Name: Proteoliposome 기반 유출 분석은 CL의 단일 분자의 속성을 확인하는 - 채널 및 전송기 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: 배우세요 프로테오리포솜 기반 염화물 유출 분석을 통해 재구성된 이온 채널의 단위 전환율과 화학량론을 정량적으로 측정하는 방법을. 이 기술은 막 단백질 기능 연구에 정확한 데이터를 제공합니다.

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이 연구는 NIH 보조금 GM085232와 Irma T. Hirschl/Monique Weill-Caulier Scholar Award(A.A.에)의 지원을 받았습니다.

1. 지질 준비 <ol><li> 투명 유리 튜브로 원하는 양의 지질 나누어지는. 사용 E. 콜라이 극성 지질 추출물하지만 대부분 지질 조성물을 사용할 수있다. 지질이 분말 형태 인 경우, 20 ㎎ / ㎖의 농도로 이들을 클로로포름에 재현 탁. 모든 용매가 증발 할 때까지 N 2 가스에서 RT에서 지질을 건조. </li><li> 펜탄의 지질을 재현 탁 클로로포름의 남은 흔적을 제거하기 위해 다시 가스 N 2를 일정하게 건조시킨다. 드라이 모든 용매를 증발 할 때까지. 건조 동안 지질이 아래쪽 형성 치밀한 질량보다는 튜브의 아래쪽을 덮는 제 균일 한 막 분포되도록 부드럽게 회전 튜브. </li><li> 재구성 버퍼 함유 세제를 추가 (300 mM의 KCl을 50 mM의 시트르산, 25 mM의 K 2 HPO 4의 pH 4.5, 35 mM의 CHAPS)은 지질을 용해. 단백질이 CHAPS에 가난하게 허용하는 경우이 단계에서 다른 중성 세제를 사용하십시오. </li><li> Resuspen물 목욕 초음파기를 사용하여 선명도 지질 거라고. 짧은 (30 초 - 1 분)와 짧은 (30 초 - 1 분) 펄스를 최대 전력에서 물 초음파기 목욕의 중심에 튜브를 담가 일시 중지합니다. 이 솔루션은 명확하게해야한다. 주 : 최종 명확성 정도 달성​​ 사용될 특정 지질 조성에 의존한다. 심지어 동일한 명목상 지질이 단계 중 일부 뱃치 간 변이는 것도 가능하다. 잔류 헤이즈를 원심 분리에 의해 제거 될 수 현탁액 중의 큰 입자에 의한 광의 산란에 기인한다. </li><li> 20 ~ 60 분 동안 실온에서 재현 탁 지질을 품어. </li></ol> 2. Proteoliposome 형성 주 : 몇 가지 전략은 리포좀으로 세제 용해 된 단백질을 삽​​입하기 위해 사용될 수있다. CLC-EC1은 투석은 잘 작동하기 때문에 선택 6,9,10의 방법이다. <ol><li> 로 정제 된 단백질을 추가 원하는 단백질로 지질 μg의 O를 표현 (P / L) 비율 (<html> F 단백질 / mg의 지질). P / L 비의 선택은 실험의 목적에 의존한다. <ol><li> 목표는 관심있는 단백질의 활성을 평가 높은 P에 재구성하는 경우 각 리포좀 단백질의 여러 복사본을 포함합니다 / L&#39;들, 신호를 최대화한다. 각 소포 평균 한 단백질에 포함되도록 활성 및 / 또는 단백질의 단일 전송 레이트를 수치화하기 위해, 낮은 P / L&#39; s의 포아송 희석 정권 재구성한다. 각 체제를 사용하는 경우보다 깊이 분석을위한 7 단계 및 토론을 참조하십시오. </li></ol></li><li> 다양한 섭생에 대한 최적의 P / L 값을 결정하려면, 8,11-13 단백질 농도의 함수로서 활성의 완전한 적정을 수행한다. 그러나, 활성 단위의 분자량 (MW가 kDa의 표시)하는 모든 단백질을 다음 P / ℓ를 초기 값을 절반으로 사용될 수있는 공지되어있다 : PG &quot;/&gt; <img alt="식 (2)" fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq2.jpg" /></li><li> 미리 유체 접촉 투석 튜브 또는 카세트에 단백질과 지질 혼합물을로드합니다. 500-1,000x 지질 재구성 버퍼의 양을 함유하는 비이커에 투석 장치를 배치 (즉, 지질 부유 1 ㎖를 1 L 버퍼) 부드러운 교반하에. <ol><li> 변경 버퍼 간격&gt; 3 시간에 3-4 회. 