Name: 마우스의 간단한 임계 크기의 대퇴 결함 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: 학습하세요 마우스 대퇴골 임계 결함 모델 수술법입니다. 외과용 강관으로 골수 핀을 제작하여 결함을 안정화하고 방사선 촬영 및 조직학으로 골 치유를 평가하는 방법을 익히세요.

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우리는이 기술의 개발 과정에서 자신의 귀중한 조언과 지원, 비교 의학, 사원, 텍사스의 스콧 &amp; 화이트 병원 부서의 직원과 수의사 감사합니다. 이 작품은 재생 의학 프로그램 자금 연구소, 스콧 &amp; 화이트 RGP 보조금 # 90172, NIH 2P40RR017447-07 및 NIH R01AR066033-01 (NIAMS)에 의해 부분적으로 투자되었다. 우리는 원고를 교정에 대한 박사 수잔 Zeitouni 감사합니다.

참고 :이 프로토콜은 잭슨 연구소에서 획득 한 여성 누드 (민 / J) 마우스 (1,825 G, 6 주)을 위해 설계되었습니다. 쥐의 변종은 해부학과 성장 속도면에서 다소 차이가 있기 때문에, 우리는 핀의 제조 라이브 주제에 주입하기 전에 수신자의 변형, 성별과 연령에 최적화하는 것이 바람직합니다. 균주 신중 일치하는 경우, 핀 및 골수 공동 사이의 억지 끼워 맞춤은 높은 재현성이다. 주택, 다이어트 및 일반 축산 절차는이 프로토콜의 범위를 벗어나 있지만, 모든 마우스는 기관 동물 관리 및 설정 실험실 동물의 관리 및 사용 (제 8 판), 제도적 정책의 가이드에 따라 보관 하였다 사용위원회 (IACUC)와 스콧 화이트 병원에서 비교 의학 교실 (DCM). 핀 1. 제작 <imgALT = &quot;그림 2&quot;SRC = &quot;/ 파일 / ftp_upload / 52368 / 52368fig2highres.jpg&quot;/&gt; 그림 2 : 핀 조립체. (A) 어셈블리의 여러 단계에서 수술 스틸 튜브와 5mm 두께의 gelfoam을 시트에서 4mm 직경의 실린더 컷의 사진. (B) 조립 핀 (위) 연마 후를, gelfoam을 실린더는 강 위에 위치, 트리밍 칼라 (중간), 건조 코팅 gelfoam을 멸균 핀 결과 멸균. 이는 손상 부위에서 세포 부착을 향상시키고 치유 (아래). (C) 수질 핀 장착 절제된 대퇴골의 방향을 유지한다. (D) 다양한 두께의 핀 조립체의 실시 예 및이 방법의 유연성을 보여주는 길이. 근위 및 원위 대퇴골의 단부 해면골 뼈 골수 핀의 상호 작용을 도시하는 핀 - 안정화 대퇴 결함 (E) μCT 재구성. <ol><li> 22 G 스테인리스 피하 튜브의 9mm 길이와 회전 공구에 장착 23.8 mm 직경의 유리 섬유 강화 무거운 의무 컷 - 오프 휠을 사용하여 19 G 튜브의 3mm 길이를 잘라. 튜브 (위의 그림 2A를) 고정 작은 뾰족한 펜치를 사용합니다. 적절한 눈 보호를 착용하고주의 회전 도구를 처리합니다. </li><li> 9mm 샤프트의 중간에 시아 노 아크릴 레이트 접착제를 소량 (약 10 μL)을 놓는다. 중앙에까지 9mm의 기둥 위에 3mm 칼라에 합격 균등과 샤프트 사이의 접착제를 배포하는 트위스트. 디지털 캘리퍼스 한 쌍의 치수를 측정하고 그림 1과 비교. 적어도 15 시간 (그림 2A, 센터)에 대해 설정할 수 있습니다. </li><li> 버 과도한 접착제를 제거하기 위해 220 그릿 에머리이 함유 된 디스크를 사용합니다. </li><li> 회전 공구를 사용하여, 연마 디스크 펠트를 사용하여 핀을 연마. </li><li> 탈 이온수로 씻어 COMPRE 건조ssed 공기. </li><li> 칼라에 대해 새로 만든 핀과 푸시의 샤프트를 통해 19 G 피하 무딘 바늘을 배치하여 테스트의 무결성. 칼라 무게 약 25g 저항 할 수 있는지 확인합니다. </li><li> 멸균 여과 인산염 완충 생리 식염수 (그림 2B, 상단)에있는 핀을 씻어. 핀의 축이 절단 된 뼈 (그림 2C)의 가장자리로 칼라 플러시 대퇴 골수 구멍에 꼭 맞는지 확인합니다. 연구와 수신자 (그림 2D)의 특정 목적을위한 프로토 타입 다양한 구성. 고정을 극대화하고 억지 끼워 맞춤 (그림 2E)을 개선하기 위해 핀의 끝이 골간의 소주 뼈에 침투 있는지 확인합니다. 참고 :이 맞는 라이브 마우스 (예를 들어 그림 2C)에 주입하기 전에 뼈 표본에서 테스트하는 것이 좋습니다. </li><li> 실린더를 잘라 4 mm 직경의 펀치 생검 커터를 사용하여수술 젤라틴 스폰지 5mm 두께의 시트에서. 3mm 길이 실린더를 잘라 내고 구멍 (아래 그림 2A를) 생성하는 실린더의 길이를 따라 20 G 피하 주사 바늘을 ​​통과하기 위해 메스를 사용합니다. 참고 : 우리의 결함 부위에서 젤라틴 또는 콜라겐 지지체의 위치가 셀 보유를 개선하고 뼈의 축선을 따라 종 방향의 성장을 유도하는 것을 발견 하였다. </li><li> 핀에 젤라틴 폼 실린더에 합격하여 15 psi에서 120 ° C에서 건조주기에 칼라 (그림 2B, 센터) 및 오토 클레이브와 맞춰집니다. 젤라틴 폼은 건조 (아래 그림 2B) 색상으로 어두워집니다. </li></ol> 2. 수술 기법 참고 : 다음 절차는 실험 동물의 관리 및 사용을위한 설명서 (제 8 판)에 의해 설정된 모든 지침을 관찰 기록됩니다. 