Name: プロテオリポソームベースの流出アッセイのClの単一分子特性を決定する -チャネルとトランスポーター (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: 学ぶプロテオリポソームを用いたCl⁻チャネル・トランスポーターの単一分子輸送活性測定法。塩化物イオン選択電極で定量的に単位ターンオーバー率と複合体の化学量論を決定し、膜タンパク質機能の理解を深めます。

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この研究はNIHの助成金による支援を受け、GM085232とIrma T. Hirschl/ Monique Weill-Caulier Scholar Award（AAに贈られました。

1.脂質の準備<ol><li>透明なガラス管に所望量の脂質を分注し。 E.を使用してください大腸菌極性脂質抽出物が、ほとんどの脂質組成物を用いることができる。脂質は粉末形態である場合は、20 mg / mlの濃度のクロロホルムで再懸濁。すべての溶媒が蒸発するまでN 2ガ ​​ス下、RTで脂質を乾燥させる。 </li><li>ペンタン中の脂質を再懸濁し、クロロホルムの残り痕跡を除去するために再びガスN 2の安定した流れを、それを乾燥させてください。乾燥した全ての溶媒が蒸発するまで。乾燥しながら脂質をチューブの底に三分の一をカバーする均一な膜に分布してではなく、一番下に密な塊を形成されるように、静かにチューブを回転させる。 </li><li>脂質を溶解する界面活性剤（300mMの塩化カリウム、50mMのクエン酸、25mMのK 2 HPO 4、pH4.5で、35mMのCHAPS）を含有する再構成バッファを追加する。タンパク質がCHAPSにはあまり寛容である場合は、このステップのために他の中性洗剤を使用してください。 </li><li> Resuspen水浴超音波処理を使用して明瞭に脂質をdは。短い（30秒-1分）一時停止（30秒-1分）短いパルスの最大電力で水超音波処理槽の中心にチューブを浸し。溶液は透明になるはず。 注：達成明確化の最終的な程度は、使用される特定の脂質組成に依存します。この段階で、いくつかのバッチ間の変動があっても、名目上同一の脂質の中でも可能である。残留ヘイズは遠心分離により除去することができる懸濁液中の大きな粒子による光の散乱によるものである。 </li><li> 20〜60分間、室温で再懸濁脂質をインキュベートする。 </li></ol> 2.プロテオリポソー​​ムの形成注：いくつかの戦略は、リポソーム内に界面活性剤で可溶化タンパク質を挿入するために使用することができる。 CLC-EC1のために透析がうまく機能し、そのために選択6,9,10の方法です。 <ol><li> μgのOで表され、所望のタンパク質対脂質（P / L）比（に精製タンパク質を追加します。<html> Fタンパク質/ mg脂質）。 P / L比の選択は、実験の目的に依存する。 <ol><li>目標は、関心対象のタンパク質の活性を評価することである場合には、各リポソームは、タンパク質の複数のコピーが含まれるように、信号を最大化するために高いP / L&#39;sで再構成する。各小胞は、平均1タンパク質に含まれるように、活性および/またはタンパク質の単一の輸送速度を定量化するために、低いP / L&#39;sのポアソン希釈領域で再構成する。各政権をどのような場合に使用するのより深い分析のための手順7と議論を参照してください。 </li></ol></li><li>様々なレジメンのための最適なP / L値を決定するには、タンパク質濃度8,11-13の関数として活性の完全な滴定を行う。しかし、活性単位の分子量（MWは、kDaので表す）する任意のタンパク質について、以下のP / Lの値が初期guesstimatesとして使用することができる知られている。 pgの &quot;/&gt; <img alt="式2" fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq2.jpg" /></li><li>予め湿らせた透析チューブまたはカセットにタンパク質と脂質混合物をロードします。 500-1,000x脂質再構成バッファのボリュームを含むビーカーに透析装置を配置（ すなわち 、脂質の再懸濁の1ミリリットルのため1 Lバッファ）穏やかに撹拌しながら。 <ol><li> &gt; 3時間間隔で変更バッファ3〜4回。すべてのソリューションの変更では、蒸留水でカセット/チューブ、ビーカーを洗浄し、新鮮な再構成緩衝液でビーカーを埋める。溶液交換のための1-2のO / N間隔を含めます。ソリューションの変更の正確な数と期間は、使用される正確な脂質や洗剤に依存します。 </li></ol></li><li>最後のステップが完了した後、-80℃で液体N 2又は凍結で、透析容器からリポソームを除去するチューブでそれらをアリコートし、フラッシュ、それらを凍結する。 </li></ol> 3.録音セットアップ &lt;Pクラス= &quot;jove_content&quot;&gt;注： - （下記参照）電極、アナログとpH計記録のセットアップ（ 図2A）は、二つのチャンバー（平底シリンダー、〜3,4容）、Clから構成されていまたはデジタル電気出力、デジタイザ、および適切な取得ソフトウェアを備えたコンピュータ。 <ol><li> pH計の電極、コンピュータに接続されているデジタイザにpH計の出力-はClを接続します。 1チャンバー内の参照電極と他の（ 図2B）で再コーディングワイヤーを配置します。 注：ΔV カルが正である（ステップ6.4および7.2参照）がワイヤの極性が正しい。 </li><li>記録チャンバー（ 図1B）で撹拌棒で撹拌プレート上室を置きます。撹拌棒が電極に接触していないことを確認してください。 </li><li>寒天橋（ 図2B）（100 mMのKClおよび2％アガロース）を使用してチャンバーを接続します。 100のKClに寒天ブリッジを保管してください。 </LI&gt; </ol>のCl 4.準備-電極<ol><li>古いものと-possibly-非機能pH電極を取る。完全に銀線を明らかにするためにガラスコーティングを破る。 </li><li>慎重に手術用メスの刃を使用して銀ワイヤからコーティングを除去。 H 2 OおよびEtOH大量のを使用して、ワイヤを清掃してください。 </li><li>ワイヤまでのFeCl 3（または漂白剤）の飽和溶液の代わりに塩化銀の均一な暗い被膜で覆われている。 </li></ol>単ラメラ小胞の5準備<ol><li>実験前の夜は、のために（攪拌しないでください）穏やかに振盪しながら外部バッファ（1のKCl、150mMのK 2 SO 4、25mMのクエン酸、pH4.5）中の15ミリリットルでセファデックスG-50ビーズの1グラムを膨潤使用前に室温で少なくとも3時間。各実験は、膨潤したビーズの〜3ミリリットルが必要です。せいぜい数日、4℃で膨張したビーズにしてください。 </li><li>リポソームは、室温で解凍している間、各列〜3メートルに注ぐ膨潤したG-50ビーズリットル。 RTで重力流によってそれらが乾燥してみましょう。これは通常、1〜2分かかります。 </li><li> 0.4メートルテフロンカットオフを使用したミニ押出機を通してテオを11回押し出して単ラメラ小胞を準備します。 </li><li>プラスチック製の丸底チューブ内の列を配置します。過剰な溶液を除去するためのカラムをスピン。臨床遠心機で1400×gで20〜30秒間遠心する。 </li><li>フロースルーを捨て、13×100mmのガラス管内の場所の列と列に押し出された小胞の100μlを添加する。臨床遠心機で500×gで1分間コラムスピン。 </li><li>ステップ6.5で記録チャンバーに追加され、フロースルーの〜200μlのを収集します。 </li></ol> 6.流出測定<ol><li>記録チャンバーに置き参照2mlの100mMのKClを（接地）チャンバと外部バッファ1.8mlの（1のKCl、150mMのK 2 SO 4、25mMのクエン酸、pH4.5中）。内部の間のわずかな浸透圧の不均衡と外部のソリューションは影響しません</li><li>取得プログラムを起動します。これは数分かかることがあり、ベースラインが平衡化しましょう​​。 </li><li>信号が安定したベースラインを（リポソームは準備ができていると列を乾燥）に達すると、（ 図3A）の記録を開始。 </li><li>システム（ 図2A）を校正するために10 mMのKCl溶液の15μlのを追加します。 </li><li>リポソームを追加します。プロテオリポソーム（ 図3A）から-小さなジャンプは、外部のClの除去が不完全に見えるかもしれません。