모든 솔루션 변화에서, 카세트 / 튜브 및 증류수로 비커를 씻어 신선한 재구성 버퍼 비커를 입력합니다. 솔루션 변화 1-2 O / N 간격을 포함합니다. 용액 변경의 정확한 수와 기간이 사용될 정확한 지질 및 세제에 의존한다. </li></ol></li><li> 마지막 단계가 완료된 후, 투석 용기로부터 제거 리포좀 튜브들을 분취 플래시 -80 ° C에서 액상이 N 또는 동결 그들을 동결. </li></ol> 3. 녹화 환경 &lt;P 클래스 = &quot;jove_content&quot;&gt; 참고 : 녹화 설정 (그림 2A)이 두 개의 챔버 (평면 바닥 실린더, ~ 3-4 ml의 부피), CL로 구성 - 전극, 아날로그와 pH 측정기 (아래 참조) 디지털 전기 출력, 디지타이저 및 적절한 수집 소프트웨어와 컴퓨터 나. <ol><li> pH 미터 전극을, 컴퓨터에 연결되어 디지타이저 pH 미터의 출력 - CL을 연결한다. 하나의 챔버에서 기준 전극과 다른 (그림 2B)에서 레코딩 와이어를 놓습니다. 주 : 칼 ΔV가 양수 (단계 6.4 및 7.2 참조)의 경우에는 와이어 극성이 맞는지. </li><li> 기록 챔버 (그림 1B)에서 교반 막대와 볶음 접시에 챔버를 놓습니다. 교반 막대를 전극에 접촉하지 않도록하십시오. </li><li> 한천 다리 (그림 2B) (100 mM의 KCl을 2 % 아가로 오스)를 사용하여 챔버를 연결합니다. 100 mM의 KCl을의 한천 다리를 저장합니다. </리&gt; </ol> CL 4. 준비 - 전극 <ol><li> 과거와 -possibly- 작동하지 않는 pH 전극을 가져 가라. 완전히 실버 와이어를 공개 유리막 브레이크. </li><li> 조심스럽게 메스 블레이드를 사용하여 실버 와이어에서 코팅을 제거합니다. H 2 O와의 EtOH 풍부한 양을 사용하여 와이어를 청소합니다. </li><li> 전선까지 50ml을 (또는 표백제)의 포화 용액에 장소의 AgCl의 균일 한 어두운 코트 덮여있다. </li></ol> 단일 층 소포 5. 준비 <ol><li> 실험 전에 밤, 외부 버퍼 15 ㎖ (1 ㎜의 KCl, SO 4, 25 mM의 구연산, 산도 4.5 150 mM의 K 2) 흔들리는 부드러운와가 (저어하지 않음)에 세파 덱스 G-50 구슬의 1g 팽창 사용하기 전에 실온에서 최소 3 시간. 각 실험은 부어 구슬 ~ 3 ㎖가 필요합니다. 기껏해야 몇 일 동안 4 ° C에서 부어 구슬을 유지합니다. </li><li> 리포좀을 실온에서 해동하는 동안, 각 열 ~ 3m 부어부어 G-50 구슬의 리터. RT 중력 흐름에 의해 그들을 말리면; 이것은 일반적으로 1 ~ 2 분 걸립니다. </li><li> 0.4 m 테플론 차단을 사용하여 미니 압출기를 통해 테오에게 11 번을 돌출시켜 단일 층 소포를 준비합니다. </li><li> 플라스틱 둥근 바닥 튜브에 열을 놓습니다. 여분의 용액을 제거하기 위해 열을 스핀. 임상 원심 분리기에서 1,400 XG에 20 ~ 30 초 동안 원심 분리기. </li><li> 13 X 100mm 유리 튜브의 흐름을 통해, 장소 열을 버리고 컬럼에 돌출 된 소포의 100 μl를 추가합니다. 임상 원심 분리기 500 XG에서 1 분 동안 열을 스핀. </li><li> 단계 6.5의 기록 챔버에 첨가한다 관류 ~ 200 μL의 수집. </li></ol> 6. 유출 측정 <ol><li> 레퍼런스 (접지) 100mm의 챔버의 KCl 2㎖ 및 외부 버퍼의 1.8 ml의 배치 (1 mM의 KCl을을 150 mM의 K 2 SO 4, 25 mM의 시트르산, pH를 4.5) 기록 챔버. 내부 사이의 약간의 삼투압의 불균형외부 솔루션에 영향을주지 않습니다 </li><li> 취득 프로그램을 시작합니다. 이 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다, 기준이 평형을 보자. </li><li> 신호를 안정적으로 기준선 (리포좀 준비하고 건조 컬럼)에 도달하면 (도 3a)을 촬영을 시작. </li><li> 시스템 (그림 2A)를 교정 된 10 mM의 KCl 용액 15 μl를 추가합니다. </li><li> 리포좀을 추가합니다. 테오 (그림 3A)에서 - 작은 점프 인해 외부 CL의 불완전한 제거로 볼 수 있습니다. 