모든 추가 정책을 준수하십시오로컬 IACUC에 의해 설정하고 다음 섹션을 진행하기 전에 장소에 (또는 동급) IACUC 승인 한 동물 사용 프로토콜을 확인합니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52368/52368fig3highres.jpg" /> 그림 3 : 수술 도구. (A) 외과 키트. 마이크로 드릴 (1)에있어서, 바퀴를 절단 (2) 흡수성 봉합사 (3), 외주 봉합사 (4), 메스 블레이드 (5), 메스 핸들 (6), 호에 싸서 멸균 수질 핀 (7)에 수질 깊이 게이지 만든 형태 피하 튜브 (8), 미세 코 집게 (9), 쥐 치아 포셉 (10), 무딘 리밍 바늘 (11), 바늘 드라이버 (12), 작은 지혈제 (13), 미세 가위 (14), 골막 엘리베이터 (15), 수정 컨 셉 (16) (B). 마우스에 대한 컨 스타일의 뼈 그립을 생산하는 데 필요한 수정. <ol><li> 를 통해 트래픽 수술 룸이나 깨끗한 실험실 폐쇄 문 및 더를 선택합니다. 적절한 작업 SURFAC을 소독임상 등급 급 기반의 살균제 청소기와 전자. </li><li> 일회용 멸균 장갑과 가운을 입고 있지만, 멸균 된 천으로 커튼과 소독 작업 표면에 약 60 X 90cm 2의 무균 영역을 설정합니다. 참고 : 조수가 외부 포장을 제거하고 필드를 설정하는 연구자에 멸균 자료를 제시해야하는 것이 좋습니다. </li><li> 드레이프에 따뜻한 물을 재 순환 장치에 장착 살균 가열 패드를 놓고 멸균 일회용 커튼 커버. 작동 온도 비드 살균기 따뜻한 (250-265 ° C가,이 30 분까지 소요). </li><li> 무균 영역에서 모든 구성 요소에 편리하게 액세스를 제공하기 위해 수술 키트 (그림 3A)를 배열합니다. 또한, 멸균 거즈 (2 × 2 인치 2), 멸균 면봉, 멸균 식염수 및 클로르헥시딘 / 이소 프로필 알코올 수술 살균제 어플리케이터 (V / w 0.9 %)를 포함하는 멸균 스틸 그릇 (500 ml)에 제공한다. </li><li> 작은 조립수의학 지침과 사용자 설명서에 따라 유도 챔버와 코 콘 어셈블리 멸균 필드 옆에 동물 마취 장치. 가스 공급 및 이소 플루 란, USP로 임상 수준의 산소를 사용합니다. </li></ol><img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52368/52368fig4highres.jpg" /> 그림 4 : 수술. (AC) 접근 및 대퇴골의 노출. (DE) 상승 및 인하. (FK) 리밍 및 수질 운하의 크기. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/52368/52368fig5highres.jpg" /> 그림 5 : 수술. 핀 (AB) 설치. (CD) 폐쇄. (E) 수술 후 올바른 위치에 핀 24 시간의 전형적인 이미지. <ol start="6"><li> 마취 시스템 및 Se 유도 챔버에 놓고 마우스t O 2 분 -1 및 2 L 3 % 이소 플루 란 농도 출력 (V / V). <ol><li> 마우스가 1 분 이내에 의식이 있는지 확인; 4 %로 농도를 상승 (v / v)로 필요한 경우. 아래에 위치 가열 패드 무균 영역에 마우스, 장소를 제거하고 코 콘을 적용합니다. 전송 제도적 정책에 따라 적절한 수술 비행기 콘에 흐름, 2.5 %로 이소 플루 란을 줄이고, 추가로 20 초 동안 기다린 테스트. 일반적으로, 부드럽게 압착 뒷다리 반사의 부족은 적절한 마취를 결정하기에 적합합니다. </li><li> 전체 과정에서 의식을 잃은 동안 산소의 적절한 수준을 보장하기 위해 강력한 규칙적인 호흡과 사지와 입 지역의 분홍색 착색 보조 모니터를 가지고있다. 수의학 지침과 제도적 정책 필요에 따라 마취를 조정합니다. 멸균 된 인공 눈물 윤활유 연고 (15 % (v / v)의 미네랄 오일, 83 %를 적용 (v / v)의 어눈에 ITE 바셀린). </li></ol></li><li> 새로운 일회용 드레이프를 위로 향하게 뒷다리 하나의면에 마우스를 켭니다. 필요한 경우, 전기 면도기 나 제모 크림으로 털을 제거합니다. 멸균 식염수 사이트를 닦은 초과 모피와 함께 추가 드레이프를 제거합니다. 모든 부분하지만 전체 뒷다리 (그림 4A)를 포함하지만, 착색과 호흡을 모니터링하는 얼굴과 발보기를 유지하기 위해 마우스를 통해 새로운 유창 드레이프를 놓습니다. </li><li> 대퇴골 근위부와 원위부 끝을 찾아 종축 (그림 4B)을 따라 5-10mm의 피부를 절개. 이두근 대퇴골과 광근 lateralis를 통해 대퇴골에 측면 접근 방식을 노출, # 15 메스 근막으로부터 피부 층을 분리합니다. 모두 근육의 격막 (이것은 근육의 분홍색 착색에 흰색 조직의 라인) 만나는 곳 찾습니다. 메스로 조심스럽게 intermuscular 경계까지 함께 해부대퇴골 (그림 4B)을 볼 수 있습니다. </li><li> 전체 골간 (그림 4C)을 노출되도록 단단한 골막 엘리베이터 절개를 개발한다. 내측 (그림 4D)의 후방 신경 혈관 다발을 보존하기 위해주의하면서 더 대퇴골의 중앙 2/3 노출 엘리베이터를 사용합니다. 부드럽게 멸균 Q - 팁 또는 이에 상응하는 부드러운 메스와 뼈의 오프 조직, 건조를 긁어. </li><li> 멸균 메스 또는 마커 캘리퍼스 필요한 경우와 표시가있는 대퇴골의 중심을 찾은 후 중심에서 근위 및 원위 1.5 mm를 표시합니다. 