 편집에 도움 신디 Kronman (USAMRICD). 본 기사의 의견은 저자의 견해이며 육군 부, 국방부, 또는 미국 정부의 공식 정책을 반영하지 않습니다.

는 ESC 1. 적응은 무 세포 현탁 배양 피더 <ol><li> 37 ° C에서 해동는 ESC 얼음의 은색이 남을 때까지. </li><li> 10 6 예열 ESC 배지 10 ㎖를 함유하는 비 - 조직 배양 - 처리 된 접시는 ESC 해리 X 2.5 - P1000 피펫을 사용하여 조심스럽게 1 옮긴다. 37 ° C에서 20 시간 및 5 % CO 2의 가습 된 조직 배양기에서 배양한다. </li><li> 20 시간 후, 부드럽게 10 ml의 혈청 학적 피펫을 사용하여 15 ML 원뿔 튜브에 현탁 배양을 전송하여 세포를 씻으십시오. 200 x g에서 3 분간 펠렛는 ESC. 회전하는 동안, 저 밀착성 접시 ESC 다시 신선한 배지를 가하여 10. </li><li> 대기음 상층 액을주의하면서 세포 펠렛을 빠지 피하고, 1 ml의에게 펠렛 셀 신선한 ESC 매체를 추가 할 수 있습니다. P1000 피펫을 사용하여 박테리아 접시에 세포를 전송하고 인큐베이터로 돌아갑니다. </li><li> 집계는 육안 (일반적으로 4에 표시 될 때까지 매일 세포를 관찰 - 8 일 (D) 집계는 0.2이됩니다- 0.5 mm). 집계는 4 일 후 식별 할 수없는 경우, 1.3 단계를 반복합니다. 집계 볼 수 있습니다되면, 해리 및 제 2 항에 설명 된대로는 ESC를 유지한다. </li></ol> 2. ESC과 Passaging 및 유지 관리 <ol><li> ESC는 15 ml의 멸균 10 ML의 피펫을 사용하여 원뿔 튜브를 집계 전송하고 집계 소형 펠릿에 정착 할 수 있도록 (일반적으로 3-5 분). 대기음 뜨는, 조심하면 세포 펠렛을 방해하지 않도록, 5 ml의 PBS로 집계를 씻어. 중력 침강 2.5 분 동안 100 XG에서, 또는 펠렛 세포를 사용하는 것이 좋지만 대신 시간을 저장합니다. </li><li> 대기음 PBS 500 μL 트립신을 추가합니다. 37 ° C의 물을 욕조에 3 분 동안 트립신의 집계를 품어. 트립신을 희석 부드럽게 집계를 깰 P1000 피펫으로 10 번 씹다 500 μL ESC 매체를 추가합니다. 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다. </li><li> 펠렛은 1.0의 최종 농도로 재현 탁하고 200 XG 세포에서 3 분 동안 세포를 해리ESC 매체 X 107 세포 / ml. 전송 (150) 10cm 박테리아 접시에 신선한 ESC 배지 10 ㎖에 μL (1.5 × 10 6 세포), 48 시간 동안 조직 문화 인큐베이터로 돌아갑니다. 10 % DMSO, 또는 폐기 보충 된 90 % ESC 배지에서 5 × 106 세포 / ml - 과잉는 ESC 1에서 동결 보존 차별화 될 수있다. </li><li> 통로마다 48 시간을 집계합니다. 통과를 위해 준비 골재는 0.5 mm를 초과하는 직경, 명확하게 볼 수 있습니다. 참고 : - 1.4 냉동 보관, 서스펜션 적응 세포의 해동과 문화가 단계 1.2 당 달성된다. 72 시간 - 집계 (48) 내에서 계대에 대한 준비가 될 것입니다. </li></ol> 3. 신경 세포의 분화 참고 : - 정오 이후 이전에 정오에 3.5 단계 3.7 행동 3.1 단계를 반복합니다. 분화 절차의 개요는도 1a에 표시됩니다. <ol><li> 2.5 - 단계 2.1로는 ESC를 떼어 놓다. 해리의 전송 350 μL (3.5 × 10 6)25 ㎖ 분화 배지를 함유 10cm 둘러 부착 접시는 ESC D. 5 % CO 2, 37 ℃에서 조직 배양 인큐베이터 안에 45 RPM - 30으로 설정 진탕에 놓는다. 이 차별화의 첫 날, 시험 관내 (DIV)에서라고 일 -8. 참고 : 매우 낮은 첨부 접시의 사용 방법의 비용을 증가하지만, 집계 가끔 배양 접시에 부착 할 수 있기 때문에 세균 배양 접시보다 약간 큰 수익률을 생산하고 있습니다. 다른 접시 크기를 선호하는 경우, 중간 볼륨 및 세포 수를 그에 따라 확장 할 수 있습니다. </li><li> 48 시간 (DIV의 -6) 한 후, 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 분화 세포 집합체를 전송하기 위해 25 ㎖ 피펫을 사용한다. 즉시 페트리 접시에 차별화 매체의 신선한 25ml를 추가합니다. </li><li> 2 mm의 깊이 - 1 볼 펠렛을 생산, 5 분 - 골재가 2 이상을 해결 할 수 있습니다. 서스펜션에 남아있는 단일 세포 또는 작은 집계를 무시합니다. 조심스럽게 매체를 대기음 CE를 전송LL 다시 P1000을 사용하여 배양 접시에 펠렛. 조직 문화 인큐베이터에서 회전 진탕에 놓습니다. </li><li> DIV -4 단계를 반복 3.2에서. 4 mm의 깊이 - 펠렛 2 될 것입니다. 페트리 접시에 6 μm의 모든 트랜스 레티노 산 (RA)로 보충 30 ml의 차별화 매체를 교체합니다. 추가로 48 시간 동안 조직 배양 인큐베이터에서 회전 진탕으로 돌아갑니다. </li><li> DIV -2 단계를 반복 3.3에서. 이 시점에서 깊이 8 MM - 펠렛 4 될 것입니다. </li><li> DIV -1에서, 제 4 장에서와 같이 도금 표면을 준비합니다. </li><li> 조직 배양 후드에서 10 분 플레이스 - DIV 0, 5, 37 ° C에서 미리 분취 및 냉동 NPC를 트립신 처리 배지 5 ㎖를 해동. 이전 50 ML 원뿔 튜브에 집계를 차별화, 25 ML의 피펫을 사용하여. 집계가 정착 조심스럽게 흡인 매체하도록 허용합니다. 워시 집계 세척 사이에 정착 할 수 있도록, 10 ml의 PBS로 두 번 펠렛. </li><li> 제 PBS 세척 후에, 펠릿 NPC의 트립신 처리 배지 5 ㎖를 추가하여 37 ℃에서 부화6; 5 분 C. 부드럽게 2.5 분 후에 튜브를 가볍게. </li><li> 트립신을 비활성화하고 반전 혼합 0.1 % 대두 트립신 억제제 (STI)의 5 ML을 추가합니다. 비교적 균질 세포 현탁액이 생성 될 때까지 10 ㎖의 혈청으로 15 회 피펫 - 부드럽게 10 연화. </li><li> 천천히 50 ㎖ 원뿔형 튜브의 상단에 위치도 40㎛ 70㎛, 셀 스트레이너에 세포 현탁액을 전송. 모든 현탁액을 여과 한 후, 필터를 통해 남아있는 세포를 세척하고 200 x g에서 6 분 동안 해리 된 세포 현탁액을 펠렛 N2 배지 1 ㎖를 추가한다. </li><li> 펠렛을 방해하지 않고 대기음 매체. 200 XG에 5 분 동안 세포를 펠렛 및 P1000과 세척 사이에서 분쇄하여, 10 ml의 N2 매체로 두 번 세포를 씻으십시오. 두 번째 세척하기 전에 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다. </li><li> / cm 2 셀 200,000 - 150,000의 세포 밀도로하는 ESN ㎖의 판 당 1 × 107 세포에서 N2 배지에서 세포를 재현 탁. </li><li> 새로 PLAT 이동가습 37 ° C에서 조직 문화 인큐베이터 5 % CO 2 ED하는 ESN과 5 절에서와 같이 유지한다. </li></ol> DIV 0 도금 신경 전구체에 대한 문화 표면 준비 (4) <ol><li> 도금에 최소 1 일전 조직 배양 처리 된 요리를 준비합니다. (PEI를, 멸균 H 2 O 25 ㎍ / ml)에 충분한 폴리에틸렌 이민을 추가 또는 폴리 D 라이신 (PDL을 100 ㎍ / ml의 멸균 H 2 O에)에서 O / N을 플라스틱 요리를 조직 문화가 처리 된 커버 배양 37 ° C. </li><li> 도금의 아침, 두 번 증류 H 2 O로 두 번 설거지를 한 번 PBS와. 최종 세척 후 요리를 커버 할 수있는 충분한 N2 매체를 추가 (예를 들어, 12 잘 접시 잘 당 1 ml의 또는 6cm 접시 당 4 ㎖). </li><li> 적어도 전날 신경 도금 18mm 커버 글라스를 준비합니다. 플라즈마 클리닝 4 분으로 청소 된 커버. </li><li> 즉시의 바닥 에탄올 세척하고 파라 필름으로 세정 된 커버를 전송할큰 멸균 요리와 단계 4.1에서와 같이 제조 PEI 또는 PDL 솔루션의 400 μl를 추가. 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 O / N을 품어. </li><li> 아침에, 세척 물로 3 회 된 커버는 1 PBS에 5 ㎍ / ㎖의 라미닌을 추가 - 37 ° C에서 3 시간. 이전 신경 세포를 해리로, 라미닌을 대기음 즉시 직면 처리 된면을 유지해야되는 NPC 배지 1 ㎖를 포함하는 12 잘 접시의 잘에 커버 슬립을 전송합니다. </li><li> 저장 요리와 37 ° C에서 커버 슬립의 NPC 판 할 준비가 될 때까지. </li></ol> 뉴런 5. 유지 보수 <ol><li> 그리고 DIV 1, 흡인 매체에서 N2 배양액으로 교체합니다. </li><li> 그리고 DIV 2, 4, 흡인 매체에서 B27 배양 배지로 교체. </li><li> DIV 8에서 대기음 매체와 B27의 배지를 포함하는 유사 분열 억제제로 교체가 아닌 신경 세포를 오염 제거합니다. </li><li> DIV 12, B27 배양 배지로 교체합니다. </li><li> DIV를 제거하지 마십시오준비가 될 때까지 5 % CO 2 12 +하는 ESN은 사용할 수 있습니다. </li></ol> 미니어처 흥분성 시냅스 후 전류를 정량화를위한​​ 시냅스 전달 (MIST) 분석 6. 측정 억제 주의 : - 1 NG / kg 클로스 트리 디움 신경독 0.1의 낮은 예상 인간의 LD 50 값으로 알려진 가장 독성 물질이다. 이 독소를 사용하여 적절한 예방 조치를 사용하기 전에 필요한 승인을 얻습니다. <ol><li> 조심스럽게 37 ºC에 원하는 최종 ESN 배양 배지의 농도와 따뜻한을 100 배 본트 / A를 희석. 21 + ESN 문화를 DIV 배양 접시를 소용돌이 및 인큐베이터로 돌아 독소의 적절한 볼륨을 추가합니다. </li><li> 세포가 중독 후 4 개 이상의 시간을 분석 할 경우, 이러한 직접 인큐베이터에서 또는 일정한 CO 2 실에서, 5 % CO 2에서 제거하지 않고 요리와 소용돌이에 독소를 추가합니다. </li><li> 적절한 시점에서, ASPIRATE ESN 배양 배지 및 세포 외 기록 버퍼 (ERB)로 두 번 세척 하였다. ERB의 추가 4 ㎖를 각각 활동 전위를 차단하고 GABA에게 수용체 활동을 반감, 5.0 μM 테트로도톡신 10 μM의 bicuculline 보충. </li><li> 전기 생리학 장비에 접시를 전송합니다. 어느 관류도 온도 제어는 MIST 분석이 필요합니다. </li><li> 저항의 5 ~ 10 밀리 옴으로 기록 피펫을 생산하고 세포 내 기록 버퍼 채우기 위해 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 붕규산 유리를 잡아 당깁니다. 부드럽게 기록하기 전에 시약을 siliconizing 채워 기록 피펫을 찍어. </li><li> 기록 피펫은 ERB 내로 하강으로 공기 - 충전 된 주사기를 사용하여, 양압을 제공한다. 부드럽게 기록되는 뉴런 소마상의 기록 피펫 착륙 후 양압을 제거한 기가 시일을 형성한다. MV -70 유지 전압을 낮 춥니 다. 조심스럽게 전체 셀 구성에 침입 음압을 적용합니다. </li><li> 모니터링하고 막 잠재력을 휴식 기록하는 전류 클램프로 전환합니다. 액체 접합 전위에 대한 조정없이, 휴식 막 잠재력은 -82에 -67 사이의 MV 될 것입니다. </li><li> 소형 흥분성 시냅스 후 전류 (mEPSCs)를 검출하기 위해 5 분 - 4 연속 -70 MV 전압 클램프 녹음을 수행합니다. </li><li> 다음과 같은 설정으로 스파이크 탐지 소프트웨어를 사용하여 mEPSC 검출을위한 기록 된 데이터의 4 분 분석 : 임계 값, 5; 기간은 로컬 최대를 검색, 10,000 마이크로 초; 기준에 대한 피크 전에 시간, 5,000 마이크로 초; 기간은 감쇠 시간을 검색하려면 20,000 마이크로 초; 피크의 분수는 0.37를 감쇠 시간을 찾기 위해; 기간이 기준을 평균 1,000 마이크로 초; 임계 영역, 20; 평균 피크, 1 점의 수; 피크의 방향, 음. </li><li> 수집 및 감지 이벤트에 대한 정보를 저장합니다. mEPSC Hz 단위 주파수를 결정하기 (240)에 의해 4 분에서 검출 된 이벤트의 수를 나눈다. </li><li> 12 계속 - 8 mEPSC 주파수를 수집rols 8 - 각각의 노출 조건에 대한 12 본트 처리 된 샘플. 나이와 많은-대조군에 대한 주파수를 분석 할 수 있습니다. 일원 분산 분석 테스트 및 던넷 사후 테스트를 사용하여 시냅스 활동의 억제 %의 통계적 유의성을 확인합니다. </li></ol>