ベースラインが安定するまで待ちます。 </li><li>流出（ 図3A）を開始するためにバリノマイシン（EtOH中で1mg / mlで1μl）を追加します。 </li><li>流出がそれプラトー（ 図3A）までの時間経過を実行してみましょう。 </li><li>すべてのリポソーム（ 図3A）を溶解するために、外部緩衝液中で調製1.5 Mβオクチルグルコシド（β-OG）の40μlを添加する。録音を終了します。 </li></ol> 7.データAnalysis <ol><li> ASCIIまたはテキスト形式でのトレースファイルをエクスポートし、選択した解析プログラムにインポート。 </li><li>以下の点（ 図3A）の電圧を測定します。 記録の開始時（V 0）。 較正パルス（V 校正 ）を添加した後、 リポソーム（V リポ ）を添加した後、 流出（V フィン ）の終わりに、 洗剤（V totは ）を添加した後、 ベースラインV 0 = 0となるよう電圧。 </li><li>の実験値を決定するために、ネルンスト - プランク方程式を使用して、 <img alt="式3" fo:content-width=".3in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq3.jpg" />測定することにより、 <img alt="式4" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq4.jpg" /> 巻カルは、実験開始時の室容積はでμL、1800での校正パルスのボリューム表現されている場合1; L、[Clで] CAL /中 Clである-校正パルスのとMMとΔVCALで外部バッファの濃度は、校正パルス後に測定mV単位のジャンプです。 注：αのこの経験的な決定は、3の目的があります。それは、システムが適切に応答していることを保証し、実験間の機器の応答の一貫性の尺度を提供していますだけでなく、間違いが解製作に行われなかったことを確認する。 </li><li>次のように各ステップの後のCl濃度を計算します。 <img alt="式5" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq5.jpg" /> <img alt="式6" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq6.jpg" /> <img alt="式7" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq7.jpg" /> 要因400分の3は、2000μlの最終容量に15μlの校正パルスの希釈から来ている。 </li><li>計算学会各ステップで[CL &#39;の変化、ΔCL リポ/フィン/ TOTを食べました。 </li><li>とはCl（t）がV（t）を変換する <img alt="式8" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq8.jpg" /> 直接の重要なポイントで &#39;CL値を決定し、内部統制などの計算値と比較します。 </li><li>トレースを正規のCl 相対 リポ = 0とCl REL TOT = 1となるよう <img alt="式9" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq9.jpg" /></li><li>次式に流出時間経過をフィット： <img alt="式10" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq10.jpg" /> 実験的にはClを測定することによって決定される漏れ- - Lは、Clの割合である場合、同じ条件及びτで製造したタンパク質を含まないリポソームからの流出は、プロセスの時定数である。 </li><li> V、初期速度を計算します。 ここΔCL フィンはミリモルで発現され、Vはμlのチャンバの容積である。 </li><li>輸送速度/コンダクタンスを計算します <img alt="式12" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq12.jpg" /> pがP / Lであり、MWは、活性複合体の分子量は、kDaの中で発現され</li></ol>

