줄기의 네트워크 문화 생물 신경 독소의 기능 평가 중추 신경계 신경 세포가 유래

이 절차의 목표는 마우스 배아 줄기 세포에서 유래한 뉴런의 네트워크 배양에서 클로스트리듐 신경독이 시냅스 전달에 미치는 영향을 정확하게 측정하는 것입니다. 이는 먼저 배아 줄기 세포를 공급세포가 없는 현탁액 배양에 적응시키고 적응된 세포를 만능 상태로 유지함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 4가지 4가지 분화 기법의 변형을 사용하여 현탁액에 적응된 줄기세포를 뉴런 또는 ESN으로 분화

다음으로, ESN은 시냅스 활성 네트워크 뉴런으로의 성숙을 촉진하기 위해 일련의 매체로 처리됩니다. 마지막 단계는 클로스트리듐, 신경독 또는 기타 신경독으로 ESN을 치료하고 전세포 패치 클램프 전기생리학을 사용하여 모노 시냅스 활성에 미치는 영향을 측정하는 것입니다. 궁극적으로, 모노 시냅스 활성의 자발적 생산의 변화는 연령 및 로트 일치 대조 뉴런으로 정규화된 전기생리학적 기록에서 정량화되고 용량, 시간 또는 약물 처리와 같은 다양한 조건 간에 비교됩니다.

이 기술의 주요 장점은 ESN이 보툴리누스 중독과 파상풍의 임상 증상을 담당하는 기능적 병리학을 복제하는 최초의 세포 기반 모델이라는 것입니다. 우리는 ESN이 올가미 단백질 절단을 기반으로 하는 모든 클로스트리듐 신경독에 매우 민감하고 창발적 네트워크 행동에서 자발적인 시냅스 활성을 보여주었다는 것을 발견했을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸습니다. 절차를 시연하는 것은 제 실험실의 기술자인 Ms.Megan Lyman이 채택된 피더 무세포 현탁액 배양을 옮기는 것으로 시작합니다.

ESC는 15 밀리리터 원뿔형 튜브에 응집체를 형성하고 응집체가 소형 펠릿으로 침전되도록 합니다. 응집체가 침전되면 세포 펠릿을 방해하지 않도록 주의하면서 SUP natant를 흡인합니다. 그런 다음 PBS 5ml를 첨가하여 세포를 세척하고 100배 G에서 2.5분 동안 원심분리합니다.

PBS를 조심스럽게 흡인한 다음 500마이크로리터의 트립신을 첨가하고 튜브를 여러 번 뒤집어 세포 펠릿을 부드럽게 파괴합니다. 그런 다음 튜브를 섭씨 37도의 수조에 넣고 3분 동안 배양합니다. 배양 시간이 경과한 후 튜브를 조직 배양 후드로 되돌리고 500마이크로리터의 ESC 배지를 추가하여 트립신을 희석합니다.

그런 다음 P 1000 파이펫으로 CEL 현탁액을 5-10회 반복하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다. 혈구, 세포분석기를 사용하여 세포의 eloqua를 세고 3분 동안 200배 G에서 세포 현탁액의 나머지 부분을 원심분리합니다. supinate를 흡인 한 후, 우리는 세포를 1 배 센트의 최종 농도로 현탁시키며, 이는 ESC 배지로 밀리리터당 7 개의 세포입니다.

다음으로, 10cm 박테리아 접시에 150 마이크로리터의 현탁액을 10 밀리리터의 ESC 배지로 옮기고 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 배양합니다. E ESC는 이 프로토콜을 사용하여 일상적으로 통과됩니다. 48시간마다 배아줄기세포가 뉴런으로 분화되는 것은 일상적인 세포 통과 중에 시작됩니다.

이전과 같이 배아줄기세포를 해리하되 신경세포 분화를 위한 추가 플레이트를 포함합니다. 350마이크로리터의 세포 현탁액을 25ml의 분화를 포함하는 10cm 낮은 부착 접시로 옮깁니다. 보통. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%의 조직 배양 인큐베이터 내부에 30-45RPM으로 설정된 오비탈 셰이커에 접시를 놓고 48시간 동안 배양합니다.

48시간 후 25ml 피펫을 사용하여 분화 세포 응집체를 50ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 직후 25 밀리리터의 신선한 차별화를 추가하십시오. 페트리 접시에 중간.

응집체가 2-5분 동안 가라앉도록 하여 1-2mm 깊이의 눈에 보이는 펠릿을 생성합니다. 현탁액에 남아 있는 단일 세포 또는 작은 응집체를 무시하고 배지를 조심스럽게 흡인하고 P 1000 피펫을 사용하여 세포 팔레트를 Petri 접시로 다시 옮깁니다. 접시를 인큐베이터의 회전식 셰이커에 다시 넣습니다.