베이스 라인이 안정 될 때까지 기다립니다. </li><li> 발리 노마 이신 (Valinomycin) 추가 (1 mg의 EtOH 중 / ㎖에서 1 μL)은 유출 (그림 3A)를 시작합니다. </li><li> 유출은 시간 물론 고원까지 (그림 3A)를 실행하자. </li><li> 모든 리포좀 (그림 3A)을 용해 할 수있는 외부 버퍼에 준비 1.5 M β-옥틸 글루코 시드 (β-OG)의 40 μl를 추가합니다. 촬영을 완료합니다. </li></ol> 7. 데이터nalysis <ol><li> ASCII 또는 텍스트 형식에서 추적 파일을 내보내고 선택의 분석 프로그램으로 가져옵니다. </li><li> 다음 사항 (도 3A)에서 전압을 측정한다 : 기록의 시작시 (0 V); 교정 펄스 (CAL V)을 첨가 한 후; 리포좀 (리포의 V)을 첨가 한 후; 유출 (V 지느러미)의 끝에; 세제 (V 어린 아이)을 첨가 한 후, 기준 전압 그래서 V 0 = 0. </li><li> 실험의 값을 결정 네른스트 - 플랑크 식을 사용하여 <img alt="식 (3)" fo:content-width=".3in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq3.jpg" /> 측정하여 <img alt="수학 식 4" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq4.jpg" /> 여기서 권 칼 μL의 교정 펄스의 부피로 표현 된 실험의 시작에서 챔버 체적은 1800이다1 - 교정 펄스와 mm 단위로 외부 버퍼의 농도 ΔV CAL은 교정 펄스 후에 측정 MV에서 점프입니다 난, [CL] CAL /에서하면 CL 있습니다. 참고 : α의이 경험적인 결정은 세 가지 목적을 수행합니다 : 그것은 시스템이 제대로 응답하는지 보장, 실험 사이에 악기의 응답의 일관성의 측정을 제공뿐만 아니라 실수는 솔루션 결정에 만든되지 않았 음을 확인합니다. </li><li> 다음 각 단계 후에 CL 농도를 계산한다 : <img alt="식 (5)" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq5.jpg" /> <img alt="식 (6)" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq6.jpg" /> <img alt="식 (7)" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq7.jpg" /> 400분의 3 인자는 2000 μL의 최종 부피로 15 μL 교정 펄스의 희석에서 온다. </li><li> Calcul각 단계, 지느러미 ΔCl의 사러가 / / TOT에서 [CL]의 변화를 먹었다. </li><li> 와 CL (t)에 V (t)를 변환 <img alt="식 (8)" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq8.jpg" /> 직접 중요한 지점에서 [CL] 값을 결정하고 내부 통제로 계산 된 값으로 비교합니다. </li><li> 추적을 정상화 CL 확인해의 리포 = 0, CL 확인해 무비 = 1 그래서 <img alt="식 (9)" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq9.jpg" /></li><li> 하기 식 유출 경시 맞는 : <img alt="식 (10)" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq10.jpg" /> CL 실험적으로 측정함으로써 결정된다 누설 - - L는 Cl의 비율이다 τ와 동일한 조건에서 제조 된 무 단백질 리포좀으로부터 유출이 공정의 시간 상수이다. </li><li> V, 초기 속도를 계산한다 : 여기서 ΔCl 핀은 밀리몰의 표현 및 V는 μL의 챔버의 체적이다. </li><li> 전송 속도 / 전도도를 계산 <img alt="식 (12)" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq12.jpg" /> P는 P / L이고, MW는 활성 착물 ​​kDa의 분자량으로 표현 </li></ol>