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미국 정부는 이 기사에 설명된 방법을 통합한 두 개의 국제 특허 출원을 제출했습니다: PCT/US2014/22042, 제목: "시냅스 활동을 이용한 신경독 검출 방법"; 및 PCT/US13/40641, 제목: "줄기 세포 유래 뉴런을 사용한 독소 검출".

CNT 검출, 혈청 판별 및 정량 황금의 현재 표준은 MLA이다. MLA는 호스트의 전체 범위를 질의한다 : 기질의 생체 내에서 발생할 중독 필요한 독소의 상호 작용 (예를 들어, 독소, 세포 표면 수용체의 세포질 내로 독소 수용체 복합체, LC 전좌의 내재화를 결합, LC가 매개 된 절단 및 시냅스의 신경 전달의 억제) 18. MLA는 중독의 생리 학적으로 관련 모델을 제공하지만, 그러나, 오염 물질에 의해 혼동 할 수있다, 리소스를 많이하고 엔드 포인트로 죽음 마우스의 큰 숫자를 포함한다. 대안 적으로, 본트 검출 및 정량 용 세포 기반 분석법은 또한 동물의 사용 또는 시냅스를 형성하고 전형적 신경독 8 불량한 감수성을 나타내는 실패 신경 아세포종 세포주해야 차 신경 세포 배양에 한정되어왔다. 일에 중독 현재까지 대부분의 측정ESE 셀 기반 플랫폼은 SNAP-25, VAMP1 / 2 또는 신택-1 (11)의 단백질 분해 분열의 검출에 의존하고있다. SNARE 단백질 절단 정확하게 19,20 중독 또는 중독으로부터 회복을 나타낼 수없는 비선형 따라서 생체 내에서 시냅스 억제와 연관된 것으로 도시되어 있기 때문에이 문제가된다. CNT 검출을위한 이상적인 셀 모델 - 기반 시스템은 (ⅰ) 뉴런 - 기반 일 것이다; (II)는 시냅스 neurotypic 전기 반응과 결합 될; (ⅲ) 모든 CNT 혈청 형 또는 서브 타입에 매우 민감 할 수; 및 (ⅳ) MLA를 통해, 저렴한 비용으로, 동물의 사용을 요구하지 않고 동등 또는 개선 제안 확장 성, 처리량 및 분석 시간. 이러한 요구 사항을 충족하기 위해, 우리는 시판 마우스 ESC 라인으로부터 고농축 네트워크화 글루타메이트의 문화와 GABA 성 신경 세포를 대량 생산하는 방법을 개발 하였다. 우리는 다음 정량 MIST 분석을 개발응답 시냅스 억제는 텐트와 본트 / A- / G와 중독. MIST 분석이 어떤 시냅스 활성 신경 세포 집단 (예를 들어, 기본 뉴런이나 뇌 조각)에 실시 될 수 있지만, 현재하는 ESN 재현성 응급 네트워크 동작을 개발하고, 따라서 MIST 분석에 적합한 유일한 체외 유래 신경 세포 모델이다. ESC 배양 및 분화의 여러 혁신은 탄소 나노 튜브 연구에 대한 정의 혈통의 신경 세포의 충분한 양을 필요한 생산. 우선, 선택에 대한 적응 및 현탁액을 견딜 수는 ESC를 배양함으로써 피더 세포와 분화의 개시시는 ESC에서 피더 세포를 정제 할 필요성에 의한 오염의 가능성을 제거. 서스펜션 적응을 기본 분자 메커니즘은 알 수 있지만, 서스펜션 적응는 ESC가 mitotically 활성 상태로 유지, OCT3 / 4 식을 유지하고 신경 인성 계속. 이 방법을 사용하여, 1.5 × 106 ~ 7 ESCS는 일반적으로 각각의 통과를 복구됩니다. 둘째로, 제조의 NPC 표면적으로 응집체의 내부에 영양소 접근성을 증가 분화 중에 응집을 방지하기 위해 기계적 교반을 혼입함으로써 ~ 300 % 증가 하였다. 이 과정에서 우리는 ESC 문화와 신경 세포의 분화에 사용되는 혈청 신경성는 ESC를 유지에서 가장 중요한 구성 요소입니다 것으로 나타났습니다. 최고의 성공을 위해, 우리는 서스펜션 혈청의 각 로트에 ES 세포를 적응 및 유효 기간을 통해 ESC 문화와 신경 세포의 분화를 지원하기 위해 -20 ° C에서 혈청을 비축하는 것이 좋습니다. 대부분의 시냅스 활성 문화와 마찬가지로, DIV 14 +하는 ESN은 2 농도가 24 시간 내에 신경 독성이 발생할 수 있습니다 pH의 급격한 변화, 대기 CO 심지어 간단한 노출에 매우 민감하다. O는 / N 이상, 신경 세포를 직접 취급 할 필요가 지속 배양 한 다음 문화의 치료를 필요로하는 실험 전인큐베이터 또는 실험 이전에 일정한 CO 2 챔버로 이송 ​​명. 다양한 기술 ICC, 전사 프로파일 및 전체 셀 패치 클램프 전기 생리학을 포함한 신경과 신경 세포의 성숙을 확인했다. 유전자 발현 및 신경 세포 형태의 시간적 변화는 신경의 발달 단계를 통해 빠른 진행과 일치했고, DIV (16)에 의해,하는 ESN은 흥분성 및 응급 네트워크를 억제 소형 시냅스 후 전류가 16 행동들 나타냈다. 시냅스 활동의 증거하는 ESN은 보툴리누스 중독 및 파상풍의 임상 양상에 대한 책임 pathophysiologies을 복제 할 수 있음을 제안했다. 이것은 본트 / A- / G 또는 비히클 - 처리 또는 미처리 뉴런 비교&gt; 95 %에 의해 텐트 손상 mEPSC 주파수와 그 중독 보여 MIST를 사용하여 확인 하였다. 본트 / A에 대한 MIST의 감도 측정은 평균 억제를 표시농도 0.013 (0.5 마우스 치명적인 단위 / ㎖에 해당) 오후 제한-의 검출 0.005 μM의 아래의 (IC 50), 목욕 첨가 한 후 20 시간에서 측정. 4 배 빠른 MLA보다 및 절단 SNAP-25의 면역 기반 탐지보다 더 민감한 30 배 -이 값을 바탕으로, MIST 2로 약 두 배 민감하고. 종합적으로, 이러한 데이터는 줄기 세포 유래 신경 세포의 네트워크로 인구가 중독의 생리적 관련, 셀 기반 모델을 제공하는 것이 좋습니다. 보다 신속 민감한 특정 측정 값을 제공하면서 현탁액 적응는 ESC로부터 네트워크 ESN 배양을 유도하는 개선 된 방법과 조합 MIST의 사용은 동물 실험과 관련된 단점, 비용 및 MLA의 윤리적 문제에 대한 필요성을 감소시켜야 중독. 전 세포 패치 - 클램프 전기 생리학 신경독 활성의 존재를 식별하기위한 낮은 처리량 방법이 있지만, 해상도 및 SPE을 구비분자 방법을 사용하여 복구되지 에디션. 이러한 결과는 활성 - 의존성 방식의 어플리케이션이 시냅스 활성을 평가하고, 네트워크 동작은 신경독의 신속한 특정 검출을 가능하게 할 수 있다는 증거를 제공한다. 이러한 높은 처리량 방법은 탄소 나노 튜브를 포함 neuromodulatory 에이전트의 넓은 배열 가능한 기계 론적 연구, 치료 검사 또는 진단 분석을 만들 것입니다.