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</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

精製された陰イオン選択的チャネルまたはリポソーム中に再構成トランスポーターによって媒介輸送-私たちは、詳細はClを測定するためのプロトコルを記載している。交換CLC-EC1 -使用例は、原核生物のH + / CLだった。検討中のイオンに適したものでAgCl電極ただし、方法論は、容易にリガンド12,13,15、電圧11,12、またはAgを交換することによって、異なるアニオン選択15,16をスポーツによってゲートチャンネルを研究するために適合させることができる。のCl以外のイオンのための選択性電極- 、などのH +としては、I -及びF - 、市販されている。 重要なステップとの仮定のいくつかの議論が続く。 ポアソン希釈仮定の限界ユニタリ率（式7-9）の導出は...

最後の二つの過剰発現および膜輸送タンパク質を精製する能力が劇的に増加している数十年：イオンチャネル、プライマリとセカンダリのトランスポーターは、現在日常的に異種発現系、ならびに天然の供給源から精製される。これらのタンパク質の安定性を、発現をモニタリング改善し、抽出を容易にし、強化するための新しいアプローチが常に1-5開発されている。これらの技術革新は、順番に、その機能の構造的な拠点の我々の理解を高め、膜タンパク質上の原子レベルの構造情報の爆発をトリガーに尽力している。対照的に、我々の能力は、いくつかの場合において、高分解能の構造情報をこのように定量的構造に基づいた予測をテストする我々の能力を制限する、定性機能的データが付随するように、同じ割合で増加しなかった精製されたタンパク質の機能的特性をプローブする。したがって、developmen定量的および一般化機能アッセイのtは膜タンパク質機能のメカニズムの基盤の解明に向けた重要なステップである。 チャネルおよびトランスポーター-ここでは、定量的に精製され、再構成されたCl -の主要な機能的特性を決定するために用いることができる流出アッセイを記載する。アッセイの基礎となる原理は、輸送システムの様々な、ならびに非イオン輸送タンパク質に一般化することができる。チャネル/大型のClの存在下でのトランス- -リポソームは、精製されたClで再構成する勾配（ 図1A、B）。のCl -の流出は、我々の場合K +イオノフォアバリノマイシンに、対イオン流束を可能にするために、イオノフォアを添加することによって開始のClによって確立された電圧をシャントれている-勾配及びKの平衡電位に初期の膜電位を設定する+ 6,7。トンなしそれは膜電位の発生により阻止されるように流出が発生し、 -彼は有意な正味のClをイオノフォアん。 -流出、およびf 0、活性タンパク質を含有しないリポソームの割合τ、Cl -の時定数：データは、定量的に2測定可能なパラメータ（ 図1C）によって記載されている。 τおよびf 0から一体のCl -輸送速度、活性タンパク質の画分と活性複合体の分子量は8導出することができる。既知の構造および機能の交換-技術はCLC-EC1、よく特徴付けCLC型H + / Clで再構成されたプロテオリポソームを用いて、ここに示されている。このアッセイは、容易に又は活性電圧および/またはリガンドの存在に依存して異なるイオン選択性チャネルまたは輸送体に一般化される。さらに、このアッセイは、小分子は、直接再構成タンパク質に影響を与えるかどうかを決定するために用いることができるこれらの化合物の効果を定量する方法、および膜組成物又は脂質修飾試薬は、再構成されたチャネルおよび輸送体の機能に影響を与える。

<table><tbody><tr><td>リポソーミケーター、Avanti Polar Lipids Inc.</td><td>&nbsp;アバンティポーラーリピッド株式会社</td><td>610200</td><td></td></tr><tr><td>IEC Centra CL2ベンチトップ</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orion研究モデル701AデジタルpH-mVメートル</td><td></td><td></td><td>これらはEbayで見つけることができます。</td></tr><tr><td>機能しないpHプローブ</td><td></td><td></td><td>銀色のワイヤーが付いたpHメータープローブであれば、どれでも機能します。ガラス/プラスチックコーティングを取り外し、ワイヤーを清掃する必要があります。</td></tr><tr><td>DI-710 データロガー</td><td>DATAQ 機器</td><td></td><td></td></tr><tr><td>WinDAQ 取得ソフトウェア</td><td>DATAQ 機器</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce 使い捨てプラスチックカラム、重力流、2ml</td><td>ピアス (Thermo Scientific)</td><td>29922</td><td></td></tr><tr><td>KIMAX 培養チューブ、使い捨て、ホウケイ酸ガラス</td><td>Kimble Chase</td><td>73500-13100</td><td></td></tr><tr><td>押出機セット ホルダー/加熱ブロック</td><td>付きアバンティポーラーリピッド株式会社</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>コンピュータ</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

プロテオリポソー​​ムベースの流出アッセイのclの単一分子特性を決定する<sup&gt; -</sup&gt;チャネルとトランスポーター

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

過去15年間は、真核生物だけでなく原核生物からの膜タンパク質を過剰発現し精製する能力の爆発的な増加によって特徴づけられました。この増加は、主に膜タンパク質の構造情報を取得するための成功した推進によって推進されています。しかし、これらのタンパク質を機能的に調べる能力は、同じ速度で進歩しておらず、多くの場合、定量的価値が限られている定性的なアッセイに限定されているため、それらが提供できるメカニズムの洞察は限られています。再構成されたCl−チャネルまたはトランスポーターの輸送活性を定量的に調査するためのアッセイについて説明する。このアッセイは、K+イオノフォアバリノマイシンを添加して膜電位をシャントした後のプロテオリポソームからのCl-の排出速度の測定に基づいています。イオン感受性電極を使用して、目的のタンパク質で再構成されたプロテオリポソームからのイオン流出の時間経過を追跡します。この方法は、再構成されたタンパク質の主要な特性(ユニタリー輸送速度、活性タンパク質の画分、機能ユニットの分子量など)を定量的に決定できるため、機構研究に非常に適しています。このアッセイは、再構成されたタンパク質を直接阻害/活性化する低分子化合物の効果を決定するため、および膜組成物または脂質修飾試薬の調節効果をテストするためにも利用できます。可能な場合、この方法を使用して得られた結果間の直接比較は、電気生理学的アプローチを使用して得られた結果と良好に一致することがわかりました。この手法は、CLC型H+/Cl-交換体であるCLC-ec1をモデルシステムとして使用して説明されています。エフラックスアッセイは、任意のCl伝導チャネル/トランスポーターの研究に利用でき、最小限の変更で、任意のイオン輸送タンパク質の研究に適合させることができます。