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저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다.

정제 음이온 선택적 채널 또는 리포좀에 재구성 수송에 의해 매개 교통 - 우리는 상세한 CL을 측정 할 수있는 프로토콜을 설명했다. CLC-EC1을 기 - 사용 된 예는 원핵 H + / CL이었다. 고려중인 이온에 적합한 하나의 AgCl 전극 : 그러나, 방법론 용이 리간드 12,13,15, 11,12 전압 또는 AG로 대체하여 다른 음이온 선택성 15,16 스포츠 의해 게이트 된 채널을 연구하기에 적합 할 수있다. 전극이 CL 이외의 이온에 대한 선택적 - 이러한 H의 +로, I - F는 -, 상업적으로 사용할 수 있습니다. 중요한 단계 및 가정의 몇 가지의 토론은 다음과 같습니다. 푸 아송 희석 가정의 한계 <p class="jove_con...

마지막 두 과발현과 막 수송 단백질을 정제 할 수있는 능력이 크게 증가하고있다 수십 년 : 이온 채널, 일차 및 이차 전송기들은 보통 이종 발현 시스템뿐만 아니라, 천연 공급원으로부터 정제된다. 이 단백질의 안정성을, 표현을 모니터링 개선하고 추출을 용이하게하고 강화하는 새로운 접근 방식은 끊임없이 1-5 개발되고있다. 이러한 기술 혁신은 차례로, 그 기능의 구조적 기지에 대한 우리의 이해를 강화, 막 단백질에 원자 수준의 구조 정보의 폭발을 유발하는 데 큰 도움이되고있다. 반면에, 우리의 능력은 어떤 경우에는 고해상도 구조적 정보가 따라서 정량적 구조 기반 예측을 테스트 할 수있는 능력을 제한 질적 기능 데이터에 의해 수반되도록, 동일한 비율로 증가하지 않은 정제 된 단백질의 기능적 특성을 프로빙. 따라서, developmen는양적 일반화 기능 분석의 t는 막 단백질의 기능 기계론 토대 해명 향해 중요한 단계이다. 채널 및 전송기 - 준비 정량적 정제하고 재구성 CL의 주요 기능적 특성을 결정하기 위해 사용될 수 유출 분석을 기술한다. 분석을위한 원칙은 교통 시스템뿐만 아니라 다양한 비 이온 수송 단백질로 일반화 될 수있다. 채널 / CL 대형의 존재 수송차 - - 정제 된 리포솜 CL로 녹이고 구배 (도 1A, B). CL이 - 유출가 우리의 경우에는, 반대 이온 플럭스 있도록 이온 운반체의 첨가에 의해 개시되는 K + 이온 운반체 발리 노마 이신 (Valinomycin), CL에 의해 설정된 전압 션트되는 - 구배 및 K의 평형 전위로 초기 막 전위를 설정할 + 6,7. t없이이 횡단 전위의 발생에 의해 방지로 유출이 발생, - 그는 더 중요한 순 (CL)을 이온 운반체가 없습니다. - 유출 및 F 0, 활성 단백질을 함유하지 않은 리포좀 분획 τ, CL의 시상수 : 정량적 데이터는 두 개의 측정 파라미터 (도 1C)에 의해 설명된다. τ와 f 0 CL에서 단일 - 전송 속도, 활성 단백질의 활성 분획물 및 복합체의 분자량은 8 유도 될 수있다. 알려진 구조와 기능의 교환기 -이 기술은 CLC-EC1, 잘 특성화 된 CLC 형 H + / CL로 재구성 테오를 사용하여 여기에 예시되어있다. 상기 분석 용이 전압 활성 및 / 또는 리간드의 존재에 따라 상이한 또는 이온 선택성 채널들 또는 컨베이어로 일반화된다. 또한,이 분석은 소분자 직접 영향을 미치는 단백질 재구성 여부를 결정하는데 사용될 수있다,이들 화합물 및 방법에 막 조성물 또는 지질 - 변경 시약 재구성 채널들 및 수송의 기능에 영향을 미치는 영향을 정량.

