줄기의 네트워크 문화 생물 신경 독소의 기능 평가 중추 신경계 신경 세포가 유래

본 절차의 목적은 마우스 배아줄기세포 유래 신경세포 네트워크 배양에서 클로스트리디움 신경독소(Clostridial neurotoxins)가 시냅스 전달에 미치는 영향을 정밀하게 측정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 배아줄기세포를 피더 세포가 없는 부유 배양 조건에 적응시키고, 적응된 세포를 다능성 상태로 유지합니다. 두 번째 단계는 4-4 분화 기법의 변형 방식을 사용하여 부유 적응된 줄기세포를 신경세포 또는 ESN로 분화시키는 것입니다.

다음으로, 시냅스 활성 네트워크 뉴런으로의 성숙을 촉진하기 위해 ESN을 일련의 배지로 처리합니다. 마지막 단계는 ESN을 클로스트리디움 신경독소 또는 다른 신경독소로 처리하고, 전세포 패치 클램프 전기생리학(whole cell patch clamp electrophysiology)을 사용하여 단일 시냅스 활성에 미치는 영향을 측정하는 것입니다. 최종적으로, 연령 및 로트(lot)가 일치하는 대조군 뉴런을 기준으로 정규화된 전기생리학적 기록으로부터 단일 시냅스 활성의 자발적 생성 변화를 정량화하며, 이를 용량, 시간 또는 약물 처리와 같은 서로 다른 조건 간에 비교합니다.

이 기술의 주요 장점은 ESN이 보툴리눔 독소증과 파상풍의 임상 증상을 유발하는 기능적 병리를 재현한 최초의 세포 기반 모델이라는 점입니다. 우리는 ESN이 스네어(snare) 단백질 절단 기반의 모든 클로스트리듐 신경독소에 매우 민감하며, 발현되는 네트워크 행동에서 자발적인 시냅스 활동을 보인다는 점을 발견했을 때 처음으로 이 방법의 아이디어를 얻었습니다. 시연 절차는 제 실험실의 기술자인 Megan Lyman 씨가 진행하겠습니다. 적응된 피더 세포 제거 현탁 배양액을 옮기는 것부터 시작하십시오.

ESC 응집체를 15 mL 원추형 튜브에 옮기고, 응집체가 조밀한 펠렛 형태로 가라앉을 때까지 기다립니다. 응집체가 가라앉으면 세포 펠렛이 손상되지 않도록 주의하며 상층액을 흡입하여 제거합니다. 그다음 5 mL의 PBS를 가해 세포를 세척하고 100 ×g에서 2.5분 동안 원심분리합니다.

PBS를 조심스럽게 흡입하여 제거한 후, trypsin 500 µL를 첨가하고 튜브를 여러 번 뒤집어 세포 펠릿을 부드럽게 분산시킵니다. 그런 다음 튜브를 37 °C 항온 수조에 넣고 3분 동안 배양합니다. 배양 시간이 지나면 튜브를 다시 조직 배양 후드로 옮기고, trypsin을 희석하기 위해 ESC 배지 500 µL를 첨가합니다.

그런 다음 P 1000 피펫을 사용하여 CEL 현탁액을 5~10회 반복 분주하여 단일 세포 현탁액을 만듭니다. 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 세포 수를 측정하고, 나머지 세포 현탁액을 200 ×g에서 3분 동안 원심 분리합니다. 상층액을 흡입하여 제거한 후, ESC 배지를 사용하여 세포를 1 × 10⁷ cells/mL의 최종 농도로 현탁합니다.

다음으로, 현탁액 150 µL를 10 cm 박테리아 접시에 담긴 10 mL의 ESC 배지에 옮기고 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 배양합니다. ESC는 일반적으로 이 프로토콜을 사용하여 계대 배양됩니다. 일반적인 세포 계대 배양 과정 중에 48시간마다 ESC의 뉴런 분화가 시작됩니다.

이전과 동일하게 ESC를 해리하되, 뉴런 분화용 플레이트를 추가로 준비합니다. 25 mL의 분화 배지가 들어 있는 10 cm 저부착 디쉬에 세포 현탁액 350 µL를 옮깁니다. 디쉬를 37 °C, 5% CO₂ 조건의 조직 배양 인큐베이터 내에서 30~45 RPM으로 설정된 오비탈 셰이커 위에 놓고 48시간 동안 배양합니다.

48시간 후, 25 milliliter 피펫을 사용하여 분화 중인 세포 응집체를 50 milliliter 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 그 직후 페트리 접시에 25 milliliters의 신선한 분화 배지를 첨가합니다.

응집체가 2~5분 동안 가라앉아 1~2mm 깊이의 가시적인 펠렛이 형성되도록 둡니다. 부유 상태로 남아 있는 단일 세포나 작은 응집체는 무시하고 배지를 조심스럽게 흡입하여 제거한 후, P 1000 피펫을 사용하여 세포 펠렛을 다시 페트리 접시로 옮깁니다. 접시를 인큐베이터 내의 회전 쉐이커에 다시 넣습니다.