交換器、リポソーム中に再構成-精製されたCLC-EC1、原核生物CLC型H + / CLにより媒介輸送-私たちは、詳細かつ堅牢なのClを測定するためのプロトコルについて説明します。実験の概略図を図3に示されている精製されたCLC-EC1及び高い内部のClを含有する再構成されたプロテオリポソームは、 -低のClを含有する浴溶液に浸漬されている- 。これらの条件の下で正味のCl -流出リポソーム（ 図3A）における正電荷の蓄積を防止する。流出（ 図3B） -バリノマイシンを添加すると、K +は、このように電位を分路およびCLを開始する膜を横切って移動することができます。フラックスの経時変化のClを使用して監視されている-選択性電極およびClの総量-小胞に含まれているが、直接洗剤を使用して可溶化することによって測定される。これ...

プロテオリポソームは、明確に定義された生化学的環境で再構成された精製チャネルとトランスポーターを研究するために使用されます。これらのタンパク質によって媒介される排出を測定するための実験的手順が示されています。プロテオリポソームを調製し、記録を行い、再構成されたタンパク質の機能特性を定量的に決定するためのデータを分析するための手順について説明します。

プロテオリポソー​​ムベースの流出アッセイのClの単一分子特性を決定する<sup&gt; -</sup&gt;チャネルとトランスポーター

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as ...