조심스럽게 뼈에 과도한 압력을 방지하기 위해 이전에 컨 스타일에서 유행 미세 코 집게의 쌍을 사용하여 대퇴골을 파악. 참고 : 수정에 대한 정확한 치수는 그림 (b)에 제공된다. 그것은 필요 압력을 깨뜨릴 수 없어 뼈를 보장하기 위해 사용하기 전에 안락사 표본에 집게를 테스트하는 것이 좋습니다절단 동안 고정 용 D. </li><li> 미세 다이아몬드 그릿 코팅 절단 휠 (8 mm 직경 X 0.1 mm 폭)가 장착 된 미세 드릴을 사용하여 (그림 4E) 아래 조직을 보호 할 수있는 엘리베이터가 첫 번째 컷을합니다. 단단히 3mm 세그먼트를 제거, 두 번째 컷을하기 위해선, 골간의 말단을 누른 상태에서 45 °로 절단 된 대퇴골을 제기. 참고 : 얼굴 보호는이 단계에서 권장합니다. </li><li> 집게로 고정 뼈, 조심스럽게 무딘 23 G 피하 주사 바늘로 양쪽 끝의 수질 충치를 리머. 19 G 튜브에 넣고 22 G 튜브의 길이로 만들어진 미리 만들어진 깊이 게이지를 사용하여 (그림 3a는, 내가 8 TEM), 리머 수질 캐비티의 깊이를 평가하고 3mm인지 확인합니다 (그림 4 층-K) . 수질 공동 22 G 깊이 게이지 저항 경우, 무딘 22 G 피하 주사 바늘 다시 리머. </li><li> 조심스럽게 다음 근위부 말단 수질 C로 수질 핀을 삽입avities 안정적인 3mm 간격 (그림 5A를, B) 원래 길이에서 다시 대퇴골을 가져오고 설정합니다. 필요한 경우, 대퇴골의 피질골과로드의 양호한 끼워 맞춤을 달성하기 위해 수동 응력의 소량을 적용한다. 핀이 양쪽의 수질 충치에 꼭 맞는 컷 뼈의 가장자리가 칼라가 일치하는지 확인합니다. 간극이있는 경우, 22 G 무딘 바늘을 다시 한번 리밍. </li><li> 핀에 근육과 주변 조직의 위치를 조정하고 연속 흡수 5-0 봉합 (그림 5C)를 닫습니다. 수술 접착제 (그림 5D)와 5-7 광장 매듭 나일론 5-0 봉합과 인감 닫기 피부 절개. </li></ol> 3. 수술 후 절차 <ol><li> 피부 절개를 닫은 후, 마취을 인출하지만, O 2 마우스가 움직이기 시작까지 유동 할 수있게 유지; 이 미만 1 분 소요됩니다. 마우스의 5 분 후 움직이지 남아있는 경우O 2 관리, 동물의 개입에 대한 제도적 정책을 참조하십시오. </li><li> 마우스가 움직이기 시작하면, 바람직하게는 부드럽게 건조 멸균 침구 함유 케이지로 전송. <ol><li> 각 장에 이글루 형 둥지를 놓고 마우스 움직임을 감소, 그것으로 후퇴 할 것이다. 마우스가 뒷다리 이동성을 의식 회복 후 5 ~ 10 분을 복구 있는지 확인합니다. </li><li> 기관의 정책에 따라 매일 수술 후 모니터링을 수행합니다. 첫 번째 5~7일을 위해 새장 바닥에 젤라틴 수분과 음식을 제공하고 제도적으로 승인 된 정책에 따라 통증과 수술 후 모니터링을 관리 할 수​​ 있습니다. 참고 : 우리는 관리 0.05-0.1 mg을 kg -1 회 처음 3 일 후 식염수를 피하 0.25 ㎖를,과 부 프레 노르 핀 (24) 마우스는 정상 유틸리티를 회복하지 않는 경우. </li></ol></li><li> 회복 후 24 시간 후, 운데 살아있는 동물 X 선 촬영을 수행R 마취 핀 배치 (그림 4E)을 시각화합니다. 핀이 탈구되면, 즉시 수정 수술을 고려한다. </li><li> 7 일 후 수술에서, 제도적 축산 정책에 따라 그룹으로 마취와 집에서 봉합사를 제거합니다. </li><li> 2~5주 후, 인도적으로 미국 수의학 협회에 따라 동물을 안락사 (25)에 대한 방법을 승인 안락사. 참고 : 시중에서 판매하는 바르비 투르 산염-조합 안락사 칵테일의 복강 내 주사가 효과적이고 인도적인, 그러나 안락사에 지역 기관 정책을 준수해야합니다. </li><li> 조심스럽게 근위 대퇴골 내측에서 골반을 노출하여 뒷다리를 멀리 해부하다. 메스와 비구 (엉덩이 소켓)에서 대퇴 골두를 분리하면서 조심스럽게 다리의 측면에서 안쪽으로 관절을 누릅니다. 해제, 날카로운 메스 또는 마이크로 가위로 근육과 피부에 남아있는 컷전체 다리는 골반을 형성한다. rongeurs이나 무거운 가위의 날카로운 쌍으로, 낮은 뒷다리 (경골 / 비골) 무릎 관절 아래 약 5mm를 잘라. 주 : 모든 시료 분석 이전에 동일한 방식으로 저장하는 것이 좋습니다. </li><li> 피부를 제거하지만, 자리에 근육을 둡니다. 1개월까지 이전 영상에 10 mM의 CaCl2를 보충 인산염 완충 생리 식염수에 저장 한 다음 일주 10 mM의 염화칼슘이 정착 보충 10 % 포르말린에 조직을 수정합니다. 4 ° C에서 고정 및 저장을 수행합니다. 또한, 즉시 고정하지 않고 표본을 검사합니다. </li></ol> 표본 4. 분석 참고 : 뼈의 치유는이 프로토콜의 범위를 벗어나는 방법의 다양한에 의해 평가 될 수있다. 다음은 우리가 성공적으로 견본 microCT (μCT) 화상 카메라를 사용하여 고용 한 방법이다. 그것은 다음과 같은 매개 변수가 아칸소 것이 좋습니다전자는 프로젝트의 특정 요구에 최적화 된, 처음에 테스트. <ol><li> 악기 챔버 내의 플라스틱 밀봉 막과 수직 위치를 박층에서 시편 감싸. 대퇴골 전체 스캔하는 동안 샘플 단계에 수직 있는지 확인합니다. 다음 매개 변수에 대한 검사를 설정하고, 전압 = 29 kV로, 현재 = 661 μA, 전력 = 19 W, 이미지 픽셀 크기 (μm의) = 21.00; 360도 회전 = 예; 프레임 평균 =에 (5); 에 회전 단계 (DEG) = 1.00, 랜덤 이동 =. 