이 방법의 전체 목표는 기능적으로 클로스 트리 디움 신경독에 노출 된 줄기 세포 유래 신경 세포 배양에서의 네트워크화 시냅스 활성을 평가하는 것이다. 이 기능 보툴리누스 중독의 임상 양상에 대한 책임 pathophysiologies 복제 및 탄소 나노 튜브, 치료 검사 및 역학적 연구의 검출을위한 적합한 모델로하는 ESN의 유효성을 검사 체외 파생 모델의 첫 번째 데모입니다. BoNTs은 클로 스트 리듐 종의 구성원에 의해 생성 된 매우 치명적인 박테리아 신경 독소입니다. 최근에 제안 된 본트 / H를 포함, 여덟 항원 별개의 본트의 혈청 형 (/ A- / H) 1, 2를 설명 하였다. 모든 혈청 형이있다 150 kDa의 펩타이드로 표현 번역 후 3 이황화 결합에 의해 연결된 100 kDa의 중쇄 (HC)로 이루어지는 dichain 및 50 kDa의 경쇄 (LC)이 생성하는 칼자국. HC는 시냅스 수용체와 ENT에 결합 중재시냅스 엔도 시토 시스를 통해 신경 세포에 독소의 공예. 엔도 솜 처리 중에, HC는 시냅스 세포질 내로 LC의 전좌를 촉진 소포 막에 공극을 형성하는 구조 개편을 겪는다. LC는 다음 구체적 대상과 연접 구획 절단 용해 N -ethylmaleimide에 민감한 융합 부착 단백질 수용체 (SNARE) 단백질 : SNAP-25 (본트 / A / C / E), VAMP2 (본트 / B, / D, / F / G) 또는 신택 (본트 / C) 1. 이 SNARE 단백질 중 어느 절단하여 신경 전달 물질의 방출을 차단, 시냅스 세포 외 유출 기계의 조립을 방지 할 수 있습니다. 효율적인 타겟팅 및 시냅스 전 신경 지역화의 조합은 가장 강력한 독 0.1 정도의 낮은 추정 된 인간 치사량 공지 BoNTs 렌더링 - NG를 1 / 1 kg이다. 생화학 적 분석은 감도가 높은 CNT의 LC의 존재 또는 활성을 검출하기 위하여 이용 될 수있다. 그러나 이러한 방법은 내가 실패바인딩 입력 독소 nterrogate 능력을 활성화하고 뉴런 내 기능, 따라서 활성 독소의 존재와의 간접적 인 측정 가능한 오해이다. 대조적으로, 이러한 마우스 치사 분석 (MLA) 등의 기능 분석 중독 종합적 독소 활성의 구체적인 관련성 평가를 제공 성공적 흡수 및 활성화의 모든 단계를 협상하는 탄소 나노 튜브의 능력을 평가한다. MLA는 본트 검출 금 표준이지만, 그것은 종단점으로 죽음을 사용 생체 방법이며, 따라서 연구 플랫폼으로 제한 유틸리티를 갖는다. 역학적 연구와 치료 심사에 적합한 CNT 중독의 셀 기반 모델을 개발하는 시도는 상당한 한계를 겪었다. 일차 배양 신경 생리 학적 관련성이 높은 수준을 제공하지만, 이들의 사용은 높은 리소스 비용, 상대적으로 낮은 수율, 여러 신경 하위의 존재를 포함하여 다수의 인자에 의해 복잡유형과 동물의 사용과 관련된 광범위한 규제 및 관리 감독. 차 뉴런에 대한 대안으로서, 예컨대 신경 아세포종 세포 및 부신하는 chromaffin 등 (화학적 자극에 의한 신경 세포와 유사한 특성을 채택하도록 유도 될 수있다) 신경성 세포주를 중독의 시험 관내 모델로서 사용되어왔다. 이러한 세포를 유도하기 전에 지속적으로 배양하기 때문에, 그들은 고도의 확장 성 및 중간 처리량 접근 방식에 대한 따라서 적합하다. 유도 표현형은, 일반적으로 이질적 탄소 나노 튜브에 제대로 민감하고 기능 시냅스 (4)에 조립 사전 및 사후 시냅스 구획을 형성하는 무능력을 포함하여 중요한 신경 행동을 전시하는 데 실패하기 때문에, 자신의 관련성이 의심됩니다. 생리 그대로 연접 구획 부재에서 독소의 전체 범위 : 신경 세포의 상호 작용은 복제 될 수없고, 따라서 기능적 중독 측정은 5 불가능하다. 아니t은 놀라 울 정도로, 기계 론적 연구 또는 유도 된 신경 인성 세포주를 사용하여 BoNTs에 대한 약물 검사에서 생체 및 기본 신경 세포 연구 (6)과 일치하지 않는 결과로 이어질를 수행하려고 시도합니다. 이것은 세포 - 유래 중추 신경계 (CNS) 신경 세포를 배양 세포주 7-10의 유연성 차 뉴런의 관련성을 결합 본트 연구를위한 차세대 셀 기반 플랫폼을 제공 할 수있다 줄기 것이 제안되었다. 특히, 마우스 줄기 세포 유래 신경 세포 (하는 ESN)는 본트 / A- / G의 생리적 용량에 매우 민감하게 차동 persistences 활동 강화 중독 및 혈청 형을 포함하여 중독에 대한 생체 반응, 많은 복제하는 것으로 밝혀졌다 - 특정 효능 5,8,11. 이러한 동작은 본트 흡수, 처리, 인신 매매와 활동의 생체 메커니즘에하는 ESN에 보존되는 것이 좋습니다. 시냅스 activit의 그러나 억제Y는 보툴리누스 중독의 서명 표현이다, 따라서 탄소 나노 튜브에 의해 중독 다음 시냅스 활동의 손실을 입증하는하는 ESN은 CNT 연구를위한 생체 유래 세포 기반 모델에 적합한 지 판단하기에 앞서 필수적이다. 시냅스 활성에 탄소 나노 튜브와 중독 효과를 측정하기 위하여, 전체 세포 패치 - 클램프 전기 생리학은 비히클 - 처리 된 또는 처리 된 CNT DIV 21 + monosynaptic하는 ESN에 전류를 정량화하는 데 사용되었다. 우리는 본트 / A- / G 또는 텐트하는 ESN의 중독은 모든 경우에 20 시간 내에 시냅스 활동의&gt; 95 %의 손실이 발생했습니다. 본트 / A는 0.005 μM의 아래 검출 한계와 0.013 오후 IC (50) 값으로, 시냅스 활동에 용량 의존적 효과를 밝혀와 또한 특성은 중독 후 20 시간을 실시했다. 이러한 연구 결과는 중독의 전기 생리 검출 감도 및 시간 프레임이 상당히 유사한 면역 기반 아나보다 개선되어 있다는 것을 나타내시냅스 활성 신경 세포 배양 중독의 기능 측정이 더 민감한 특정하고 빠른 방법을 용이하게 할 수 있음을 입증하는 SNAP-25 분열의 생체 마우스 치사 분석에 lyses는 본트에 대한 세포 반응의 특성을합니다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">표 1. ESC 및 ESN</td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>10829-018</td><td>매체: ESC 배양 배지 제형 및 노트: 500 mL</td></tr><tr><td>100x MEM NEAA</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td>매체: 4 &deg에 보관; C 최대 1개월 제형 및 노트: 6 mL</td></tr><tr><td>200 mM L-Alanyl-L-Glutamine</td><td>ATCC</td><td>30-2115</td><td>6 mL</td></tr><tr><td>ES 인증 FBS</td><td>적용 줄기 세포</td><td>ASM-5007</td><td>90 mL</td></tr><tr><td>100x 항생제</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td>3 mL</td></tr><tr><td>55 mM 2-메르캅토에탄올</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td>1.1 mL</td></tr><tr><td>107 단위/mL LIF</td><td>밀리포어</td><td>ESG1107</td><td>60 &mu; L</td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>10829-018</td><td>매체: ESC 분화 매체 제형 및 노트: 436.6 mL</td></tr><tr><td>100x MEM NEAA</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td>매체: 4 &deg에 저장; C 최대 1개월 제형 및 노트: 5 mL</td></tr><tr><td>200 mM L-Alanyl-L-Glutamine</td><td>ATCC</td><td>30-2115</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>ESC 인증 혈청</td><td>적용 줄기 세포</td><td>ASM-5007</td><td>50 mL</td></tr><tr><td>100x 항생제</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td>2.5</td></tr><tr><td>mL 55 mM 2-메르캅토에탄올</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td>0.9 mL</td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>배지: NPC 트립신화 매체 제형 및 노트: 100 mL</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA (18.3%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3690</td><td>미디어: 5 mL 분 제형 및 노트에 동결: 0.266 mL</td></tr><tr><td>트립신</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8802</td><td>50 mg</td></tr><tr><td>폴리에틸렌이민(PEI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3143</td><td>매체 : 표면 코팅 솔루션 제형 및 참고 : 2.5 & 마이크로; H20</td></tr><tr><td>폴리-D-라이신(PDL)</td>의 g/mL <td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280</td><td>미디어: 1 wk 이내 사용 제형 및 노트: 100 & 마이크로; H20의 g/mL</td></tr><tr><td>라미닌</td><td>시그마-알드리치</td><td>L2020</td><td>5 &마이크로; H20</td></tr><tr><td>DMEM/F12 + GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>10565-018</td><td>매체: NPC 배양 매체 제형 및 메모: 492.5 mL</td></tr><tr><td>100x N2 비타민</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>매체: 