Tetracistronic Minigenomes를 포함하는 바이러스 입자와 바이오 안전성 수준이 조건에서 에볼라 바이러스의 수명주기를 모델링

다음 실험의 전반적인 목표는 생물안전 2등급(biosafety level two) 조건에서 고병원성 에볼라 바이러스의 생애 주기를 모델링하는 것입니다. 이는 에볼라 바이러스 입자와 동일한 단백질 구성을 가지되, 바이러스 게놈 대신 미니 게놈을 운반하는 바이러스 유사 입자(virus-like particles)를 제작함으로써 달성됩니다. 미니 게놈은 바이러스 유전자가 제거되고 루시퍼라제(luciferase)와 같은 리포터 유전자로 대체된 바이러스 게놈의 축소 버전입니다.

중요한 점은, 본 실험에 사용된 미니 게놈이 여전히 다수의 바이러스 유전자를 포함하고 있으며, 이는 바이러스 단백질인 VP40, GP-one two, VP24를 인코딩한다는 것입니다. 바이러스 유사 입자는 생산 세포라고 불리는 293T 세포에서 미니 게놈을 np, VP35, VP30, L과 같은 바이러스 단백질(이들은 함께 RNP 단백질이라고도 함)과 함께 발현시켜 생성합니다.

그 후 미니 게놈은 바이러스 단백질에 의해 복제되고 mRNA로 전사됩니다. 이 mRNA들은 루시퍼라제(Luciferase) 리포터와 추가적인 바이러스 단백질인 VP40, GP-one two 및 VP24를 인코딩합니다. 이 세 가지 단백질이 함께 작용하여 바이러스 유사 입자를 생성하며, 이 입자 내부의 뉴클레오캡시드가 게놈 복제와 전사를 수행할 수 있으므로 이를 전사 및 복제 가능 바이러스 유사 입자 또는 TRVLP라고 부릅니다. TRVLP는 에볼라 바이러스 당단백질인 GP-one two를 포함하고 있기 때문에 표적 세포를 감염시킬 수 있습니다.

이 표적 세포들은 np, VP35, VP30 및 L의 발현 플라스미드로 사전 형질전환되었습니다. 이러한 RNP 단백질들은 TRVLP 내부에 포함되어 표적 세포로 유입된 미니 게놈을 함께 인식합니다. 이후 미니 게놈이 복제 및 전사되어 리포터 활성이 나타나며, 새로운 TRVLP가 생성되어 다시 새로운 표적 세포를 감염시키는 데 사용될 수 있습니다.

중요한 점은, 미니 게놈이 복제에 필요한 유전 정보를 가지고 있지 않다는 것입니다. 따라서 TRVLP는 4가지 RNP 단백질을 발현하지 않는 세포를 생산적으로 감염시킬 수 없습니다. 이러한 특성 덕분에 이 시스템은 생물안전등급 2단계(biosafety level two) 조건 하에서 안전하게 사용될 수 있습니다.

이 방법의 주요 장점은 생물안전등급 2단계(biosafety level two) 조건에서 게놈 복제, 바이러스 유전자 산물의 발현, 바이러스 입자 생성, 그리고 여러 번의 인젝터 팩터(inject factors) 사이클에 걸친 표적 세포 감염을 포함한 전체 바이러스 생애 주기를 모델링할 수 있다는 점입니다. 이는 살아있는 에볼라 바이러스(Ebola viruses) 연구에 필수적인 최고 등급 격리 실험실 없이도 해당 연구를 수행할 수 있음을 의미합니다. 또한, 이 방법은 세포 인자의 RNA 매개 넉다운(knockdown)이나 해당 인자의 과발현과 같은 다른 기술과 결합하여 바이러스 생물학에서 이러한 인자들의 역할을 연구하는 데 활용될 수 있습니다. 아울러, 바이러스 유전자에 돌연변이를 도입함으로써 바이러스 생물학에서 이러한 유전자와 그 유전자 산물의 역할을 연구할 수 있습니다.

80~90% 밀도로 증식한 293T 세포에서 배지를 제거하고, PBS로 두 번 세척한 후 트립신 2 mL를 첨가하여 세포를 분리합니다. 세포가 둥글게 될 때까지 기다립니다.

그 후 플라스크를 가볍게 두드려 세포를 떼어내고, 10%FBS가 포함된 배지 8mL를 세포에 첨가합니다. 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 측정한 다음, 세포 농도를 2×10⁵ cells/mL로 희석하여 6-well 플레이트의 각 웰에 2mL씩 분주합니다. 세포를 5%CO2가 포함된 37°C 가습 배양기에 다시 넣습니다. 24시간 후, TRVLPs 생산에 필요한 플라스미드를 세포에 트랜스펙션합니다. BSC 내에서 필터 팁을 사용하여 DNA를 튜브에 피펫팅합니다. 음성 대조군으로 한 개의 웰에서는 바이러스 중합효소 L을 인코딩하는 플라스미드를 제외하며, 대신 트랜스펙션 효율을 시각화하기 위해 GFP를 인코딩하는 플라스미드를 트랜스펙션할 수 있습니다. 그다음 DNA에 웰당 100µL의 optimum을 첨가합니다. 튜브를 볼텍싱하고 원심분리하여 가라앉힙니다.

