Proteoliposome 기반 유출 분석은 CL의 단일 분자의 속성을 확인하는 ^- 채널 및 전송기

이 절차의 전반적인 목표는 재구성된 염화물 채널 또는 수송체의 수송 활성을 정량적으로 측정하는 것입니다. 이는 먼저 순수 정제 수송체를 저밀도의 리포좀으로 재구성하여 외부 염화물 이온을 제거한 후 각 리포솜에 활성 복합체의 사본이 0개 또는 1개 포함되도록 하여 외부로 향하는 이온 구배가 있도록 하고, 리포좀을 기록 챔버에 첨가하여 염화물 농도를 모니터링하는 염화이온 민감성 전극을 사용하여 모니터링합니다. 다음으로 리포솜에서 염화물 flx는 막 전위를 강화하는 칼륨 이오노홀인 Val Mycin의 첨가에 의해 시작됩니다.

신호가 정상 상태에 도달하면 리포좀을 용해시키기 위해 세제를 첨가하여 실험을 종료합니다. 궁극적으로, 정제된 채널 또는 수송체로 재구성된 프로테아 리포좀의 염화물 유출 속도를 측정함으로써 활성 단백질 복합체의 단일 수송 속도와 화학량론을 정량적으로 결정할 수 있습니다. 형광 기반 플럭스 측정과 같은 다른 기존 접근 방식에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 기술을 통해 단일 회전율 및 복합체의 기하학적 구조와 같은 재구성된 수송체의 주요 매개변수를 정량적으로 결정할 수

이러한 주요 매개변수에 대한 정량적 측정을 제공하는 것 외에도 이 방법은 돌연변이 소분자의 영향을 빠르고 정확하게 결정하고 재구성된 전달 단백질의 소단위를 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다. 기록 설정은 두 개의 챔버, 염화물 전극, 아날로그 또는 디지털 전기 출력이 있는 pH 측정기, 디지타이저 및 적절한 수집 소프트웨어가 있는 컴퓨터로 구성됩니다. 염화물 전극을 pH 측정기에 연결한 다음 pH 측정기의 출력을 컴퓨터에 연결된 디지타이저에 연결합니다.

기준 전극을 한 챔버에 놓고 다른 챔버에 코딩 와이어를 놓습니다. 다음으로, 레코딩 챔버의 교반 막대가 있는 교반 플레이트에 챔버를 놓습니다. 교반 막대가 전극에 닿지 않도록 하십시오.

실험 전날 밤 한천 브리지를 사용하여 챔버를 연결하고 사용하기 전에 15ml의 외부 완충액에 cidex G 50 비드 1g을 넣고 실온에서 최소 3시간 동안 부드럽게 흔듭니다. 각 실험에는 리포좀이 실온에서 해동되는 동안 약 3ml의 부풀어 오른 비드가 필요합니다. 부풀어 오른 G 50 비드를 약 3ml씩 각 컬럼에 붓습니다.

중력에 의해 말리십시오. 실온에서 흐릅니다. 이 작업은 보통 1-2분 정도 걸립니다.

다음으로, 0.4 미크론 테플론 컷오프를 사용하여 미니 압출기를 통해 프로테아 리포좀을 11회 압출하여 울라소포를 준비합니다. 그런 다음 임상 원심분리기에서 1400G로 20-30초 동안 플라스틱 원형 바닥 튜브 원심분리기에 컬럼을 넣어 과도한 용액을 제거합니다. 그런 다음 흐름을 보호하면서 컬럼을 13 x 100mm 유리관에 넣고 100마이크로리터의 압출된 소포를 컬럼에 추가합니다.

임상 원심분리기를 G.In 500°C에서 1분 동안 컬럼을 돌리고 약 200마이크로리터의 흐름을 수집하여 기록 챔버에 추가합니다. 유출 측정을 수행하려면 2mL의 100mmolar 염화칼륨을 기준 챔버에 배치하고 1.8mL의 외부 버퍼를 기록 챔버에 배치합니다. 인수 프로그램을 시작합니다.

기준선이 평형을 이루도록 합니다. 이 작업은 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다. 신호가 안정적인 기준선에 도달하면 녹음을 시작합니다.

15마이크로리터의 황갈색 몰 염화칼륨 용액을 추가하여 시스템을 보정합니다. 그런 다음 리포좀을 추가합니다. 프로테아 리포좀에서 외부 염화물이 불완전하게 제거되었기 때문에 작은 증가가 보일 수 있습니다.

기준선이 안정화될 때까지 기다립니다. 다음으로, CIN을 추가하여 flx를 시작합니다. FLX가 안정될 때까지 시간 경로를 실행하도록 합니다.

이 시점에서 외부 완충액에 준비된 1.5몰 베타 옥타 글루코시드 40마이크로리터를 첨가하여 모든 리포좀을 용해시킵니다. 그런 다음 10-15초 동안 기다립니다. 녹음을 종료하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 데이터 분석을 진행합니다.

높은 내부 염화물을 포함하는 리포좀을 낮은 염화물에 담궈 300배의 염화물 구배를 생성하면 순 이온 플럭스가 관찰되지 않습니다. 이는 protein이 없는 리포좀이 이온에 대한 고유 투과성이 낮기 때문입니다. 양성자 결합 염화물 수송체인 C-L-C-E-C 1로 재구성된 프로트 리포좀에서 거시적 FLX는 관찰되지 않습니다.

베스코에서 나오는 소량의 염화물은 리포솜에 순 양전하를 축적하기 때문에 CIN을 첨가하면 칼륨 이온이 멤브레인을 가로질러 이동하여 전위를 완화하고 염화물 플x를 시작할 수 있습니다. 반응이 종료되고 소포에 포함된 염화물 이온의 총량을 측정하여 재구성된 단일 단백질의 특성을 결정합니다. 유출 시간 과정의 원시 데이터는 먼저 밀리볼트에서 염화물 농도로 변환된 다음 시간 과정을 정규화한 다음 맞춥니다.

유출의 시간 상수는 41초이고 C-L-C-E-C 1의 활성 사본이 0인 리포좀의 분율은 31점으로 결정되었으며, 이는 리포좀의 약 1/3이 이러한 값으로부터 0개의 활성 단백질을 포함하고 있음을 나타내고 C-L-C-E-C 1의 사본이 하나 이상 포함된 소포의 염화물 함량을 측정하고, 대략 2, 초당 500의 염화물 이온과 동등한 C-L-C-E-C 것의 단일 수송 비율을 결정하는 것이 가능하다. 이 비디오를 시청한 후에는 운송업체의 회전율 필요성을 결정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이러한 실험은 신중하게 수행하면 10-15분 안에 수행할 수 있습니다.

리포좀의 품질을 주의 깊게 평가하는 것이 중요한데, 누출은 회전율 추정치에 부정적인 영향을 미치기 때문입니다.