추가로 48시간이 지난 후, 배지 교체 절차를 반복합니다. 이때는 6 µM all trans retinoic acid가 첨가된 분화 배지 30 mL를 사용합니다. 세포를 배양한 후 형성된 펠릿의 두께는 2~4 mm가 됩니다.

이전과 마찬가지로 레티노산(retinoic acid)을 보충하여 배지 교체 절차를 마지막으로 반복합니다. 다음 날 이 시점이 되면 펠릿의 깊이는 4~8mm가 됩니다. 플레이팅 당일 오후에 프로토콜의 서면 부분에 설명된 대로 플레이팅 표면을 준비하거나, 37°C에서 사전 코팅된 MPC 트립신 배지와 0.1% 대두 트립신 억제제를 각각 5mL씩 준비합니다.

그런 다음 25 mL 피펫을 사용하여 분화 중인 응집체를 배양 플레이트에서 50 mL 원심 분리관으로 옮깁니다. 응집체가 가라앉도록 3~5분 동안 기다린 후, 펠렛이 흐트러지지 않게 주의하며 배지를 흡입하여 제거합니다. 다음으로 5~10 mL의 PBS로 펠렛을 세척하고 응집체가 다시 가라앉을 때까지 기다립니다.

PBS를 흡입하여 제거하고 세척을 반복합니다. 두 번째 PBS 세척 후, 펠렛에 MPC 억제 배지 5 mL를 첨가하고 37°C에서 5분 동안 배양합니다.

배양 중에 튜브를 두세 번 가볍게 쳐줍니다. 다음으로, 세포에 0.1% soybean trypsin inhibitor 5 mL를 첨가하고 튜브를 뒤집어 빠르게 혼합합니다. 그 후 10 mL 피펫을 사용하여 세포가 비교적 균질한 현탁액이 될 때까지 10~15회 가볍게 트리투레이션(tritrate)합니다.

50 mL 원뿔형 튜브 위에 놓인 40 또는 70 µm 세포 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 천천히 여과합니다. 현탁액이 모두 여과되면, 스트레이너에 남아 있는 세포를 씻어내기 위해 1 mL의 N2 배지를 필터에 가합니다. 세포 현탁액을 15 mL 원뿔형 튜브로 옮기고 200 ×g에서 6분 동안 원심분리합니다. 펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하며 배지를 흡입 제거한 후, 2 mL의 N2 배지로 트리투레이션(triturate)하고, N2 배지를 추가하여 최종 부피를 10 mL로 맞춥니다.

200 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 배지를 흡입하여 제거하고 펠릿 세척 과정을 다시 반복합니다. 10 mL의 N2 배지에 펠릿을 현탁하여 재부유시킵니다.

세포의 일부를 취해 혈구계수기로 수를 측정한 후, 원심분리를 다시 수행합니다. 세포를 N2 배지에 현탁하여 최종 농도를 1 × 10⁷ cells/mL로 맞추고, 150,000 ~ 200,000 cells/cm²의 밀도로 분주합니다. 이는 DIV -1에 준비하여 37 °C의 조직 배양 인큐베이터에 보관합니다.

서면 프로토콜의 지침에 따라 ESN을 유지하십시오. 먼저, 보툴리눔 신경독소 혈청형 A를 ESN 배양액에 희석하여 최종 목표 농도의 100배가 되도록 하고 37°C로 가온합니다. 그 다음, 적절한 부피의 독소를 DIV 21 이상의 ESN 배양액에 첨가하십시오.

배양 접시를 팽창시킨 후 원하는 시간에 인큐베이터로 되돌립니다. ESN 배양 배지를 포인트 흡입(point aspirate)하고 세포 외 기록 완충액(extracellular recording buffer) 또는 ERB로 2회 세척합니다. 그 후, 활동 전위를 차단하기 위한 5 $\mu$M 테트로도톡신(tetrodotoxin)과 GABA$_A$ 수용체 활성을 길항하기 위한 10 $\mu$M 비콜린(bicuculline)이 첨가된 ERB 4mL를 가합니다.

다음으로, 디시를 전기생리학 장치로 옮깁니다. 시냅스 전달 억제 측정 또는 mist 분석 시에는 관류나 온도 조절이 필요하지 않습니다. 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 저항값이 5~10 MΩ인 붕규산염 피펫을 제작한 후, 세포 내 기록 버퍼를 피펫에 역충전합니다.

그런 다음 피펫을 실리콘 시약에 살짝 담급니다. 기록용 피펫을 전극 홀더에 고정하고, 전극 홀더와 연결된 튜브에 공기가 채워진 시린지를 부착합니다. 시린지를 통해 일정한 양압을 가하면서 기록용 피펫을 ERB 내부로 내립니다.