<table><tbody><tr><td>지방살균제, Avanti Polar Lipids Inc.</td><td>&nbsp; 아반티 폴라 지질 Inc.</td><td>610200</td><td></td></tr><tr><td>IEC Centra CL2 벤치탑</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orion Research Model 701A 디지털 pH-mV 미터</td><td></td><td></td><td>이들은 Ebay에서 찾을 수 있습니다.</td></tr><tr><td>작동하지 않는 pH 프로브</td><td></td><td></td>: <td>은색 와이어가 있는 모든 pH 측정기 프로브가 작동합니다. 유리/플라스틱 코팅을 제거하고 전선을 청소해야 합니다.</td></tr><tr><td>DI-710 데이터 로거</td><td>DATAQ 기기</td><td></td><td></td></tr><tr><td>WinDAQ 수집 소프트웨어</td><td>DATAQ 기기</td><td></td><td></td></tr><tr><td>피어스 일회용 플라스틱 기둥, 중력 흐름, 2ml</td><td>피어스(Thermo Scientific)</td><td>29922</td><td></td></tr><tr><td>KIMAX 배양 튜브, 일회용, 붕규산 유리</td><td>Kimble Chase</td><td>73500-13100</td><td></td></tr><tr><td>홀더/가열 블록</td><td>이 있는 압출기 세트아반티 폴라 지질 Inc.</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>컴퓨터</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

proteoliposome 기반 유출 분석은 cl의 단일 분자의 속성을 확인하는<sup&gt; -</sup&gt; 채널 및 전송기

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

지난 15년 동안 진핵생물뿐만 아니라 원핵생물로부터 막 단백질을 과발현하고 정제하는 능력이 폭발적으로 증가한 것이 특징입니다. 이러한 증가는 주로 막 단백질에 대한 구조 정보를 얻으려는 성공적인 노력에 의해 주도되었습니다. 그러나 이러한 단백질을 기능적으로 조사하는 능력은 동일한 속도로 발전하지 않았으며 종종 제한된 정량적 가치의 정성적 분석으로 제한되어 제공할 수 있는 기계론적 통찰력을 제한합니다. 재구성된 Cl-채널 또는 수송체의 수송 활성을 정량적으로 조사하기 위한 분석법이 설명됩니다. 이 분석은 막 전위를 션트하기 위해 K+ ionophore valinomycin을 추가한 후 프로테오리포좀에서 Cl-의 유출 속도를 측정한 것을 기반으로 합니다. 이온 민감성 전극은 원하는 단백질로 재구성된 프로테오리포좀에서 이온 유출의 시간 경과를 추적하는 데 사용됩니다. 이 방법은 단일 수송 속도, 활성 단백질의 분율 및 기능 단위의 분자량과 같은 재구성된 단백질의 주요 특성을 정량적으로 결정할 수 있기 때문에 기계론적 연구에 매우 적합합니다. 이 분석은 또한 재구성된 단백질을 직접 억제/활성화하는 저분자 화합물의 효과를 결정하고 멤브레인 조성 또는 지질 변형 시약의 조절 효과를 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 가능한 경우, 이 방법을 사용하여 얻은 결과를 직접 비교하는 것이 전기생리학적 접근 방식을 사용하여 얻은 결과와 잘 일치하는 것으로 나타났습니다. 이 기술은 CLC 유형 H + / Cl- 교환기 인 CLC-ec1을 모델 시스템으로 사용하여 설명됩니다. 유출 분석은 모든 Cl 전도성 채널/수송체를 연구하는 데 사용할 수 있으며, 최소한의 변화로 모든 이온 수송 단백질을 연구하는 데 적용할 수 있습니다.

교환기, 리포좀에 재구성 - 정제 CLC-EC1, 원핵 CLC 형 H + / CL에 의해 매개 교통 - 우리는 상세하고 강력한 CL을 측정 할 수있는 프로토콜을 설명합니다. 실험 장치의 개략적 인 대표도도 3에 도시되어 정제 된 CLC-EC1 및 높은 내부 CL 함유 재구성은 테오 -. 낮은 CL 함유 용액 욕에 침지 -. 이러한 조건 그물 CL에서 - 유출은 리포좀 (그림 3A)에 양의 전하의 축적에 의해 방지 할 수있다. 유출 (그림 3B) - 발리 노마 이신 (Valinomycin)의 추가는 K +가 막 따라서 전위 전철과 CL을 시작 가로 질러 이동할 수 있습니다. 플럭스 시간 코스는 CL을 사용하여 모니터된다 - -selective 전극 및 CL의 총량 ...

Proteoliposomes는 잘 정의된 생화학적 환경에서 재구성된 정제된 채널과 수송체를 연구하는 데 사용됩니다. 이러한 단백질에 의해 매개되는 유출을 측정하기 위한 실험적 절차가 설명됩니다. 프로테오리포좀을 준비하고, 기록을 수행하고, 데이터를 분석하여 재구성된 단백질의 기능적 특성을 정량적으로 결정하는 단계가 설명됩니다.