48시간 후에 미디어 교체 절차를 반복합니다. 이번에는 30ml의 분화 배지에서 6 마이크로 몰의 모든 트랜스 레티노산이 보충되었습니다. 형성된 펠릿은 이제 세포를 배양한 후 2-4mm 깊이가 될 것입니다.

이전과 마찬가지로 마지막으로 레티노산 보충제로 배지 교체 절차를 반복합니다. 펠릿은 다음 날 이 시점에서 깊이가 4-8mm가 될 것입니다. 도금 당일 오후에 프로토콜의 서면 부분에 설명된 대로 도금 표면을 준비하거나 섭씨 37도에서 사전 코팅된 MPC 트립신 배지와 0.1% 대두 트리인 억제제를 각각 5ml씩 준비합니다.

그런 다음 25ml 피펫을 사용하여 배양 플레이트의 차별화된 응집체를 50ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 응집체가 3-5분 동안 가라앉을 때까지 기다린 다음 펠릿을 방해하지 않고 배지를 조심스럽게 흡입합니다. 다음으로, 5-10 밀리리터의 PBS로 펠릿을 세척하고 응집체가 가라 앉은 후에 세척하십시오.

PBS를 흡입하고 세척을 반복합니다. 두 번째 PBS 세척 후. 펠릿에 5 밀리리터의 MPC 화 배지를 첨가하고 5 분 동안 섭씨 37 도에서 배양합니다.

배양 중에 튜브를 두세 번 부드럽게 튕깁니다. 다음으로, 0.1% 대두 트립신 억제제 5ml를 세포에 첨가하고 반전하여 빠르게 혼합합니다. 그런 다음 비교적 균질한 세포 현탁액이 생성될 때까지 10ml 피펫으로 세포를 10-15회 부드럽게 삼중화합니다.

50ml 원추형 튜브 위에 놓인 40 또는 70 미크론 세포 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 천천히 여과합니다. 그런 다음 모든 현탁액이 1 밀리리터의 N 2에서 여과되면 여과기를 통해 나머지 세포를 세척하기 위해 필터에 매체를 넣습니다. 세포 현탁액을 15 밀리리터 원뿔형 튜브로 옮기고 200 회 G.N 2 매체의 2 밀리리터에서 펠릿 트리추레이트를 방해하지 않고 매체를 흡입 한 후 6 분 동안 원심 분리기를 10 밀리리터의 총 부피에 N 두 매체를 첨가하십시오.

200회씩 5분간 원심분리기를 사용합니다. G. 매체를 흡입하고 펠릿 세척 과정을 다시 반복합니다. 펠릿을 10 밀리리터의 N 2 매체에 현탁시키는 Resus.

세포의 부분 표본을 제거하고 혈류 세포 분석기로 계수한 다음 원심분리 Reese를 반복합니다. 밀리리터 당 7개의 세포에 1 곱하기 10의 마지막 농도에 N 2 매체에 있는 세포를 중단하고 150, 000에서 200 의 제곱 센티미터 당 000의 세포의 조밀도를 도금하십시오. 인디언은 DIV에서 1을 뺀 값으로 준비하여 섭씨 37도의 조직 배양 인큐베이터에 넣습니다.

서면 프로토콜의 지침에 따라 ESN을 유지 관리합니다. 먼저, 보툴리눔 신경독소 혈청형 A를 ESN 배양에서 원하는 최종 농도의 100배로 희석하고, 섭씨 37도까지 중온합니다. 그런 다음 DIV 21 및 ESN 배양에 적절한 양의 독소를 추가합니다.

배양 접시를 부풀리고 원하는 시간에 인큐베이터로 돌아갑니다. ESN 배양 배지를 점흡입하고 세포외 기록 완충액 또는 ERB로 2회 세척합니다. 그런 다음 5마이크로몰 테트로다톡신이 보충된 4밀리리터의 ERB를 첨가하여 활동 전위를 차단하고 10마이크로몰 이중 콜린을 첨가하여 가바 수용체 활성을 길항합니다.

다음으로, 접시를 전기 생리학 장비로 옮깁니다. 관류나 온도 제어는 시냅스 전달 또는 미스트 분석의 측정된 억제를 위해 필요하지 않습니다. 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 5-10 메가 옴의 저항을 가진 붕 실리케이트 피펫을 당긴 후 세포 내 기록 버퍼로 피펫을 다시 채웁니다.

그런 다음 피펫을 실리콘 시약에 부드럽게 담그십시오. 기록 피펫을 전극 홀더에 고정하고 전극 홀더에 이식된 튜브에 공기가 채워진 주사기를 부착합니다. 주사기를 통해 일정한 양압을 제공하는 동시에 기록 피펫을 ERB로 내립니다.