4 &°c에 보관; C 최대 1개월 제형 및 노트: 5 mL</td></tr><tr><td>100x 항생제</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td>2.5 mL</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Neurobasal A</td><td>Life Technologies</td><td>10888-022</td><td>미디어: ESN 배양 배지 제형 및 노트: 482.5 mL</td></tr><tr><td>50x B27 비타민</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>미디어: 4 &deg에 저장; C 최대 1 개월 제형 및 참고 : 10 mL</td></tr><tr><td>200 mM L-Alanyl-L-Glutamine</td><td>ATCC</td><td>30-2115</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>100x 항생제</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td>2.5 mL</td></tr><tr><td>5-fluoro-2'-deoxyuridine (5FDU)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503</td><td>미디어 : 2000x 유사 분열 억제제 -20 °C에서 분취 및 저장; C 제형 및 참고 : dd 150 mg 5FDU 및 350 mg uridine을 10 mL Neurobasal A. 멸균 필터, 분취 및 동결. ESN 배양 배지에서 2000x를 사용합니다.</td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Trypsin</td><td>Life Technologies</td><td>12605-010</td><td>매체: Miscellaneous Formulation and notes: RT</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>store at RT</td></tr><tr><td>soybean trypsin inhibitor (STI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6414</td><td>store at -20 &deg; </td></tr><tr>C<td>에탄올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>RT 아스</td></tr><tr><td>코르브산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4403</td><td>50:50 DMSO/에탄올 혼합물 5.7mL에 100mg 아스코르브산을 용해하여 100mM 스톡을 준비합니다.</td></tr><tr><td>레티노산(RA)</td><td>시그마-알드리치</td><td>R2625</td>는 <td>9mL 50:50 DMSO/에탄올에 15mg RA를 재현탁합니다. 100mM 아스코르브산 스톡 1mL를 보충합니다. 분취 및 -80 &deg;C에서 보관. 6개월 동안 안정적입니다.</td></tr><tr><td colspan="4">표 2. MIST</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71386</td><td>매체: 세포외 기록 완충액 최종 농도(mM): 58.44 MW: 140</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60135</td><td>매체: (ERB; pH = 7.3, 315 mO) 최종 농도(mM): 74.56 MW: 3.5</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3139</td><td>매체: 4°C에서 안정; 최소 6 mo. 최종 농도 (mM) : 119.98 MW : 1.25</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21115</td><td>최종 농도 (mM) : 110.98 MW : 2</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63069</td><td>최종 농도 (mM) : 95.21 MW : 1</td></tr><tr><td>D- 포도</td><td>당 Sigma-Aldrich</td><td>G8644</td><td>최종 농도 (mM) : 180.16 MW: 10</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td>최종 농도(mM): 238.3 MW: 10</td></tr><tr><td>K-글루콘산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1847</td><td>매체: 세포 내 기록 완충액 최종 농도(mM): 234.5 MW: 140</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71386</td><td>매체: (IRB; pH = 7.3, 320 mO) 최종 농도(mM): 58.44 MW: 5</td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td>매체 : 4 °C에서 안정; C 최소 6 mo. 최종 농도 (mM): 507.18 MW: 2</td></tr><tr><td>Li-GTP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5884</td><td>최종 농도 (mM): 523.18 MW: 0.5</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21115</td><td>매체: 4°C에서 안정; 최소 6 개월에 대한 C 최종 농도 (mM) : 110.98 MW : 0.1</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63069</td><td>매체 : 4 °C에서 안정; C 최소 6 mo. 최종 농도 (mM) : 95.21 MW : 1</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td>380.35</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td>매체 : 4 &deg에서 안정; C 최소 6 mo. 최종 농도 (mM): 238.3 MW: 10</td></tr><tr><td>bicuculline</td><td>Tocris</td><td>131</td><td>매체: 기타 최종 농도 (mM): 0.01 MW: 417.85</td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C239</td><td>최종 농도 (mM): 0.01 MW: 276.12</td></tr><tr><td>테트로도톡신</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8001</td><td>최종 농도 (mM): 0.005 MW: 645.74</td></tr><tr><td>BoNT/A--/G</td><td>메타생물학제</td><td>N/A</td><td>매체: 최종 농도(mM): TBD MW: 150,000</td></tr><tr><td>파상풍 독소</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3194</td><td>최종 농도(mM): TBD MW: 150,000</td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL-2</td><td>최종 농도(mM): N/A MW: N/A</td></tr><tr><td colspan="4">표 3. 장비 및 소프트웨어</td></tr><tr><td>MiniAnalysis (버전 6.0.7)</td><td>Synaptosoft, Inc.</td><td>N/A</td><td>이벤트 감지 소프트웨어</td></tr><tr><td>Igor Pro (버전 6.22A)</td><td>WaveMetrics</td><td>N/A</td><td>기록 시각화용 소프트웨어</td></tr><tr><td>Patchmaster</td><td>Heka</td><td>N/A</td><td>데이터 수집 소프트웨어</td></tr><tr><td>Olympus IX51 도립 현미경</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 매니퓰레이터</td><td>Sutter Instrument</td><td>MPC-365</td><td></td></tr><tr><td>패치 클램프 증폭기</td><td>Heka</td><td>ECB10USB</td><td></td></tr><tr><td>마이크로피펫 풀러</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>붕규산 모세관</td><td>Sutter Instrument</td><td>B150-86-10</td><td>Corning 7740</td></tr><tr><td>18mm 유리 커버슬립</td><td>Fisher</td><td>12-545-84</td><td></td></tr><tr><td>플라즈마 클리너</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>세포 여과기 (40 &micro; m)</td> <td>Fisher</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>Stovall Belly Dancer Shaker</td><td>Fisher</td><td>15-453-211</td><td></td></tr><tr><td>저 접착 접시</td><td>Fisher</td><td>05-539-101</td><td>Corning 3262</td></tr><tr><td>박테리아 접시</td><td>VWR</td><td>25384-302</td><td>100 x 15 mm</td></tr></tbody></table>