Proteoliposome 기반 유출 분석은 CL의 단일 분자의 속성을 확인하는<sup&gt; -</sup&gt; 채널 및 전송기

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 재구성된 염화 이온 채널 또는 운반체의 수송 활성을 정량적으로 결정하는 것입니다. 이는 우선 정제된 순수 운반체를 리포좀에 낮은 밀도로 재구성하여, 외부의 염화 이온을 제거함으로써 외부 방향으로 이온 기울기가 형성되었을 때 각 리포좀이 활성 복합체를 0개 또는 1개만 포함하도록 함으로써 수행됩니다. 이후 리포좀을 기록 챔버에 첨가하고, 염화 이온 민감성 전극을 사용하여 염화 이온 농도를 모니터링합니다. 다음으로, 막 전위를 완화하는 칼륨 이온ophores인 Valinomycin을 첨가하여 리포좀으로부터의 염화 이온 흐름을 유도합니다.신호가 정상 상태에 도달하면, 리포좀을 용해시키기 위해 세제를 첨가하여 실험을 종료합니다. 최종적으로, 정제된 채널 또는 운반체로 재구성된 프로테오리포좀으로부터 염화물 유출 속도를 측정함으로써, 활성 단백질 복합체의 단위 운반 속도와 화학 양론을 정량적으로 결정할 수 있습니다. 형광 기반 플럭스 측정과 같은 기존의 다른 접근 방식에 비해 이 기술의 주요 장점은, 재구성된 운반체의 단위 회전율 및 복합체의 기하학적 구조와 같은 핵심 파라미터를 정량적으로 결정할 수 있다는 점입니다.이 방법은 이러한 핵심 파라미터의 정량적 측정값을 제공할 뿐만 아니라, 소분자 돌연변이의 영향을 신속하고 정밀하게 결정하고 재구성된 운반 단백질의 서브유닛을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다. 기록 장치는 두 개의 챔버, 염화물 전극, 아날로그 또는 디지털 전기 출력이 가능한 pH 미터, 디지타이저 및 적절한 수집 소프트웨어가 설치된 컴퓨터로 구성됩니다. 염화물 전극을 pH 미터에 연결한 다음, pH 미터의 출력을 컴퓨터에 연결된 디지타이저에 연결하십시오.기준 전극을 한쪽 챔버에 넣고 기록 와이어를 다른 쪽 챔버에 넣습니다. 다음으로 기록 챔버에 교반바를 넣은 상태에서 챔버들을 교반기에 올립니다. 이때 교반바가 전극에 닿지 않도록 주의하십시오.실험 전날 밤에 아가르 브릿지(agar bridge)를 사용하여 챔버들을 연결하십시오. 사용 전, Cidex G 50 비드 1g을 15mL의 외부 완충액에 넣고 상온에서 최소 3시간 동안 부드럽게 흔들어 팽윤시키십시오. 리포좀이 상온에서 해동되는 동안, 각 실험당 약 3mL의 팽윤된 비드가 필요합니다. 팽윤된 G 50 비드 약 3mL를 각 컬럼에 붓습니다.중력에 의해 건조시킵니다. 실온에서 흐르도록 둡니다. 이는 보통 1~2분 정도 소요됩니다.다음으로, 0.4 micron Teflon 컷오프가 장착된 미니 압출기를 사용하여 프로테아 리포좀을 11회 압출함으로써 유니라멜라 베지클을 준비합니다. 그 다음, 과잉 용액을 제거하기 위해 임상용 원심분리기를 사용하여 플라스틱 라운드 바텀 튜브 원심분리기에 컬럼을 넣고 1400 G에서 20 ~ 30초 동안 원심분리합니다. 이후 유속을 유지하면서 컬럼을 13 by 100 millimeter 유리 튜브에 넣고, 압출된 베지클 100 µL를 컬럼에 첨가합니다.컬럼을 500 G에서 1분 동안 원심 분리합니다. 임상 원심분리기를 사용하여, 기록 챔버에 추가할 유출액 약 200 µL를 수집합니다. 유출 측정을 수행하려면, 참조 챔버에 100 mM 염화칼륨 2 mL를 넣고, 기록 챔버에 외부 버퍼 1.8 mL를 넣습니다. 데이터 수집 프로그램을 시작합니다.기선(baseline)이 평형을 이룰 때까지 기다립니다. 이 과정은 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다. 신호가 안정적인 기선에 도달하면 기록을 시작합니다.시스템을 보정하기 위해 10mM KCl 용액 15 µL를 첨가하십시오. 그 다음 리포좀을 첨가하십시오. 프로테아 리포좀의 외부 염화물이 불완전하게 제거되어 작은 도약(jump)이 관찰될 수 있습니다.기선(baseline)이 안정될 때까지 기다립니다. 다음으로, flx를 개시하기 위해 CIN을 첨가합니다. FLX가 평탄기(plateau)에 도달할 때까지 시간 경과에 따라 반응이 진행되도록 둡니다.이 시점에서 외부 버퍼로 준비한 1.5 molar beta Octa glucocide 40 µL를 첨가하여 모든 리포좀을 용해시킵니다. 그 후 10~15초 동안 기다립니다. 녹화를 종료하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 데이터 분석을 진행합니다.내부에 높은 농도의 염화물을 포함하는 리포좀을 염화물 농도가 낮은 환경에 침전시켜 300배의 염화물 구배를 형성했을 때, 순 이온 플럭스는 관찰되지 않습니다. 이는 단백질이 없는 리포좀이 이온에 대해 낮은 고유 투과성을 갖기 때문입니다. 양성자 결합 염화물 운반체인 C-L-C-E-C one이 재구성된 프로토 리포좀에서도 거시적인 FLX는 관찰되지 않습니다.소량의 염화 이온이 소포에서 유출되면서 리포좀 내에 순 양전하가 축적되므로, CIN을 첨가하면 칼륨 이온이 막을 가로질러 이동하여 전기적 전위를 완화하고 염화 이온의 흐름을 유도할 수 있습니다. 반응을 종료시킨 후 소포에 포함된 총 염화 이온 양을 측정하여 재구성된 단일 단백질의 특성을 결정합니다. 유출 시간 경과에 따른 원시 데이터는 먼저 밀리볼트(mV)에서 염화 이온 농도로 변환한 후 정규화하며, 이후 시간 경과 곡선에 대해 피팅을 수행합니다.유출의 시상수는 41초이며, CLCEC1의 활성 복제본이 없는 리포좀의 분율은 0.31인 것으로 결정되었으며, 이는 리포좀의 약 3분의 1에 활성 단백질이 포함되어 있지 않음을 나타냅니다. 이러한 값들과 CLCEC1의 복제본을 최소 하나 이상 포함하는 소포의 염화물 함량을 측정함으로써, CLCEC1의 단위 수송률이 초당 약 2,500개의 염화 이온과 같음을 결정할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후, 수송체의 회전수(turnover)를 결정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이러한 실험들은 주의 깊게 수행할 경우 10분에서 15분 내에 완료할 수 있습니다.누출은 회전율 추정치에 부정적인 영향을 미치므로, 리포좀의 품질을 면밀히 평가하는 것이 매우 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 그램이시딘 채널 활동의 조치로 형광 담금질의 속도를 모니터링 빠른 형광 기반의 분석을 소개합니다. 그램이시딘 채널 지질 이중층 속성의 변화로 이중층 스패닝 단백질에 의해 감지를 모니터링하는 분자 힘 변환기로 사용됩니다.