기록 피펫을 기록할 뉴런의 SOR에 부드럽게 착륙시킨 후. 주사기의 밀봉을 깨뜨려 양압을 확인하십시오. 주사기를 다시 연결하고 부드러운 흡기를 통해 지속적인 음압을 가하여 기가 옴 밀봉을 형성합니다.

기가 오메 씰이 형성되면 유지 전압을 마이너스 70밀리볼트로 줄입니다. 그런 다음 주사기를 사용하여 음압의 짧은 펄스를 조심스럽게 적용하여 전체 세포 구성을 깨뜨립니다. 커패시턴스 스파이크를 30초 동안 모니터링하여 패치가 안정적인지 확인합니다.

HEA 소프트웨어에서 커패시턴스 스파이크를 취소하고 전류 클램프 모드로 전환하여 액체 접합 전위를 조정하지 않고 휴지 멤브레인 전위를 모니터링하고 기록합니다. 휴지 막 전위는 영하 67 밀리 볼트에서 영하 82 밀리 볼트 사이 일 수 있습니다. 게인을 피코당 2밀리볼트로 조정 amp.

전압 클램프 모드로 전환하고 3-5분 동안 연속 마이너스 70밀리볼트 기록을 수행하여 미니어처 여기성 시냅스 후 전류를 감지합니다. 3분에서 5분 동안 기록된 데이터를 분석하여 미니 분석에서 AMPA 수용체 EPC의 기본 설정을 사용하여 PSC를 검출하고 감지된 이벤트에 대한 정보를 수집 및 저장합니다. 각 노출 조건에 대해 8-12개의 대조군과 8-12개의 보툴리눔 신경독 처리 샘플에 대한 M-E-P-S-C 주파수를 수집한 후.

연령 및 로트 일치 대조군에 대한 빈도를 분석한 다음 div 7에서 div 49까지 적절한 통계 테스트를 사용하여 시냅스 활동 억제 비율의 통계적 유의성을 결정하고, ESN은 신경성 구획을 발현하고 시냅스 천자를 형성합니다. 분류군 수지상 계면. ESN은 보툴리눔 신경독소, 혈청형, TG 및 파상풍 독소에 노출될 때 시냅스 활성이 억제됩니다.

ESN의 이러한 대표적인 미량은 보툴리눔 신경독소 혈청형, TG 파상풍, 신경독 또는 비히클의 목욕 에디션 20시간 후에 수집되었습니다. 각 신경독은 대조군에 비해 시냅스 활동을 95% 이상 감소시켰습니다. 다음 4개의 이미지는 보툴리눔 신경독소 혈청형(Botulinum neurotoxin serotype, A)에서 모노 시냅스 활성을 측정하기 위해 미스트를 사용하는 민감도를 보여줍니다.

이 첫 번째 이미지는 보툴리눔 신경독소 혈청형 A의 목욕 에디션 후 20시간 후 시냅스 활동의 누락된 측정에서 대표적인 흔적을 보여줍니다.전압 클램프 추적 세그먼트는 보툴리눔 신경독소 혈청형 A에 노출된 후 M-E-P-S-C 주파수의 감소를 나타냈습니다. 이 이미지는 M-E-P-S-C 주파수의 정량화를 보여주고 M-E-P-S-C 빈도의 용량 의존적 감소를 확인합니다. 중앙값 억제 농도는 4개의 매개변수 변수 기울기를 사용하여 비선형 회귀의 최소 제곱 적합치로 결정되었습니다. 참고로, SNS에서 미스트에 의한 감지 한계는 최소 0.005 picaMolar입니다.

이 막대 그래프는 웨스턴 블롯으로 측정한 SNAP 25 절단의 세포 분석 정량을 보여줍니다. 올가미 단백질 절단의 민감도 감소는 중독의 판독값으로 표시됩니다. 미스트와 비교하여 단일 별표는 P 값이 0.05 미만임을 나타냅니다.

삼중 별표는 P 값이 0.001 미만임을 나타냅니다. 이러한 발견은 줄기세포 유래 뉴런의 네트워크 집단이 클로스트리듐 신경독 중독의 생리학적으로 관련된 세포 기반 모델을 제공한다는 것을 보여줍니다. SNS의 사용은 속도, 특이성 및 민감도 향상이라는 추가 이점과 함께 마우스 치사율 분석의 적절한 대체품 역할을 함으로써 동물의 고통과 죽음을 크게 줄일 것으로 예상됩니다.

이 기술은 신경독성학 분야의 연구자들이 클로스트리듐 신경독에 대한 치료 스크리닝 및 독소 검출을 용이하게 하기 위해 뉴런 네트워크 활성을 기반으로 중간 처리량의 스크리닝 기술을 사용할 수 있는 길을 열어줍니다.