줄기의 네트워크 문화 생물 신경 독소의 기능 평가 중추 신경계 신경 세포가 유래

Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons

시냅스 대상 클로스 트리 디움 신경독 (탄소 나노 튜브)의 치료 기작 연구 기능 시냅스를 생성하고 중독에 생리적 반응을 거쳐 확장 성, 셀 기반 모델의 필요성에 의해 제한되고있다. 여기에서 우리는 효율적으로 시냅스 활성, 네트워크 뉴런의 정의 계통에 쥐의 배아 줄기 세포 (는 ESC)를 구별하는 간단하고 강력한 방법을 설명합니다. 8 일 분화 프로토콜에 따라, 마우스 배아 줄기 세포 유래 신경 세포 (하는 ESN)를 신속하게 표현하고 neurotypic 단백질을 구획 신경 세포의 형태학을 형성하고 고유의 전기적 반응을 개발할 수 있습니다. 억제 밸런스 : 차별화 후 18 일 (DIV 18)으로하는 ESN이 활성화 글루탐산과 γ - 아미노 부티르산 (GABA) ergic 시냅스와 흥분을 특징으로 응급 네트워크 동작을 나타낸다. 탄소 나노 튜브와 중독 기능적으로하여 일을 복제, 시냅스의 신경 전달을 길항 있는지 여부를 확인하려면전자의 보툴리누스 중독 또는 파상풍의 임상 양상에 대한 책임 병태 생리, 전체 셀 패치 클램프 전기 생리학은 파상풍 신경 독소 (텐트) 또는 보툴리눔 신경 독소에 노출하는 ESN 자발적 소형 흥분성 시냅스 후 전류 (mEPSCs) (본트)을 정량화하는 데 사용 된 생체 혈청 형 / A- / G. 모든 경우에, 20 시간하는 ESN 내 시냅스 활성의 거의 완전한 손실을 나타냈다. 변경 쉬고 막 잠재력과 고유 전기 반응에 의해 입증 된 바와 같이 술에 취한 뉴런, 가능한 남아 있었다. 또이 방법의 민감도를 특성화하기 위해, 시냅스 활성에 중독의 투여 량 - 의존적 효과 본트 / A 첨가 한 후 20 시간을 측정 하였다. 0.005 μM의 본트 / A와 중독은 0.013 (PM)의 평균 억제 농도 (IC 50)와, mEPSCs에 상당한 감소 결과. 중간 용량의 비교는 시냅스 억제 기능 측정이 빠르고, 더 구체적이고 SNARE보다 더 민감하다는 표시절단 분석법 또는 마우스 치사 분석. 이러한 데이터는 탄소 나노 튜브의 민감도와 특이도가 매우 높은 검출을위한 시냅스 결합, 줄기 세포 유래 신경 세포의 사용을 확인합니다.