그램이시딘 기반의 형광 분석, 지질 이중층의 속성을 수정하는 작은 분자 잠재 결정

이 프로토콜 세부 대형 unilamellar 지질 vesicles로 펩타이드 translocation의 양적 측정을위한 방법입니다. 이 방법은 또한 멤브레인 translocation의 속도에 대한 정보를 제공하고 효율적이고 자발적 지질 bilayers를 건너되는 펩티드를 식별하는 데 사용할 수 있습니다.

대형 Unilamellar Vesicles로 펩타이드의 Translocation 측정

우리는 녹농균에서 유출 펌프의 체외 조사에 대한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 리포좀 막 내에서 강력한 가역 및 조정할 수있는 양성자 기울기의 생성을 허용하고 따라서 protomotive 힘에 의해 격려하는 막 단백질에 적용 할 수 있어야한다.

녹농균에서 MexAB 유출 펌프의 체외 조사

여기서 설명하는 낭포 성 섬유증에 결함이 클로라이드 채널에 대한 활성을 유지 정제 야생형 및 돌연변이 CFTR 단백질의 기능적 재구성을위한 신속하고 효율적인 절차이다. CFTR 의해 매개 재구성 테오에서 요오드화 유출 채널 활성의 연구 및 작은 분자의 효과를 허용한다.