다음으로, 희석된 DNA에 7.5 µL의 transIT LT-one transfection reagent를 첨가합니다. 튜브를 가볍게 볼텍싱하고 실온에서 15분 동안 배양합니다. 15분 후, 피펫팅을 통해 transfection 혼합물을 부드럽게 섞은 다음, 6-웰 플레이트의 각 웰에 100 µL씩 한 방울씩 떨어뜨려 첨가합니다.

세포에 형질전환 복합체를 첨가한 후, 플레이트를 앞뒤와 좌우로 가볍게 흔들어 줍니다. 플레이트를 회전시키며 섞으면 형질전환이 균일하게 이루어지지 않으므로 주의하십시오. 그 후, 세포를 인큐베이터로 옮깁니다. 형질전환 24시간 후에 세포에서 상층액을 제거합니다. 그런 다음 5% FBS가 포함된 배지 4 mL를 세포에 첨가하고 다시 인큐베이터로 옮깁니다.

생산 세포의 형질전환 24시간 후에 앞서 설명한 대로 293T 세포를 분할합니다. 분할 24시간 후, Ebola virus의 RNP 단백질을 인코딩하는 플라스미드와 Ebola virus의 부착 인자로 작용하는 Tim-one을 이 세포들에 형질전환합니다. 생산 세포 형질전환 72시간 후 및 표적 세포 형질전환 24시간 후에 생산 세포로부터 상층액을 수확하여 15 milliliter 튜브에 피펫으로 옮깁니다.

상층액을 수확한 후, 남아 있는 액체를 모두 제거하고 세포에 250 µL의 glow lysis buffer를 가한 뒤 실온에서 최소 10분 동안 배양합니다. 그 다음, 이 영상의 세 번째 단계에서 설명한 대로 루시페라아제 활성을 측정합니다. 그동안 생산 세포에서 얻은 상층액을 실온, 800 g에서 5분 동안 원심 분리합니다.

그런 다음 표적 세포에서 배지를 제거하고, P-zero 세포의 정제된 상층액 3 mL를 표적 세포에 추가합니다. 각 웰마다 이 작업을 수행하십시오. 완료 후 표적 세포를 인큐베이터에 다시 넣습니다. 감염 24시간 후.

표적 세포에서 상층액을 제거합니다. 그런 다음 5% FBS가 포함된 배지 4 mL를 세포에 첨가하고 인큐베이터로 되돌립니다. 생산 세포 또는 표적 세포의 리포터 활성을 측정하기 위해, 생산 세포의 경우 트랜스펙션 72시간 후, 표적 세포의 경우 감염 72시간 후에 세포를 회수합니다.

이를 위해, 세포에서 상층액을 제거하고 250 µL의 glow lysis buffer를 세포에 첨가한 후 실온에서 최소 10분 동안 배양합니다. 필요한 경우, 상층액을 사용하여 새로운 표적 세포를 감염시킬 수 있습니다. 이 경우, 상층액을 수확하고 이 비디오의 두 번째 단계에 설명된 대로 표적 세포를 감염시킵니다.

그동안 웰당 40 µL의 luciferase assay buffer를 해동하고, buffer 부피의 1/100에 해당하는 luciferase substrate를 첨가합니다. 완성된 luciferase 시약을 vortexing하고, 다음 단계로 진행하기 전 상온에 도달했는지 확인합니다. 그런 다음 시약 40 µL를 흰색 불투명 96 웰 플레이트에 피펫팅합니다. 크로스톡(crosstalk) 문제를 방지하기 위해 샘플 웰 사이에 한 웰을 비워두는 것이 좋습니다. 10분간의 배양이 끝나면 피펫팅을 통해 세포를 lysis buffer로 세척하고, 세포 용해물을 튜브로 옮깁니다. 용해물을 상온에서 10,000 g로 3분간 원심분리합니다. 이후 용해물 40 µL를 luciferase 시약이 들어 있는 96 웰 플레이트에 피펫팅합니다. 샘플을 상온에서 10분간 배양합니다. 10분 후, 루미노미터를 사용하여 luciferase 활성을 측정합니다. 발광 측정의 적분 시간은 1초로 설정해야 합니다. modulus microplate 루미노미터를 사용할 때 양성 대조군의 전형적인 발광 신호는 약 1 × 10⁶에서 1 × 10⁷ 정도이며, 음성 대조군의 신호는 최소 2~3 log 낮아야 합니다. 후속 계대 배양 시 양성 대조군의 리포터 활성은 안정적으로 유지되어야 하는 반면, 음성 대조군의 리포터 활성은 배경 수준으로 떨어져야 합니다.

이 영상을 시청한 후에는 에볼라 바이러스의 복제 및 전사가 가능한 바이러스 유사 입자를 제작하고, 이를 사용하여 표적 세포를 감염시키며, 생산 세포와 표적 세포에서 리포터 활성을 측정할 수 있어야 합니다.

중요한 점은, 이 방법을 RNA 매개 세포 인자 넉다운(knockdown)과 같은 다른 기술과 결합하여 바이러스 생물학에서 이러한 인자들의 역할을 연구할 수 있다는 것입니다. 또한, 이 방법에서 사용되는 바이러스 구성 요소에 돌연변이를 도입하여 에볼라 바이러스 생명 주기에서 해당 구성 요소들의 역할을 연구할 수 있습니다. 추가적인 실험 세부 사항과 특정 시약은 이 비디오에 첨부된 논문에서 확인할 수 있습니다.