우리는 (그림 1A에 설명) 마우스는 ESC에서 고순도의 줄기 세포 유래 신경 세포의 대량의 경제적 생산 8,11 수있는 분화 프로토콜을 개발했습니다. 이 방법은 재현성 정의 계통 12-14 뉴런 생성 개인적 및 상업적으로 입수 한 ESC 라인 차별화 년의 기간 동안 사용되어왔다. 이 프로토콜의 중요한 요소는 무 세포 현탁 배양 피더는 ESC (1) 적응을 포함한다; 현탁 배양 (2) 적절한 유지 관리; 회전 상태에서 (3) 차별화. 현탁 배양으로 전환 극적 ESC 시간과 유지 보수 비용을 감소시키고, 분화 이전에 피더 세포를 제거 할 필요성을 제거한다. 서스펜션 적응 다음, OCT3 / 4 식 (그림 1B-D 능성 마커의 발현을 변경하지 않는 서스펜션 적응을 나타내는, 적어도 30 통로를 통해 일치 </stroNG&gt;). 세포 수율이 지속적으로 통로 당 1 × 10 7 세포를 초과하면는 ESC는 신경 세포의 분화에 적합하다. 이것은 일반적으로 서스펜션 적응 후 열 단락 또는 이전에 정지 적응 하였다는 ESC의 해동 후 5 통로 내에서 발생합니다. 집계를 차별화 기계 회전도 증가 신경 세포 수율에 중요한 것으로 밝혀졌다. 회전 진탕의 첨가는 총 생존율을 증가시키고 0 DIV (도 1E)에 신경 전구 세포 (NPC들)의 수율 ~ 300 % 증가를 생성 슈퍼 골재 형성을 제거. 전형적인 차별화 DIV에서 3.5 × 10 (6)는 ESC로 시작 -8 생존 및 신경 세포가 될 것이다 대략 60 % 어느 DIV 0에서 115 × 106의 NPC를 생성합니다. 나머지 40 %는 비 신경 세포를 포함하고, 주로 0 DIV 사이 혈청 결핍에 의해 제거된다 - 신경교 퍼시스턴스 소수가 유사 분열 INH의 첨가에 의해 제거 될 수있다 1.DIV에서 ibitors는 2-4 또는 DIV (8) - (12) 도금 밀도 DIV 0 중요하다; 너무 띄엄 띄엄 도금 뉴런 2 주 이상 생존하지 않습니다. 도금의 일 이내에, 차별화 된 신경 세포는 신경 세포의 형태학을 전시 및 somatodendritic 마커 MAP2와 축삭 마커 타우 (그림 2A)로 neurotypic 단백질, 구획. DIV (14)에 의해 synapsin-1 + puncta에가 버렸네 형성을 암시 axodendritic 인터페이스에서 확인할 수있다. 이는도 7을 8,11 DIV 시냅스 이전 마커 단백질의 발현과 일치한다. 신경 세포의 형태학은 DIV (21)를 통해 성숙하는 시간 문화가 정교한 axodendritic 아버 큰 시냅스 puncta의 (그림 2A)를 전시하는 것을 계속한다. 적절하게 유지하면하​​는 ESN 도금 후 최소 4 주 동안 실행 가능하고 활성 상태로 유지됩니다. RNA 시퀀싱을 사용하여 세로 발현 프로파일 링은 신경 사양의 형태 학적 및 프로테옴 증거를 뒷받침11, 15를 성숙 거라고. 개발 진행의 대표 마커는 OCT3 / 4, 네 스틴, DCX, NeuN과 KCC2 (그림 2B)를 포함하여 단계 별 발현 양상을 보였다. DIV 0으로하는 ESN은 MAP2와 타우를 포함하는 신경 세포 고유의 구조 단백질, 풍부한 사본을 표명했다. 이전 연구 결과와 일관되게, 두 개의 신경 세포의 하위 유형에 대한 마커가 관찰되었다 : vGluT2 발현 후뇌 / 중뇌 글루타메이트 신경 세포와 GABA 성에서의 interneurons 8. 이에 대응하여, 글루타메이트와 GABA 성 마커의 다양한는 신경 전달 물질 방출에 필요한 사전 시냅스 SNARE 단백질을 포함 DIV 0 DIV 7 사이의 표현의 급격한 증가, 전시; 시냅스 후 반응에 필요한 신경 전달 물질 수용체; 비계 단백질은 시냅스 후 막에 수용체를 밧줄해야합니다. 뉴런은 DIV에 의해 DIV (14)과 자연 소형 흥분성 시냅스 후 전류에 의해 성숙 고유의 전기적 특성을 나타내는16 16. 시냅스 전달 (MIST) 분석의 측정 된 억제는 시냅스 활성에 중독 효과를 평가 하였다. 술에 취한 차량 처리 DIV 사이 24 +하는 ESN을 mEPSC 주파수를 비교함으로써, MIST는 시냅스 활동 (그림 3A)의 기능 억제를 기반으로 중독의 양적, 특정 측정을 제공합니다. MIST는 각 독소의 목욕 첨가 한 후 20 시간에하는 ESN에서 시냅스 활동에 본트 / A- / G 또는 텐트의 효과를 측정 하였다. 독소에 등가 농도로 첨가 이전에 10 배량 SNARE 단백질 절단 (11)의 면역 블롯 분석에 의해 결정되는 바와 같이, EC (50)의 값. 독소는 모두 차량의 제어 처리 5 % 미만 mEPSC 주파수를 감소시켰다. 시냅스 비율의 감소는 술에 취한하는 ESN이 패치를 적용 할 때부터, 사망 또는 변경 고유 응답을 셀에 기인하지 않았다 반복되는 활동 전위를 해고및 전류 주입에 대한 응답으로 막 전위 (그림 3B, C)를 휴식에 큰 변화를 나타내지 않았다. 탄소 나노 튜브, 탐지 및 평균 억제 농도의 한계 (IC 50)을 감지하는 기존의 방법에 MIST의 감도를 비교하기 위해하는 ESN로 본트 / A를 첨가 한 후 20 시간을 측정 하였다. 적은 0.005로 μM의 본트 / A에 의한 중독은 IC (50) 0.013 (PM)의 값 0.5시 (도 4a) 위의 시냅스 활동의 완전한 침묵으로, mEPSC 주파수에서 통계적으로 유의 한 감소를 생산했다. 이 IC (50) 값은 약 0.5 마우스 치명적인 단위 / ㎖, 그 MIST을 제안하는 것은 민감한 두 배 및 2에 본트 / A의 존재를 검출에 빠르게 MLA보다 4 배에 해당한다. SNAP-25 분열의 면역 측정 MIST 약 민감한 30 배임을 나타냅니다 오후 12시 38분 0.05 오후 감지 할 수있는 최소 용량의 EC (50) 값을 생성절단 SNARE 단백질 (그림 4B)의 면역 기반 탐지보다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52361/52361fig1.jpg" /> 그림 1. 서스펜션 적응하는 ESN은 mitotically 안정적으로 유지하고 능성의 마커를 표현한다. ESC 유지 보수 및 분화 (A) 도식. 레티노 산 (RA) 또는 백혈병 억제 인자 (LIF)의 유무 또는 +로 표시된다 -. 차 신경 세포 배양에 대한 시험 관내 (DIV)과 고전 발달 단계 (DS)에서 일 사이의 비교 (17)을 제공한다. R1, D3 및 C57BL / 6J ES 세포 라인 (B) 확산 속도는 현탁 배양 전환 후 5 구절에 의해 안정. (C) 데이터는 현탁 배양에서 25 구절을 통해 측정 된 R1, D3 및 C57BL / 6J ES 세포주에서 OCT3 / 4 식의 실질적인 변화를 입증하지 계측법 (흐름n은 각각 6). (D) 유로 5와 30 (검은 선) 사이에서 측정 된 현탁액 적응 R1 ESC 라인에 대한 일상적인 계대 동안 실제 세포 수율. 어떤 세포를 계대 동안 폐기되지 않는 경우 이론적 누적 수익률은 (빨간 선)되게됩니다. (E) 정적 (왼쪽) 또는 회전 상태 (오른쪽)에서 생산 DIV 0 골재의 밝은 필드 이미지. 로타리 조건은 응집없이 구형 집계를 생산 (P &lt;0.001 학생의 t-test를 이용하여 결정) NPC가 3 배를 얻을 수 증가 (11). *은 P &lt;0.05를 나타냅니다. 이 그림은 허바드 등. (11)에서 수정 된 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52361/52361fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52361/52361fig2.jpg" /> 그림 2. 형태 학적, 홍보신경 사양과 성숙의 oteomic 및 transcriptomic 증거 DIV 7에서 (A) 면역 세포 화학 -. DIV (49)는 신경 arborization 및 axodendritic 인터페이스에서 시냅스 puncta의의 모습을 보여줍니다. 축삭이 타우 (녹색)으로 표시되며, 수상 돌기가 MAP2 (적색)로 표시되어, 미리 시냅스 구획 synapsin (흰색)으로 표시하고 있으며, 핵은 DAPI (파란색)로 염색한다. (B) 발달 단계 - 특이 적 발현을 설명하고 신경 세포의 서브 타입을 지정하는 대표적인 유전자의 종 발현 프로파일 링. 모든 유전자 성적표는 셀 당 성적 증명서의 대략적인 숫자로 표현된다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52361/52361fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52361/52361fig3.jpg" /> 그림 3.하는 ESN에서. 본트 / AG 천막에 노출되었을 때 시냅스 활성의 억제를 이동 (A)하는 ESN에서 대표 흔적 목욕 첨가 한 후 20 시간 수집 ~ 10 × EC 본트 / A의 50 값 - / G, 텐트 또는 차량. 각각의 신경 독소 컨트롤에 비해 이상 95 %에 의해 시냅스 활동을 감소시켰다. &gt; N (B) 비음 주군 뉴런 (본트 / A 시연 있지만, 모든 음주 문화에서 관찰)와 (C)는 C (잠재적 인 부정적 휴식 막에 어떤 변화를 나타내지 않았다 전류 주입을 탈분극에 대한 응답으로 반복 AP를 발사 할 수 남아 각각의 치료를 위해 18). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52361/52361fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52361/52361fig4.jpg" /> 본트 / 안개의 감도 그림 4. 결정은 처리하는 ESN. (A) 본트 / 목욕 첨가 한 후 시냅스 활동 20 시간의 MIST 측정. 주제 전압 클램프 추적 세그먼트 본트 / A 노광 (왼쪽)은 다음 mEPSC 주파수의 감소를 나타냈다. mEPSC 주파수의 정량 (막대 그래프, 오른쪽, n은 컨트롤 = 20; 11 명 - 각 용량에 대한 22) mEPSC 주파수의 용량 의존적 감소를 확인합니다. 중앙값 저지 농도는 네 매개 변수 슬로프 (&gt; 0.91 R 2)를 사용하여 비 - 선형 회귀 적합 최소 제곱 법으로 결정 하였다. 하는 ESN에 안개가 검출 한계 참고 적어도 0.005 분. (B) 본트 / SNAP-25의 절단에하는 ESN 결과 중독 겔 이동성의 변화에 의해 같은 시각 (오른쪽 SNAP-25 분열의 막대 그래프 표시 정량으로 왼쪽에있는 대표적인 서양 얼룩을, N = 4) . 엔드 포인트로 SNARE 단백질 절단 (SNAP-25)를 사용하여 감소 감도를 참고 (EC 오후 12시 36분 50) 대 </em&gt; MIST (0.013 오후 IC 50). *는 P &lt;0.05을 나타낸다; ***는 P &lt;0.001을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52361/52361fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

마우스 ES 세포를 기능적 시냅스와 창발적 네트워크 행동을 나타내는 매우 순수한 뉴런의 정의된 집단으로 구별하기 위한 사용자 정의 프로토콜이 설명됩니다. 전기생리학적 분석은 보툴리눔 신경독소 혈청형/A-/G 및 파상풍 신경독에 노출된 후 시냅스 전달의 상실을 보여줍니다.

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, ...