스캔 당 하나의 대상 폴더 (예를 들어 그림 6A)에 JPEG 파일로 이미지를 저장합니다. 참고 : 스캔은 57 분에 완료해야합니다. </li><li> 다음과 같은 파라미터에 기초하여 축 이미지를 생성하기 위해 재구성 소프트웨어를 사용할 수; 스무딩 = (4), 오정렬 보정 =에, 링 이슈 감소 = (5), 빔 경화 보정 (40 %)에, CS 회전 (DEG) = 0.00. 2,000-15,000 하운 스 필드 단위로 출력을 설정합니다. JPEG 파일로 이미지를 저장스캔 당 하나의 대상 폴더에. </li><li> 축 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여, 제 근위 및 원위의 원래 에지 결함을 설정하여 관심 영역 (ROI)의 영역을 정의한다. 만 칼라를 포함 섹션을 선택하여이를 얻을 수 있습니다. 칼라는 수질 핀보다 두꺼운 때문에,이 부분은 ​​쉽게 (왼쪽 그림 6B) 정의된다. (오른쪽 그림 6B) (100 μm의 이익률) 주위 배제 영역을 그리기 및 투자 수익 (ROI)에서 섹션의 각 영역을 전송하여 계산에서 칼라를 제외합니다. 주 : 이러한 새로운 뼈의 부피 (도 6C, D) 등의 관성, 3D 재구성 및 계산 극 모멘트 용이 소프트웨어를 사용하여 달성 될 수있다. </li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없습니다.

여기서, 우리는 표준 실험실 및 수의 장비를 이용하여 쥐 대퇴골의 임계 크기 핀 - 안정화 된 결함을 생성하는 간단한 방법을 설명한다. 핀과 수술 자체의 조립은 연습이 필요하지만, 잘 잘 훈련 된 생물 의학 연구 과학자 또는 수의사의 기능에 있습니다. 핀은 외고정 또는 연동 나사를 사용 더 복잡한 방법보다 절차가 기술적으로 가능하고, 추가로 고정하지 않고 뼈 속질에 위치한다. 약간의 비틀림 동작이 치유의 초기 단계 동안 발생할 수 있지만 임플란트 endosteum 사이 확고한 억지 끼워 맞춤을 달성하기 위하여,이 핀 지름 및 뼈 속질 적절한 리밍에주의하여 최소화된다. 근친 변형과 나이, 성별의 일치의 신중한 선택으로 적합 몇 일 이내에 재현성 강력한된다. 그럼에도 불구하고, 위스콘신3D 인쇄 기술의 출현 셀만이 비틀림 운동이 상기 조 화면 및 / 또는 철 결합 부위를 포함 핀의보다 정교한 버전을 저감 할 수있을 것으로 기대된다. 핀 제조의 용이성 및 피하 튜브 크기의 다양한 ...

그것은 치료 골절 환자의 경우 수술, 50 만 절차 골 이식 2의 사용을 포함한다. 미국 인구의 절반이 65 일의 나이 골절이 발생할 것으로 추정되며,이 숫자는 점점 고령화 3 증가 할 것으로 예상된다 . 뼈가 완전히 흉터없이 치유 능력을 갖는 몇몇 기관 중 하나이지만 프로세스 3,4-을하지 아니한 경우, 인스턴스가있다. 상황과 치료의 품질에 따라 긴 뼈 골절의 2-30% 비 노조 3,5의 결과로 실패합니다. 정의, 가관절, 크기의 중요한 또는 비 노조 뼈 부상에 대한 몇 가지 논쟁이 남아있는 동안 일반적으로 피사체 (6)의 자연 수명 기간 동안 치유되지 않는 상처를 의미한다. 실험 목적을 위해,이 기간은 평균 크기의 뼈 상해 완전히 치유에 필요한 평균 시간으로 단축된다. 비 노조 뼈의 병변은 NUM 발생erous 이유,하지만 주요 요인으로 인한 질병 또는 7 세에 비판적 크기의 차이, 감염, 가난한 혈관 신생, 흡연, 또는 억제 osteoregenerative 용량의 결과로 극단적 인 외상을 포함한다. 비 조합이 성공적으로 처리 된 경우에도, 그 손상의 유형 및 사용 방법 (8)에 따라, 프로 시저 당 60,000 달러를 초과하는 비용이있다. 적당한 경우, 자가골 이식술가 사용된다. 이 전략은 부상의 사이트에 공여 부위와 이식에서 뼈의 회복을 포함한다. 이 방법은 매우 효과적이지만, 가능한 도너 - 유도 된 뼈의 용적에 제한이 있으며 절차는 많은 환자에서 지속적인 통증 9,10 결과 추가적인 수술을 포함한다. 또한,자가 골 이식술의 효능, 환자의 건강 의존한다. 합성 물질 또는 처리 사체 뼈로 만든 뼈 대체는 11-13 풍부하게 사용할 수 있습니다,하지만 그들은 하불량한 숙주 세포 접착 성이 감소 osteoconductivity 및 면역 거부 (14)에 대한 전위를 포함 상당한 제한을했습니다. 안전하고 효과적이고 널리 사용되어 골 재생 기술이 시급히 요구된다. 뼈 재생 전략을 개선하기 위해 우리의 능력을 시험 동물에 심각한 뼈 외상을 모방 할 수있는 능력에 결정적으로 의존하지만, 큰 뼈 병변의 생성 및 안정화 기술적 도전이다. 대부분의 경우, 심각한 긴 뼈 외상은 자연적으로 치유되지 않습니다 결함을 구축하여 실험적으로 모방한다. 그것은 15 종에 따라 다를 수 있지만, 이는 뼈의 단면 (16)의 1.5 배보다 큰 직경 뼈 세그먼트의 완전한 제거에 의해 달성된다. 뼈 골절 후 연부의 적절한 배향을 유지하고 이동을 허용하기 위해 금속 임플란트로 안정화된다. 때문에 작은 크기와의 취약성에긴 뼈, 마우스 등 병변의 설립은 대부분의 연구 그룹의 기능을 능가한다. 따라서, 긴 골 결손 모델 쥐와 큰 동물에 국한되어있다. 그럼에도 불구하고, 마우스들은 인간 유전자 변형 세포와 조직을 거부하지 않기 때문에 면역 타협 한 균주로 육종 할 수 있다는 점에서 상당한 이점을 연구 수득. 