기록 대상 뉴런의 SOR에 기록용 피펫을 조심스럽게 접촉시킨 후, 주사기의 씰을 해제하여 양압이 형성되었는지 확인합니다. 주사기를 다시 연결하고 조심스럽게 흡입하여 지속적인 음압을 가함으로써 기가옴 씰(giga ohm seal)을 형성합니다.

기가옴 밀봉(giga ohm seal)이 형성되면 유지 전압을 -70 mV로 낮춥니다. 그런 다음 시린지를 사용하여 음압의 짧은 펄스를 조심스럽게 가해 whole-cell 구성으로 전환합니다. 패치가 안정적인지 확인하기 위해 30초 동안 커패시턴스 스파이크를 모니터링합니다.

HEA 소프트웨어에서 커패시턴스 스파이크(capacitance spikes)를 취소하고 커런트 클램프(current clamp) 모드로 전환하여, 액간 전위(liquid junction potentials) 보정 없이 휴지 막전위를 모니터링하고 기록하십시오. 휴지 막전위는 -67에서 -82 mV 사이일 수 있습니다. 게인을 2 mV/pA로 조정하십시오.

전압 클램프 모드로 전환하고 3~5분 동안 -70 mV로 연속 기록하여 소형 흥분성 포스트 시냅스 전류를 검출합니다. mini analysis의 AMPA 수용체 EPC 기본 설정을 사용하여 기록된 3~5분 분량의 데이터를 분석해 me PSC를 검출하고, 검출된 이벤트 정보를 수집하여 저장합니다. 각 노출 조건에 대해 8~12개의 대조군과 8~12개의 보툴리눔 신경독소 처리 시료의 M-E-P-S-C 빈도를 수집합니다.

연령 및 로트가 일치하는 대조군과 비교하여 빈도를 분석한 다음, div 7에서 div 49까지 적절한 통계 테스트를 사용하여 시냅스 활동의 억제 백분율에 대한 통계적 유의성을 결정하십시오. ESN은 신경 친화성 구획을 발현하고 시냅스 천공을 형성합니다. Taxo 수지상 인터페이스. ESN은 보툴리눔 신경독소 혈청형 A, TG 및 파상풍 독소에 노출되었을 때 시냅스 활동의 억제를 겪습니다.

ESN에서 얻은 이 대표적인 트레이스들은 보툴리눔 신경독소 혈청형 A, 파상풍 신경독소 또는 대조군(vehicle)을 처리하고 20시간 후에 수집되었습니다. 각 신경독소는 대조군과 비교하여 시냅스 활성을 95% 이상 감소시켰습니다. 다음 네 개의 이미지는 보툴리눔 신경독소 혈청형 A를 처리한 ESN에서 단일 시냅스 활성을 측정하는 데 있어 mESC를 사용하는 것의 민감도를 보여줍니다.

첫 번째 이미지는 보툴리눔 신경독소 A형을 배양액에 첨가하고 20시간 후에 측정한 시냅스 활성의 대표적인 트레이스를 보여줍니다. 전압 클램프 트레이스 세그먼트에서 보툴리눔 신경독소 A형 노출 이후 M-E-P-S-C 빈도가 감소하는 것이 나타났습니다. 이 이미지는 M-E-P-S-C 빈도의 정량화를 보여주며, M-E-P-S-C 빈도가 농도 의존적으로 감소함을 확인해 줍니다. 반-최대 억제 농도는 4-매개변수 가변 기울기를 이용한 비선형 회귀의 최소 제곱법 적합을 통해 결정되었습니다. SNS 내의 검출 한계는 최소 0.005 picaMolar임을 참고하십시오.

이 막대 그래프는 웨스턴 블롯으로 측정한 SNAP 25 절단의 사이토메트리 정량을 보여줍니다. 독성 지표로서 스네어(snare) 단백질 절단의 민감도가 낮다는 점에 유의하십시오. mist와 비교하여, 단일 별표는 P 값이 0.05 미만임을 나타냅니다.

별표 세 개(***)는 P 값이 0.001 미만임을 나타냅니다. 이러한 결과는 줄기세포 유래 뉴런의 네트워크 집단이 클로스트리듐 신경독소 중독의 생리학적으로 유의미한 세포 기반 모델을 제공한다는 것을 입증합니다. SNS의 사용은 마우스 치사율 분석을 대체하는 적절한 수단으로서 동물의 고통과 사망을 크게 줄일 것으로 기대되며, 속도, 특이성 및 민감도 향상이라는 추가적인 이점 또한 제공합니다.

이 기술은 신경독성학 분야의 연구자들이 뉴런 네트워크 활동 기반의 중간 처리량 스크리닝 기술을 활용하여 클로스트리디움 신경독소(clostridial neurotoxins)의 치료제 스크리닝 및 독소 검출을 용이하게 할 수 있는 길을 열어줍니다.