본 절차의 목적은 마우스 배아줄기세포 유래 신경세포 네트워크 배양에서 클로스트리디움 신경독소(Clostridial neurotoxins)가 시냅스 전달에 미치는 영향을 정밀하게 측정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 배아줄기세포를 피더 세포가 없는 부유 배양 조건에 적응시키고, 적응된 세포를 다능성 상태로 유지합니다. 두 번째 단계는 4-4 분화 기법의 변형 방식을 사용하여 부유 적응된 줄기세포를 신경세포 또는 ESN로 분화시키는 것입니다.다음으로, 시냅스 활성 네트워크 뉴런으로의 성숙을 촉진하기 위해 ESN을 일련의 배지로 처리합니다. 마지막 단계는 ESN을 클로스트리디움 신경독소 또는 다른 신경독소로 처리하고, 전세포 패치 클램프 전기생리학(whole cell patch clamp electrophysiology)을 사용하여 단일 시냅스 활성에 미치는 영향을 측정하는 것입니다. 최종적으로, 연령 및 로트(lot)가 일치하는 대조군 뉴런을 기준으로 정규화된 전기생리학적 기록으로부터 단일 시냅스 활성의 자발적 생성 변화를 정량화하며, 이를 용량, 시간 또는 약물 처리와 같은 서로 다른 조건 간에 비교합니다.이 기술의 주요 장점은 ESN이 보툴리눔 독소증과 파상풍의 임상 증상을 유발하는 기능적 병리를 재현한 최초의 세포 기반 모델이라는 점입니다. 우리는 ESN이 스네어(snare) 단백질 절단 기반의 모든 클로스트리듐 신경독소에 매우 민감하며, 발현되는 네트워크 행동에서 자발적인 시냅스 활동을 보인다는 점을 발견했을 때 처음으로 이 방법의 아이디어를 얻었습니다. 시연 절차는 제 실험실의 기술자인 Megan Lyman 씨가 진행하겠습니다. 적응된 피더 세포 제거 현탁 배양액을 옮기는 것부터 시작하십시오.ESC 응집체를 15 mL 원추형 튜브에 옮기고, 응집체가 조밀한 펠렛 형태로 가라앉을 때까지 기다립니다. 응집체가 가라앉으면 세포 펠렛이 손상되지 않도록 주의하며 상층액을 흡입하여 제거합니다. 그다음 5 mL의 PBS를 가해 세포를 세척하고 100 ×g에서 2.5분 동안 원심분리합니다.PBS를 조심스럽게 흡입하여 제거한 후, trypsin 500 µL를 첨가하고 튜브를 여러 번 뒤집어 세포 펠릿을 부드럽게 분산시킵니다. 그런 다음 튜브를 37 °C 항온 수조에 넣고 3분 동안 배양합니다. 배양 시간이 지나면 튜브를 다시 조직 배양 후드로 옮기고, trypsin을 희석하기 위해 ESC 배지 500 µL를 첨가합니다.그런 다음 P 1000 피펫을 사용하여 CEL 현탁액을 5~10회 반복 분주하여 단일 세포 현탁액을 만듭니다. 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 세포 수를 측정하고, 나머지 세포 현탁액을 200 ×g에서 3분 동안 원심 분리합니다. 상층액을 흡입하여 제거한 후, ESC 배지를 사용하여 세포를 1 × 10⁷ cells/mL의 최종 농도로 현탁합니다.다음으로, 현탁액 150 µL를 10 cm 박테리아 접시에 담긴 10 mL의 ESC 배지에 옮기고 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 배양합니다. ESC는 일반적으로 이 프로토콜을 사용하여 계대 배양됩니다. 일반적인 세포 계대 배양 과정 중에 48시간마다 ESC의 뉴런 분화가 시작됩니다.이전과 동일하게 ESC를 해리하되, 뉴런 분화용 플레이트를 추가로 준비합니다. 25 mL의 분화 배지가 들어 있는 10 cm 저부착 디쉬에 세포 현탁액 350 µL를 옮깁니다. 디쉬를 37 °C, 5% CO₂ 조건의 조직 배양 인큐베이터 내에서 30~45 RPM으로 설정된 오비탈 셰이커 위에 놓고 48시간 동안 배양합니다.48시간 후, 25 milliliter 피펫을 사용하여 분화 중인 세포 응집체를 50 milliliter 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 그 직후 페트리 접시에 25 milliliters의 신선한 분화 배지를 첨가합니다.응집체가 2~5분 동안 가라앉아 1~2mm 깊이의 가시적인 펠렛이 형성되도록 둡니다. 부유 상태로 남아 있는 단일 세포나 작은 응집체는 무시하고 배지를 조심스럽게 흡입하여 제거한 후, P 1000 피펫을 사용하여 세포 펠렛을 다시 페트리 접시로 옮깁니다. 접시를 인큐베이터 내의 회전 쉐이커에 다시 넣습니다.추가로 48시간이 지난 후, 배지 교체 절차를 반복합니다. 이때는 6 µM all trans retinoic acid가 첨가된 분화 배지 30 mL를 사용합니다. 세포를 배양한 후 형성된 펠릿의 두께는 2~4 mm가 됩니다.이전과 마찬가지로 레티노산(retinoic acid)을 보충하여 배지 교체 절차를 마지막으로 반복합니다. 다음 날 이 시점이 되면 펠릿의 깊이는 4~8mm가 됩니다. 플레이팅 당일 오후에 프로토콜의 서면 부분에 설명된 대로 플레이팅 표면을 준비하거나, 37°C에서 사전 코팅된 MPC 트립신 배지와 0.1% 대두 트립신 억제제를 각각 5mL씩 준비합니다.그런 다음 25 mL 피펫을 사용하여 분화 중인 응집체를 배양 플레이트에서 50 mL 원심 분리관으로 옮깁니다. 응집체가 가라앉도록 3~5분 동안 기다린 후, 펠렛이 흐트러지지 않게 주의하며 배지를 흡입하여 제거합니다. 다음으로 5~10 mL의 PBS로 펠렛을 세척하고 응집체가 다시 가라앉을 때까지 기다립니다.PBS를 흡입하여 제거하고 세척을 반복합니다. 두 번째 PBS 세척 후, 펠렛에 MPC 억제 배지 5 mL를 첨가하고 37°C에서 5분 동안 배양합니다.배양 중에 튜브를 두세 번 가볍게 쳐줍니다. 다음으로, 세포에 0.1% soybean trypsin inhibitor 5 mL를 첨가하고 튜브를 뒤집어 빠르게 혼합합니다. 그 후 10 mL 피펫을 사용하여 세포가 비교적 균질한 현탁액이 될 때까지 10~15회 가볍게 트리투레이션(tritrate)합니다.50 mL 원뿔형 튜브 위에 놓인 40 또는 70 µm 세포 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 천천히 여과합니다. 현탁액이 모두 여과되면, 스트레이너에 남아 있는 세포를 씻어내기 위해 1 mL의 N2 배지를 필터에 가합니다. 세포 현탁액을 15 mL 원뿔형 튜브로 옮기고 200 ×g에서 6분 동안 원심분리합니다. 펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하며 배지를 흡입 제거한 후, 2 mL의 N2 배지로 트리투레이션(triturate)하고, N2 배지를 추가하여 최종 부피를 10 mL로 맞춥니다.200 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 배지를 흡입하여 제거하고 펠릿 세척 과정을 다시 반복합니다. 10 mL의 N2 배지에 펠릿을 현탁하여 재부유시킵니다.세포의 일부를 취해 혈구계수기로 수를 측정한 후, 원심분리를 다시 수행합니다. 세포를 N2 배지에 현탁하여 최종 농도를 1 × 10⁷ cells/mL로 맞추고, 150,000 ~ 200,000 cells/cm²의 밀도로 분주합니다. 이는 DIV -1에 준비하여 37 °C의 조직 배양 인큐베이터에 보관합니다.서면 프로토콜의 지침에 따라 ESN을 유지하십시오. 먼저, 보툴리눔 신경독소 혈청형 A를 ESN 배양액에 희석하여 최종 목표 농도의 100배가 되도록 하고 37°C로 가온합니다. 그 다음, 적절한 부피의 독소를 DIV 21 이상의 ESN 배양액에 첨가하십시오.배양 접시를 팽창시킨 후 원하는 시간에 인큐베이터로 되돌립니다. ESN 배양 배지를 포인트 흡입(point aspirate)하고 세포 외 기록 완충액(extracellular recording buffer) 또는 ERB로 2회 세척합니다. 그 후, 활동 전위를 차단하기 위한 5 $\mu$M 테트로도톡신(tetrodotoxin)과 GABA$_A$ 수용체 활성을 길항하기 위한 10 $\mu$M 비콜린(bicuculline)이 첨가된 ERB 4mL를 가합니다.다음으로, 디시를 전기생리학 장치로 옮깁니다. 시냅스 전달 억제 측정 또는 mist 분석 시에는 관류나 온도 조절이 필요하지 않습니다. 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 저항값이 5~10 MΩ인 붕규산염 피펫을 제작한 후, 세포 내 기록 버퍼를 피펫에 역충전합니다.그런 다음 피펫을 실리콘 시약에 살짝 담급니다. 기록용 피펫을 전극 홀더에 고정하고, 전극 홀더와 연결된 튜브에 공기가 채워진 시린지를 부착합니다. 시린지를 통해 일정한 양압을 가하면서 기록용 피펫을 ERB 내부로 내립니다.기록 대상 뉴런의 SOR에 기록용 피펫을 조심스럽게 접촉시킨 후, 주사기의 씰을 해제하여 양압이 형성되었는지 확인합니다. 주사기를 다시 연결하고 조심스럽게 흡입하여 지속적인 음압을 가함으로써 기가옴 씰(giga ohm seal)을 형성합니다.기가옴 밀봉(giga ohm seal)이 형성되면 유지 전압을 -70 mV로 낮춥니다. 그런 다음 시린지를 사용하여 음압의 짧은 펄스를 조심스럽게 가해 whole-cell 구성으로 전환합니다. 패치가 안정적인지 확인하기 위해 30초 동안 커패시턴스 스파이크를 모니터링합니다.HEA 소프트웨어에서 커패시턴스 스파이크(capacitance spikes)를 취소하고 커런트 클램프(current clamp) 모드로 전환하여, 액간 전위(liquid junction potentials) 보정 없이 휴지 막전위를 모니터링하고 기록하십시오. 휴지 막전위는 -67에서 -82 mV 사이일 수 있습니다. 게인을 2 mV/pA로 조정하십시오.전압 클램프 모드로 전환하고 3~5분 동안 -70 mV로 연속 기록하여 소형 흥분성 포스트 시냅스 전류를 검출합니다. mini analysis의 AMPA 수용체 EPC 기본 설정을 사용하여 기록된 3~5분 분량의 데이터를 분석해 me PSC를 검출하고, 검출된 이벤트 정보를 수집하여 저장합니다. 각 노출 조건에 대해 8~12개의 대조군과 8~12개의 보툴리눔 신경독소 처리 시료의 M-E-P-S-C 빈도를 수집합니다.연령 및 로트가 일치하는 대조군과 비교하여 빈도를 분석한 다음, div 7에서 div 49까지 적절한 통계 테스트를 사용하여 시냅스 활동의 억제 백분율에 대한 통계적 유의성을 결정하십시오. ESN은 신경 친화성 구획을 발현하고 시냅스 천공을 형성합니다. Taxo 수지상 인터페이스. ESN은 보툴리눔 신경독소 혈청형 A, TG 및 파상풍 독소에 노출되었을 때 시냅스 활동의 억제를 겪습니다.ESN에서 얻은 이 대표적인 트레이스들은 보툴리눔 신경독소 혈청형 A, 파상풍 신경독소 또는 대조군(vehicle)을 처리하고 20시간 후에 수집되었습니다. 각 신경독소는 대조군과 비교하여 시냅스 활성을 95% 이상 감소시켰습니다. 다음 네 개의 이미지는 보툴리눔 신경독소 혈청형 A를 처리한 ESN에서 단일 시냅스 활성을 측정하는 데 있어 mESC를 사용하는 것의 민감도를 보여줍니다.첫 번째 이미지는 보툴리눔 신경독소 A형을 배양액에 첨가하고 20시간 후에 측정한 시냅스 활성의 대표적인 트레이스를 보여줍니다. 전압 클램프 트레이스 세그먼트에서 보툴리눔 신경독소 A형 노출 이후 M-E-P-S-C 빈도가 감소하는 것이 나타났습니다. 이 이미지는 M-E-P-S-C 빈도의 정량화를 보여주며, M-E-P-S-C 빈도가 농도 의존적으로 감소함을 확인해 줍니다. 반-최대 억제 농도는 4-매개변수 가변 기울기를 이용한 비선형 회귀의 최소 제곱법 적합을 통해 결정되었습니다. SNS 내의 검출 한계는 최소 0.005 picaMolar임을 참고하십시오.이 막대 그래프는 웨스턴 블롯으로 측정한 SNAP 25 절단의 사이토메트리 정량을 보여줍니다. 독성 지표로서 스네어(snare) 단백질 절단의 민감도가 낮다는 점에 유의하십시오. mist와 비교하여, 단일 별표는 P 값이 0.05 미만임을 나타냅니다.별표 세 개(***)는 P 값이 0.001 미만임을 나타냅니다. 이러한 결과는 줄기세포 유래 뉴런의 네트워크 집단이 클로스트리듐 신경독소 중독의 생리학적으로 유의미한 세포 기반 모델을 제공한다는 것을 입증합니다. SNS의 사용은 마우스 치사율 분석을 대체하는 적절한 수단으로서 동물의 고통과 사망을 크게 줄일 것으로 기대되며, 속도, 특이성 및 민감도 향상이라는 추가적인 이점 또한 제공합니다.이 기술은 신경독성학 분야의 연구자들이 뉴런 네트워크 활동 기반의 중간 처리량 스크리닝 기술을 활용하여 클로스트리디움 신경독소(clostridial neurotoxins)의 치료제 스크리닝 및 독소 검출을 용이하게 할 수 있는 길을 열어줍니다.