인간 세포 기반 응용 프로그램의 면역 손상 쥐들이 생리 학적으로 집에 쉽게, 잘 특성화 때문에 작업하기 매력, 비용 대비 효과, 쉽게 조직 학적, 방사선 학적 및 분석. 가장 중요한 면역 손상 마우스는 인간을 포함한 다른 종의 세포를 거부하지 않는다는 것입니다. 그들의 작은 크기도 세포 또는 응용 프로그램 정형 외과에서 실험 비계의 볼륨의 아주 작은 숫자의 테스트를 허용합니다. 몇몇 뮤린 모델은 정형 뼈 안정성 17,18 다양한 정도의 여유도보고되었다. 그 정기적 복용연골 치유가 19을보고 하였지만 이러한 외고정 고정판과 같은 매우 높은 안정성 수준을 초래할 MS 주로 intramembranous 골화 치유. 대조적으로, 이러한 비 고정 또는 부분적 수질 고정 핀을 이용하는 것과 같은 일부 마이크로 및 / 또는 매크로 움직임을 허용 자들은 일반적으로 (20, 21)의 연골 내 골화 우세 치료한다. 지연 유합 또는 긴 뼈의 불유합의 결함으로 인해 필요한 안정화의 추가 수준에 마우스를 달성하는 것이 특히 어렵다. 그러나 접근 방법은 연동 손톱 수질 핀, 잠금 판과 외고정 (22)를 포함하여,보고되었다. 이러한 시스템은 일반적으로 잘 작동하지만 그들의 복잡한 디자인들이 설치가 기술적으로 어려울 수 있습니다 주어. 예를 들어, 가르시아 등. (23)는 마우스에서 사용하기위한 우아한 연동 핀 시스템을 고안 있지만 절차는 두 개의 분리 된 부위에서 절개를 포함s와 대퇴골의 광범위한 수정은 핀을 수용 할 수 있습니다. 이러한 절차는 해부 현미경 하에서 수행 하였다. 여기서, 우리는 3mm 골 결손의 폐쇄를 방지하고 또한 결함의 원래 가장자리를 묘사하기위한 중앙 칼라와 간단한 대퇴 골수의 핀을 설명합니다. 핀 자체가 뼈에 고정되어 있지 않은 동안, 충분한 간섭 골수 공동 결과 핀 직경 리머의 정확한 크기는 비틀림 운동 (도 1)을 최소화한다. 근친 연령, 성별 및 유사한 변형 마우스의 신중한 선택으로, 방사선 학적 결과는 용이하게 평가할 수있다 재현성 비후성 비 uniondefect 22이다. 또한 관심의 영역을 재현성 드 노보 골 형성 및 histomorphological 파라미터 측정 용 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (μCT) 이후에 정의 될 수있다. 핀은 쉽게 사용할 수있는 도구를 사용하여 우리의 실험실에서 프로토 타입했다.<img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52368/52368fig1highres.jpg" /> 그림 1 : 실험 원리 분절 결함 모델의 도식 요약.. 9-10mm 쥐의 대퇴골의 중심 3mm 세그먼트 (왼쪽) 수술로 절제한다. 3mm 길이, 19 게이지 수술 스틸 튜브는 정확한 센터 (오른쪽)에 길이 9mm, 22 G 스테인리스 스틸 관을 통해 전달 및 접착제로 고정되어 있습니다. 얻어진 핀 뼈 3mm 세그먼트 교체 19 G 칼라 (이하, 센터)과 대퇴골 근위부와 원위부 나머지 부분 운하 수질에 장착되어있다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Pin assembly</td></tr><tr><td>Dremel 회전 도구</td><td>Dremel</td><td>8220</td><td>또는 이에 상응하는</td></tr><tr><td>헤비 듀티 컷 오프 휠</td><td>Dremel</td><td>420</td><td></td></tr><tr><td>수술용 튜빙 19&nbsp; G</td><td>소형 부품(아마존)</td><td>B000FMZ8LY</td><td>OD 1.07&nbsp; mm, ID 0.889&nbsp; mm</td></tr><tr><td>수술용 튜빙 21&nbsp; G</td><td>소형 부품(아마존)</td><td>B000FMZ8YQ</td><td>OD 0.82&nbsp; mm, ID 0.635&nbsp; mm</td></tr><tr><td>수술용 튜빙 22&nbsp; G</td><td>소형 부품(아마존)</td><td>B000FMYLZS</td><td>OD 0.719&nbsp; mm, ID 0.502&nbsp; mm</td></tr><tr><td>수술용 튜빙 23&nbsp; G</td><td>소형 부품(아마존)</td><td>B000FN0SY0</td><td>OD 0.643&nbsp; mm, ID 0.444&nbsp; mm</td></tr><tr><td>시아노아크릴레이트 접착제</td><td>록타이트</td><td>1365882</td><td></td></tr><tr><td>에머리 디스크</td><td>Dremel</td><td>413</td><td></td></tr><tr><td>고무 연마 포인트</td><td>Dremel</td><td>462</td><td></td></tr><tr><td>펠트 연마 디스크</td><td>Dremel</td><td>414</td><td></td></tr><tr><td>젤라틴 스폰지</td><td>Surgifoam/Ethicon</td><td>1974</td><td></td></tr><tr><td>펀치 생검 커터</td><td>Miltex</td><td>33-34</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">수술/수술 후</td></tr> <tr><td>따뜻한 패드 및 순환 