정제 된 야생형과 돌연변이 체 CFTR 단백질의 기능의 재구성 및 채널 활동 측정

제시된 프로토콜은 공극 스패닝 무용매 지질 이중층을 사용하여 단일 수송체 수준에서 막 단백질 매개 수송을 분석하는 방법을 설명합니다. 이는 대단히 병렬적인 데이터 수집 및 분석과 결합된 대량 생산된 나노포어 어레이 칩을 생성함으로써 달성되며, 향후 멤브레인 단백질 이펙터 스크리닝의 확립을 가능하게 합니다.

멤브레인 운송은 단일 단백질 해상도에서 고도의 병렬 나노 기공 칩 시스템에 의해 분석 처리합니다

우리는 옵신으로 재구성된 큰 단층 리포좀에서 인지질 스크램블을 측정하기 위한 형광 기반 분석을 설명합니다.

인지질 Scramblase 활동의 형광 기반의 분석

이 프로토콜 cryo 전자 현미경 검사 법, 효율적으로 최소한의 노력 및 독성, 단백질 추출, 정화, 포유류 세포에 있는 유전자를 표현 하는 데 사용 되는 잠재 시스템을 포함 하 여 이온 채널 구조를 결정 하는 데 사용 하는 기법을 설명 합니다. 그리고 품질 검사, 샘플 그리드 준비 및 심사, 뿐만 아니라 데이터 수집 및 처리.

식 및 단일 입자 Cryo 전자 현미경 검사 법에 의하여 구조 결심에 대 한 인간의 지질 민감한 양이온 채널 TRPC3의 정화

여기, 우리는 예를 들어 시 토 크롬 보3  를 사용 하 여 단일 리의 지질 막에 걸쳐 양성자 전 좌의 분자 메커니즘을 연구 하는 프로토콜 제시. 전기 화학 및 형광 현미경 검사 법, 단일 소포, 포함 하는 단일 또는 여러 효소의 루멘에서 pH 변화를 결합 수 있습니다 감지 되며 개별적으로 분석.

전기 화학 및 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 양성자 펌프 막 효소의 연구에 대 한 단일 Liposome 측정

이 프로토콜은 리포솜의 제조를 설명하고 이들이 어떻게 표면에 고정되고 형광 현미경 검사법을 사용하여 거대한 병렬 방식으로 개별적으로 심상될 수 있는지 설명합니다. 이는 집단의 단일 리포좀 들 사이의 크기 및 조성 불균질의 정량화를 허용한다.

개별 리포좀 간의 조성 불균질성을 검출하기 위한 정량적 형광 현미경 검사법 기반 단일 리포좀 분석

나노 바디는 구조 생물학에 있는 중요한 공구이고 치료의 발달을 위한 중대한 잠재력을 포즈. 그러나 억제 특성을 가진 나노 체의 선택은 어려울 수 있습니다. 여기서 우리는 전기막 수송기를 표적으로 하는 억제 및 비 억제 나노체의 분류를 위한 고체 지원 멤브레인(SSM) 기반 전기생리학의 사용을 입증합니다.

고체 지원 멤브레인(SSM) 기반 전기생리학에 의한 수송기 표적 억제 나노체 선택

우리는 기존 기술보다 우수한 감도와 분해능으로 리포솜 막 투과성을 평가하는 비용 효율적인 방법을 제시합니다. 새로운 캡슐화된 리간드 치환 반응을 사용하여 이 기술은 모델 막에서 포스포리파제 A2 유도 변화를 검출합니다. 표준 분석과 쉽게 통합되는 이 접근 가능한 접근 방식은 막 생물물리학 및 독소 상호 작용 연구를 위한 해상도를 향상시킵니다.

포스파티딜이노시톨 인산염 그룹이 독 PLA2의 멤브란트로픽 작용에 미치는 영향을 조사하기 위한 리포솜 막 투과성 분석

배우세요 프로테오리포솜 기반 염화물 유출 분석을 통해 재구성된 이온 채널의 단위 전환율과 화학량론을 정량적으로 측정하는 방법을. 이 기술은 막 단백질 기능 연구에 정확한 데이터를 제공합니다.

Proteoliposome 기반 유출 분석은 CL의 단일 분자의 속성을 확인하는

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