functional-evaluation-biological-neurotoxins-networked-cultures-stem

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 문서는 소설 프로토콜 및 시약 높은 컨텐츠 분석을 사용하여 뉴런과 astrocytes의 공동 문화 화합물과 치료의 neurotoxic 효과 민감한 측정을위한 설정에 대해 설명합니다. 결과는 높은 컨텐츠 분석 neurotoxicity 평가에 대한 흥미 진진한 소설 기술을 대표하는 것을 보여줍니다.

Neurotoxicity 높은 컨텐츠 분석의 연결 및 Astrocyte 공동 문화 분석

이 비디오는 신경독에 노출된 후 배아 줄기 세포 유래 뉴런의 전기생리학적 분석을 보여줍니다. 이러한 뉴런을 보툴리눔 신경독소로 처리하면 자발적인 소형 흥분성 시냅스 후 전류의 빈도가 감소하여 시냅스 전달의 억제를 확인할 수 있습니다.

소형 흥분성 시냅스후 전류(mEPSC)에 대한 독소 노출의 억제 효과를 평가하는 기술

이 비디오는 배아 줄기 세포를 기능하는 시냅스를 가진 뉴런의 네트워크 집단으로 분화하는 기술을 보여줍니다. 배아 줄기 세포가 뉴런으로 분화하고, 뉴런 네트워크 형성을 유도하고, 네트워크 뉴런으로 배양을 풍부하게 하는 단계를 간략하게 설명합니다.

마우스 배아 줄기세포를 네트워크화된 뉴런 집단으로 분화(Differentiating Mouse Embryonic Stem Cells into a Networked Neuron Population)

이 비디오는 플루오레세인 디아세테이트(FDA)와 프로피듐 요오드화물(PI)을 사용한 이중 염색을 사용하여 소뇌 과립 뉴런과 신경교세포의 혼합 배양에서 뉴런을 식별하는 방법을 보여줍니다.

이중 염색을 통한 소뇌 뉴런 배양에서 신경 세포 생존력 평가

개선된 체외 신경독성 분석은 새로운 신경보호 화합물을 식별하는 데 도움이 될 것입니다. 신경 세포주에서 세포 독성 및 세포 보호를 결정하고 두 번째 메신저 경로의 관여를 설명하여 신경 보호 메커니즘에 대한 통찰력을 얻기 위한 실시간 임피던스 기반 세포 분석기의 유용성을 제시합니다.

신경 세포주에 신경 독성과 신경에 관여하는 분자 진학의 윤곽을하는 도구로 실시간 임피던스 기반의 세포 분석기

프로토콜은 인간 배아 줄기 세포 및 사체 연구에 기초하여 두 개의 시험관 발생 독성 시험 시스템 (UKK 및 UKN1)를 설명한다. 테스트 시스템은 인간 발생 독성 위험을 예측하고, 동물 연구, 비용 및 화학 물질의 안전성 검사에 필요한 시간을 단축에 기여할 수있다.

화학 물질 안전 검사 및 시스템 생물학 데이터 생성을 위해 발생 독성 시험 법을 바탕으로 인간 다 능성 줄기 세포

본 논문에서는 로봇 신체와의 지속적인 상호작용 중에 정보 처리(즉, 코딩 및 디코딩)와 뉴런 어셈블리의 학습을 연구하는 폐쇄 루프 실험을 수행하기 위한 실험적 프레임워크를 제시합니다.

폐쇄 루프 신경 로봇 실험은 신경 네트워크의 전산 등록을 테스트하는

인간 유도 다 능성 줄기 세포 (hiPSCs)는 약물 및 화학 스크리닝 및 신경 독성을 포함한 독성 시험을위한 새로운 시험 관내 모델 개발을위한 강력한 도구로 간주됩니다. 여기, hiPSCs의 뉴런과 glia 로의 차별화에 대한 자세한 프로토콜이 설명되어 있습니다.

인간 독성 Pluripotent 줄기 세포의 신경 독성 테스트를위한 뉴런과 Glia의 혼합 문화로의 분화를위한 프로토콜

제시된 프로토콜은 작은 분자 화합물의 neurite 아웃성장 분석 및 신경 독성 평가를 위한 방법을 설명합니다.

인간 신경 전구 세포 유래 뉴런을 가진 Neurite 아웃growth 분석 및 신경 독성 평가

생체내 bioluminescence과 자기 공명 영상에서 (I), 그리고 (ii) 해부 histological 분석 :이 문서를 사용하여 쥐 두뇌에있는 세포 이식의 multimodal 이미징을위한 이벤트를 최적화된 순서를 설명합니다. 하나의 동물에서 이러한 이미징 modalities를 결합하면 높은 해상도, 민감도와 특이성과 세포 이식 평가를하실 수 있습니다.

마우스의 중추 신경계에서 줄기 세포 주입의 Multimodal 이미징

배우세요 마우스 배아 줄기세포에서 뉴런으로 분화시키고 Clostridial 신경독소가 시냅스 전달에 미치는 영향을 전기생리학으로 정량화하는 방법을. 이 기법은 보툴리즘과 파상풍 병리 연구에 활용됩니다.

줄기의 네트워크 문화 생물 신경 독소의 기능 평가 중추 신경계 신경 세포가 유래

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