펌프</td><td>Stryker/Thermocare</td><td>TP700, TP700C, TPP722</td><td></td></tr><tr><td>적용 범위 4차 스프레이</td><td>Steris</td><td>1429-77</td><td></td></tr><tr><td>비드 살균기</td><td>Germinator/CellPoint Scentific</td><td>Germinator 500</td><td></td></tr><tr><td>마취 시스템</td><td>VetEquip Inc</td><td>901806 또는 901807/901809</td><td></td></tr><tr><td>이소 플루오란 마취제</td><td>VETone / MWI</td><td>501017, 502017</td><td></td></tr><tr><td>외과 용 소독제</td><td>Chloraprep / CareFusion</td><td>260449</td><td></td></tr><tr><td>수술 도구</td><td>Fine Science Tools</td><td>다양한</td><td>권장 독일산</td></tr><tr><td>얼굴 보호</td><td>스플래시 쉴드</td><td>4505</td><td></td></tr><tr><td>충전식 고속 드릴</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-17</td><td></td></tr><tr><td>다이아몬드 절단 휠</td><td>Strauss Diaiond</td><td>361.514.080HP</td><td></td></tr><tr><td>흡수성 봉합사&nbsp;</td><td>Covidien</td><td>UM-213</td><td></td></tr><tr><td>외부 봉합사</td><td>Ethicon</td><td>668G</td><td>또는 동급</td></tr><tr><td>Vetbond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td>또는 동급</td></tr><tr><td>수화 젤</td><td>Clear H2O</td><td>70-01-1082</td><td></td></tr><tr><td>다이어트 젤</td><td>Clear H2O</td><td>72-01-1062</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>Reckitt 및 Benckser</td><td>12496-0757-01</td><td>규제 물질</td></tr><tr><td>마우스 이글루</td><td>Bio Serv</td><td>K3328, 3570,3327</td><td></td></tr><tr><td>안락사 칵테일</td><td>Euthasol/Virbac</td><td>710101</td><td>규제 물질</td></tr><tr><td colspan="4">Analysis</td></tr><tr><td>Live animal imager&nbsp;</td><td>Orthoscan</td><td>FD Pulse</td><td>또는 이에 상응하는</td></tr><tr><td>Micro-CT 장치 및 소프트웨어</td><td>Bruker</td><td>Skyscan1174</td><td>또는 동급의</td></tr><tr><td>밀봉 필름/파라필름 M</td><td>VWR 또는 Fisher</td><td>100501-338, S37441</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">*일반 소스는 거즈, 드레이프, 보호복, 동물 관리 장비와 같은 다른 모든 품목에 적합합니다.</td></tr></tbody></table>

마우스의 간단한 임계 크기의 대퇴 결함 모델

A Simple Critical-sized Femoral Defect Model in Mice

뼈는 놀라운 재생 능력을 가지고 있지만, 심각한 뼈 외상으로 인해 제대로 치유되지 않는 손상이 발생하는 경우가 많습니다. 사실, 모든 사지 골절의 10분의 1은 환자의 외상, 질병 또는 나이의 정도에 따라 완전히 치유되지 않습니다. 뼈 재생 전략을 개선할 수 있는 우리의 능력은 실험 동물의 심각한 뼈 외상을 모방할 수 있는 능력에 결정적으로 의존하지만, 큰 뼈 병변의 생성 및 안정화는 기술적으로 어렵습니다. 대부분의 경우, 심각한 장골 외상은 자연적으로 치유되지 않는 결함을 확립함으로써 실험적으로 모방됩니다. 이는 뼈 단면 직경의 1.5배보다 큰 뼈 분절을 완전히 제거함으로써 달성됩니다. 그런 다음 골절 가장자리의 올바른 방향을 유지하고 이동성을 허용하기 위해 금속 임플란트로 뼈를 안정화합니다. 
작은 크기와 긴 뼈의 연약함으로 인해, 생쥐에서 이러한 병변을 확립하는 것은 대부분의 연구 그룹의 능력을 벗어납니다. 따라서 긴 뼈 결함 모델은 쥐와 더 큰 동물에 국한되어 있습니다. 그럼에도 불구하고 생쥐는 유전적으로 변형되고 인간 세포와 조직을 거부하지 않는 면역 저하 균주로 사육될 수 있다는 점에서 상당한 연구 이점을 제공합니다.
여기에서는 표준 실험실 및 수의학 장비를 사용하여 마우스 대퇴골에서 분절 결함의 생성을 용이하게 하는 기술을 보여줍니다. 실습을 통해 고정 장치 및 외과적 이식의 제작은 대부분의 훈련된 수의사와 동물 연구 인력에게 실현 가능합니다. 예시 데이터를 사용하여 모델에 대한 뼈 치유의 정량적 분석을 위한 방법론도 제공합니다.