この手順の全体的な目的は、再構成されたクロリドチャネルまたはトランスポーターの輸送活性を定量的に決定することです。まず、精製した純粋なトランスポーターを低密度でリポソームに再構成し、各リポソームに活性複合体が0個または1個しか含まれないようにします。次に、外部のクロリドイオンを除去して外向きのイオン勾配を形成させ、リポソームを記録室に添加し、クロリド感受性電極を用いてクロリド濃度をモニターします。その後、カリウムイオン担体であるVal Mycinを添加して膜電位を解消させることで、リポソームからのクロリドフラックスを開始させます。信号が定常状態に達した後、界面活性剤を添加してリポソームを溶解させることで実験を終了します。最終的に、精製されたチャネルまたはトランスポーターを再構成したプロテオリポソームからの塩化物イオンの流出速度を測定することで、活性タンパク質複合体の単一輸送速度および化学量論を定量的に決定することが可能です。蛍光ベースのフラックス測定などの他の既存の手法に対する本手法の主な利点は、単一のターンオーバー速度や複合体の幾何学的構造など、再構成されたトランスポーターの主要なパラメータを定量的に決定できることです。これらの主要なパラメータの定量的な測定を提供することに加え、本手法は、低分子変異剤の影響を迅速かつ精密に決定し、再構成された輸送タンパク質のサブユニットをモニタリングするために使用できます。記録セットアップは、2つのチャンバー、塩化物電極、アナログまたはデジタル電気出力を備えたpHメーター、デジタイザ、および適切な収集ソフトウェアをインストールしたコンピュータで構成されます。塩化物電極をpHメーターに接続し、次にpHメーターの出力をコンピュータに接続されたデジタイザに接続します。参照電極を一方のチャンバーに、記録用電線をもう一方のチャンバーに配置します。次に、記録用チャンバーに攪拌子を入れた状態で、チャンバーをスターラーの上に置きます。攪拌子が電極に触れないように注意してください。実験の前夜にアガーブリッジを用いてチャンバーを接続します。使用前に、1 gのCidex G-50ビーズを15 mLの外部緩衝液に入れ、室温で少なくとも3時間、緩やかに振盪して膨潤させます。リポソームを室温で解凍させている間に、各実験につき約3 mLの膨潤したビーズを用意します。各カラムに約3 mLの膨潤したG-50ビーズを注ぎます。自然重力で乾燥させます。室温で流し、通常1〜2分かかります。次に、0.4 micronのテフロンカットオフを用いたミニエクストルーダーでプロテアリポソームを11回エクストルージョンし、単層小胞（u-lar vesicles）を調製します。その後、余剰の溶液を除去するため、カラムをプラスチック製ラウンドボトムチューブ遠心管に入れ、臨床用遠心機を用いて1400 Gで20～30秒間遠心分離します。この後、流出を防ぎながら、カラムを13 by 100 millimeterのガラスチューブに設置し、エクストルージョンした小胞を100 µL、カラムに添加します。カラムを500 Gで1分間遠心分離します。臨床用遠心分離機を用い、記録チャンバーに添加するフロースルーを約200 µL回収します。流出測定を行うには、リファレンスチャンバーに100 mMの塩化カリウムを2 mL、記録チャンバーに外部バッファーを1.8 mL注入します。データ収集プログラムを開始してください。ベースラインを平衡状態にします。これには数分かかる場合があります。信号が安定したベースラインに達したら、記録を開始してください。システムの校正のため、10 mMの塩化カリウム溶液を15 µL加えます。次に、リポソームを加えます。プロテアリポソームからの外部塩化物の除去が不完全であるため、小さな跳ね上がりが観察される場合があります。ベースラインが安定するまで待ちます。次に、CINを添加してflxを開始させます。FLXがプラトーに達するまで、タイムコースに沿って進行させます。ここで、外部緩衝液で調製した1.5 molar beta Octa glucocideを40 µL添加し、すべてのリポソームを溶解させます。その後、10〜15秒間待ちます。記録を終了し、テキストプロトコルに記載されている通りにデータ解析に進んでください。内部に高濃度の塩化物イオンを含むリポソームを、300倍の塩化物イオン濃度勾配が生じる低濃度の塩化物イオン溶液に浸漬しても、正味のイオンフラックスは観察されません。これは、タンパク質を含まないリポソームがイオンに対して低い固有透過性を有しているためです。プロトン共役塩化物トランスポーターC-L-C-E-C 1を再構成したプロテオリポソームからも、マクロスコピックなFLXは観察されません。ベシクルから放出される少量の塩化物がリポソーム内に正のネット電荷を蓄積させるため、CINを添加することでカリウムイオンが膜を横切って移動できるようになり、電位が解消されて塩化物フラックスが開始されます。その後、反応を停止させ、ベシクルに含まれる塩化物イオンの総量を測定して、単一の再構成タンパク質の特性を決定します。流出のタイムコースの生データは、まずミリボルトから塩化物濃度に変換し、次いで正規化を行い、その後タイムコースをフィッティングします。流出の時定数は41秒であり、CLCec1の活性コピーを全く含まないリポソームの割合は0.31であると決定されました。この値から、リポソームの約3分の1に活性タンパク質が含まれていないことが示されます。これらの値と、少なくとも1コピーのCLCec1を含む小胞の塩化物イオン含有量を測定することにより、CLCec1の単一輸送速度が毎秒約2,500個の塩化物イオンであることを決定することが可能です。このビデオを視聴することで、トランスポーターのターンオーバー数を決定する方法を十分に理解できるはずです。これらの実験は、注意深く行えば10分から15分で完了させることができます。漏出はターンオーバー率の推定に悪影響を及ぼすため、リポソームの品質を慎重に評価することが極めて重要です。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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グラミシジンベースの蛍光アッセイ、脂質二重層のプロパティの変更の可能性小分子を決定するための

このプロトコルの詳細、大きな一枚膜脂質小胞へのペプチド移行の定量的測定のための方法。また、このメソッドは、膜の転座の割合に関する情報を提供し、効率的かつ自発的に脂質二重層を横切るペプチドを同定するために使用することができます。...

大型単層小胞へのペプチドの転座の測定

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精製された野生型および変異型CFTRタンパク質の機能的再構成とチャネル活性の測定

提示されたプロトコルは、細孔スパンの溶媒を含まない脂質二重層を使用した単一トランスポーターレベルでの膜タンパク質媒介輸送の分析を説明しています。これは、大量生産されたナノポアアレイチップの作成と、高度に並列化されたデータ取得および分析を組み合わせることで達成され、膜タンパク質エフェクタースクリーニングの将来の確立が可能になります。...

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式と単一粒子の低温電子顕微鏡による構造決定のための人間脂質感受性陽イオン チャネル TRPC3 の精製

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プロテオリポソー​​ムベースの流出アッセイのClの単一分子特性を決定する

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