마우스는 일반적으로 의식을 회복하고 뒷다리 이동성에게 마취의 철수 후 5 분에서 10 분. 처음 5 일 동안 개별적으로 마우스를 수용하고, 사지의 과​​도한 사용을 방지하기 위해 환경 농축을 소개하는 것이 좋습니다. 이 목적을 위해, 이글루 형 둥지 둥지 건물에 대한 필요성을 절감하고 휴식을 권장합니다. 우리는 또한 케이지의 바닥에 음식과 하이드로 겔의 조항이 핀 변위의 확률을 줄일 수 있음을 발견했다. 제도적 승인 정책에 따라 필요한 5 일 동안, 진통제를 투여한다. 원래 수술 전 체중의 약 15 %까지 체중 감소는 5 일 수술 후 기간 동안 가능하다. 24 시간 수술 후, 영향을받는 사지의 X 선은 핀 배치를 평가하는 것이 좋습니다. 핀은 완전히 칼라에 대한 결함 플러시의 가장자리와 근위 및 원위 수질 운하 (그림 2C에 삽입해야한다2E,도 5E,도 6A). 드물게 (&lt;사례 5 %), 핀이 경우 재수술을 제공한다 치유와 동물 사...

동물 모델은 생물 의학 연구에서 심각한 뼈 손상을 모방하기 위해 자주 사용됩니다. 크기가 작기 때문에 생쥐에서 안정화된 뼈 병변을 확립하는 것은 대부분의 연구 그룹의 능력을 넘어섭니다. 여기에서는 마우스의 실험적 대퇴골 결함을 확인하고 분석하는 간단한 방법을 설명합니다.

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all ...

본 절차의 전반적인 목표는 마우스 대퇴골에 단순한 실험적 임계 크기 결손(critical size defect)을 생성하는 것입니다. 이를 위해 먼저 외과용 스틸 튜빙으로 골수 핀을 제작합니다. 두 번째 단계에서는 마취된 마우스의 대퇴골에 임계 크기 결손을 생성합니다.그다음 핀을 식립하여 뼈를 고정합니다. 최종적으로 방사선 촬영 및 조직학적 분석을 통해 골 치유 정도를 평가할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때, 반드시 현재의 포셉(forceps)만을 사용하여 뼈를 고정하고 칼라(collar)가 절단된 뼈의 가장자리와 평평하게 맞닿도록 하는 것이 중요합니다.먼저 22 gauge 스테인리스 피하 주사 튜브 9 mm 조각의 샤프트 중앙에 시아노아크릴레이트 접착제 10 µL를 도포합니다. 3 mm 칼라를 샤프트에 끼워 중앙까지 밀어 넣은 다음, 여기 그림과 같이 칼라와 샤프트 사이에 접착제가 고르게 퍼지도록 비틉니다. 연구의 구체적인 목적과 수혜 대상에 따라 다양한 핀 구성으로 프로토타입을 제작할 수 있습니다.다음으로, 디지털 캘리퍼스를 사용하여 핀의 치수를 측정합니다. 각 섹션의 길이는 약 3 mm여야 합니다. 칼라를 최소 15시간 동안 경화시킨 후, 20 grit 에머리 함침 디스크 2개를 사용하여 버(burr)나 과도한 접착제를 제거합니다.다음으로, 로터리 툴에 펠트 연마 디스크를 장착하여 핀을 연마한 후, 탈이온수로 핀을 헹구고 압축 공기로 건조합니다. 이제, 19 gauge 피하 blunt 바늘을 핀의 샤프트 위에 놓고 바늘을 칼라 방향으로 밀어, 칼라가 약 25 grams의 무게를 견딜 수 있는지 확인하여 무결성을 테스트합니다. 그런 다음 멸균 여과된 PBS로 핀을 헹구고, 핀을 뼈 표본의 대퇴골 골수강에 삽입하여 샤프트가 꼭 맞고 칼라가 절단된 뼈의 가장자리에 밀착되는지 확인하여 적합성을 테스트합니다.고정력을 최대화하고 간섭 적합성(interference fit)을 개선하기 위해 핀의 끝부분이 골간의 해면골까지 충분히 관통하도록 하십시오. 피부 생검 칼을 사용하여 3mm 직경의 젤 폼 실린더를 펀칭하여 만들고, 21게이지 바늘로 중앙을 뚫습니다. 그런 다음 젤라틴 폼 실린더를 통과시켜 칼라(collar)와 정렬하십시오.마지막으로, 120°C, 15 PSI의 건조 사이클에서 핀을 오토클레이브합니다. 폼은 건조되면서 색이 어두워집니다. 기관에서 승인된 적절한 방법으로 진정 상태를 확인한 후, 마취된 개체를 뒷다리가 위를 향하게 하여 멸균 드레이프 위에 놓고 수술 절차를 시작합니다.동물에게 안연고를 도포하고, 털을 제거한 후 깨끗한 창절개 드레이프로 동물을 덮고 대퇴골의 근위 및 원위 렌즈를 확인합니다. 장축을 따라 피부를 5~10 mm 정도 절개합니다. 그다음 15번 메스를 사용하여 피부층을 근막에서 분리하고, MAs와 vestus lateralis를 통한 대퇴골 외측 접근법으로 노출시킵니다.두 근육의 중격 위치를 찾습니다. 근육의 분홍색 대비로 하얗게 보이는 조직선을 확인하고, 대퇴골이 보일 때까지 메스로 이 근육 간 경계를 따라 조심스럽게 절개합니다. 다음으로, 둔탁한 골막 거상기를 사용하여 절개 부위를 넓혀 골간 전체를 노출시킵니다.그 다음, 내측의 후방 신경혈관다발이 손상되지 않도록 주의하며 대퇴골 중앙의 2/3 지점을 추가로 노출시킵니다. 메스를 사용하여 뼈에서 연조직을 부드럽게 긁어낸 후, 멸균 면봉으로 뼈의 물기를 제거합니다. 이제 멸균 자나 캘리퍼스를 사용하여 대퇴골의 중심을 찾고, 중심에서 원위 방향으로 약 1.5 millimeters 지점에 표시합니다.그런 다음, 이전에 현재 스타일로 제작된 미세 팁 포셉으로 대퇴골을 조심스럽게 잡고, 미세 다이아몬드 입자가 코팅된 절단 휠이 장착된 미세 드릴을 사용하여, 조직을 보호하기 위해 엘리베이터를 배치한 상태에서 첫 번째 절단을 수행합니다. 아래. 골간단 끝부분을 단단히 잡은 상태에서 절단된 대퇴골을 45도로 들어 올립니다. 포셉으로 뼈를 고정한 상태에서 두 번째 절단을 수행하여 3 mm 세그먼트를 제거합니다.무딘 23 gauge 하이포더믹 바늘을 사용하여 각 끝단의 골수강을 조심스럽게 리밍합니다. 그런 다음 19 gauge 튜브 안에 22 gauge 튜브를 넣어 제작한 기성 깊이 측정기를 사용하여 강 내 깊이가 3 mm인지 확인합니다. 뼈가 준비되면, 준비된 핀을 근위부와 원위부 골수강에 차례로 삽입하여 대퇴골을 원래 길이로 되돌리고 3 mm의 안정적인 간격을 형성합니다.핀이 양쪽 골수강에 꼭 맞게 삽입되었는지, 그리고 절단된 뼈의 가장자리가 칼라와 수평을 이루는지 확인하십시오. 그런 다음 근육과 주변 조직을 핀 위로 다시 배치하고, 흡수성 5-0 봉합사로 연속 봉합하여 폐쇄합니다. 피부는 5-7 스퀘어 노트 나일론 및 5-0 봉합사로 봉합하고, 절개 부위를 동물용 외과용 접착제로 밀봉합니다.동물들은 AVMA 가이드라인 및 IACUC 승인 프로토콜에 따라 안락사되었습니다. 2~5주 후, 동물의 내측에서 근위 대퇴골과 골반을 노출시켜 후지를 조심스럽게 절제합니다. 그런 다음 메스를 사용하여 대퇴골두를 비구에서 분리하면서, 사지의 외측에서 관절을 안쪽으로 부드럽게 누릅니다.날카로운 메스를 사용하여 남은 근육과 피부를 절개하여 골반에서 사지 전체를 분리합니다. 그런 다음 무릎 관절에서 약 5 mm 아래의 과잉 조직과 뒷다리 하단을 절단하고, 근육은 그대로 둔 채 피부를 제거합니다. 다음으로, 10 mM calcium chloride가 첨가된 10% Buffered formalin 고정액에서 조직을 일주일 동안 고정시킨 후, 이미징 전까지 최대 한 달 동안 10 mM calcium chloride가 첨가된 PBS에 보관합니다.시료를 분석하려면 조직을 얇은 플라스틱 랩으로 감싼 후, 하나씩 수직으로 배치하십시오. 마이크로 CT 영상 챔버에서 스캔 설정을 다음 매개변수로 지정하십시오.전압은 29 kilovolts, 전류는 661 milliamps, 전력은 19 watts로 설정합니다. 이미지 픽셀 크기는 21 microns로 설정합니다. 360도 회전은 '예(yes)', 프레임 평균화는 '켜짐(on)'으로 설정하고, 회전 단계는 1도, 무작위 이동은 '켜짐(on)'으로 설정합니다.각 이미지를 획득할 때마다 스캔당 하나의 대상 폴더에 jpeg 파일로 저장하십시오. 그런 다음 각 파일의 축상면(axial) 이미지와 분석 소프트웨어를 사용하여 칼라(collar) 부분만 포함하는 단면을 선택함으로써 원래 결손부의 근위단과 원위단 경계를 설정하고 관심 영역(region of interest)을 정의하십시오. 마지막으로, 계산에서 칼라 부분을 제외하기 위해 칼라 주변에 100 micron 여백을 둔 제외 영역(exclusion zone)을 그린 다음, 해당 영역을 관심 영역 내의 모든 단면에 적용하십시오.치료적 개입이 없는 경우, 결손 부위의 가장자리는 일반적으로 수술 후 첫 21일 동안 0.5 millimeters 정도 확장됩니다. 14~21일의 치유 기간이 지난 후, micro CT 스캐닝으로 생성된 축상 영상(axial images)을 통해 신생 골의 부피를 쉽게 측정할 수 있습니다. 생성된 신생 골의 부피는 시간이 지남에 따라 증가하지만, 일반적으로 총 1 cubic millimeter를 초과하지 않습니다.21일 후 치료적 개입이 없는 경우, 병변 가장자리에서 0.25 millimeters 떨어진 신생 골의 극관성 모멘트는 0.05에서 0.35 millimeters fourth 사이이며, 이는 병변 중심부의 0.02에서 0.08 millimeters fourth와 대비됩니다. 이 대표 이미지에서 보여지듯, 치료하지 않은 사례에서 불유합의 존재를 추가로 확인하기 위해, 탈회된 종단면의 Mason's TRI chro 염색을 통해 연골의 선단부와 그 뒤를 잇는 해면골이 포함된 연골내 골성장의 시각화가 가능합니다. 박리 과정에서 일부 손상이 불가피하게 발생할 수 있으나, 핀을 조심스럽게 제거하면 뼈와 결합 조직의 조직학적 구조를 명확하게 유지할 수 있습니다.또는, 탈회되지 않은 절편의 메틸메타크릴레이트 매몰 및 절편 제작을 동일한 방식으로 수행할 수 있습니다. 이 기술에 숙달되면 30분 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차 이후, 회수된 조직에 CAR TPCR 마이크로어레이 또는 면역 블로팅과 같은 방법을 적용하여 특정 유전자형 세포, 단백질, 또는 화합물이 골 재생에 어떤 영향을 미치는가와 같은 추가적인 질문에 대한 답을 얻을 수 있습니다. 본 연구에서는 면역 결핍 마우스에 인간 세포와 인간 단백질을 사용합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

마우스 모델은 뼈 조직 공학에 매우 유용한 도구이지만, 긴 뼈 결함 모델은 드뭅니다. 이러한 필요성은 4개의 나사가 있는 잠금 플레이트와 전용 지그를 사용하여 이환율이 낮고 재현 가능한 대퇴골 임계 크기 결함을 수행하고 안정화하는 현재 프로토콜의 개발에 동기를 부여했습니다.

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