마우스의 얼굴 신경 Axotomy : 부상으로 운동 신경 응답을 연구하는 모델

이 절차의 전반적인 목표는 말초 신경 손상을 연구하기 위해 안면 신경을 노출시키는 것입니다. 안면 신경은 뇌줄기의 교뇌에서 시작되어 경유돌공을 통해 두개골을 빠져나오며, 이후 신경은 주요 분지들로 나뉩니다.

노출이 완료되면, 경유돌공(stylo mastoid foramen)에서 나오는 신경을 자가 절단합니다. 안면 신경의 위치를 찾는 데 두 가지 주요 지표가 도움이 됩니다. 첫 번째는 얇은 막으로 연결된 진주빛 흰색 연골판으로 구성된 외이도입니다.

다른 하나는 신경과 그것이 경유돌기乳突孔(stylo mastoid foramen)을 통해 나오는 지점 위에 위치하는 이복근의 전복입니다. 안면신경이 손상된 후, 연구자는 운동 신경세포 사멸이나 유전자 발현과 같은 여러 요인을 연구할 수 있습니다. 안면신경 손상 모델은 가장 잘 규명된 말초신경 손상 모델 중 하나입니다.

이 기술의 장점은 간편함, 높은 재현성, 그리고 이후 발생하는 안면 마비가 생체 기능에 영향을 미치지 않는다는 점입니다. 또한, 신경계의 매우 대칭적인 특성 덕분에 손상되지 않은 쪽을 실험의 쌍을 이룬 내부 대조군으로 사용할 수 있습니다. 이 절차 전반에 걸쳐 무균 조작법을 유지하기 위해, 모든 도구를 오토클레이브로 멸균하고 조작 단계 사이사이에 도구를 멸균할 수 있도록 유리 비드 멸균기를 준비하십시오.

가열 패드 위에 흡수 패드를 놓고, 현미경을 설치한 후 코 콘이 시야의 가장자리에 맞춰지도록 테이프로 고정하여 수술대를 준비합니다. 마우스를 마취시킨 후, 발가락 꼬집기를 포함한 조작에 대해 마우스가 신체적 반응을 보이지 않는지 확인합니다. 그런 다음 가스 흐름을 마취 챔버에서 코 콘으로 전환하고 off thalamic 연고를 도포합니다.

가열 패드가 깔린 수술용 패드 위에 마우스의 왼쪽 면이 닿도록 배치합니다. 동물의 호흡을 지속적으로 관찰하고, 마취 상태를 유지하기 위해 필요에 따라 ISO fluorine 유량을 조절합니다. 다음으로 수술 부위를 노출시키기 위해 오른쪽 귀를 코 콘(nose cone)에 테이프로 고정합니다.

귀 뒤쪽으로 지나가는 후이정맥(posterior auricular vein)을 확인해야 합니다. 다음으로, 털을 70% ethanol로 적신 후 해당 부위를 제모합니다. 털을 제거한 후, 요오드와 70% ethanol을 교대로 세 번 문질러 닦아내어 해당 부위를 철저히 소독합니다.

수술을 진행합니다. 입 부분이 옆으로 오도록 배치하고 귀 정맥이 수평으로 지나가게 하여 위치를 잡으십시오. 이렇게 하면 안면 신경을 훨씬 더 쉽게 찾을 수 있습니다.

첫 번째 절개 부위를 결정하기 위해, 귀에서부터 이개 돌기(ear protuberance) 후방 영역까지 후이정맥(posterior auricular vein)의 경로를 따라 확인합니다. 그 다음, 교육 목적으로 이개 돌기에서 후방으로 2~3 mm 떨어진 지점에 스프링 가위를 사용하여 4 mm 길이의 절개를 가합니다. 이 절개창은 하부 해부 구조를 노출시키기 위해 더 확장될 것입니다.

이제 피하 지방과 근막을 둔성 박리하십시오. 가위로 인해 혈관과 근육이 쉽게 손상될 수 있습니다. 출혈이 발생할 경우.

멸균 면봉으로 최소 30초 동안 압박합니다. 상당량의 체액 손실이 발생한 경우, 25 또는 27 gauge 바늘을 사용하여 생리식염수를 복강 내에 최대 0.5 mL까지 주입합니다. 이제 주요 지표를 사용하여 안면 신경의 위치를 찾습니다.

부신경(spinal accessory nerve)은 안면신경(facial nerve)보다 표층에 위치하며, 두개골의 후두부를 통해 이동하는 것을 확인할 수 있습니다. 승모근(trapezius muscle)에 신경을 분포시키려면 연골성 외이도를 찾으십시오. 외이도는 진주빛 흰색이며 안면신경의 주둥이 쪽에 위치합니다.

안면신경은 외이도의 외측 부분을 감싸고 있습니다. 이어서 안면신경의 위쪽이자 외측에 위치한 전복측이복근의 근복을 확인하십시오. 이 구조물 아래를 박리하여 안면신경을 노출시킵니다.

이는 하부 근막 층에 부착된 견고한 흰색 구조물입니다. 안면신경의 주요 분지들을 확인하십시오. 이 분지들을 등쪽으로 따라가며 경유돌기공에서 기시하는 지점을 찾으십시오.

미세 핀셋으로 부위를 벌려 고정한 상태에서 스프링 가위의 끝을 사용하여 안면신경 경로를 따라 박리합니다. 핀셋으로 유양돌기의 뼈 부분을 확인할 수 있습니다. 이제 안면신경 주간을 찾아 신경을 압착합니다.

미세 핀셋을 사용하여 일정한 압력으로 30초 동안 압착합니다. 이렇게 하면 모든 축삭이 절단됩니다. 그런 다음 수직 방향으로 30초 동안 다시 압착합니다.

실험 간에 압력을 일정하게 유지하십시오. 관련 해부학적 지표를 확인했으므로, 이제 더 정교한 수술 기법을 시연하겠습니다. 더 작은 절개창을 사용하여, 귀에서부터 귀 돌기 후방 영역까지 후이정맥을 조심스럽게 추적하고, 돌기에서 후방으로 2~3 mm 떨어진 지점에 4 mm 절개를 가합니다.

이제 세 가지 지표인 부신경, 외이도, 이복근 전복을 이용하여 피하 지방과 근막을 과감하게 절개하십시오. 안면신경을 노출시킵니다. 안면신경의 주줄기에 도달하기 위해 안면신경을 따라 경유돌기공 방향으로 추적한 뒤, 미세 핀셋으로 신경을 조심스럽게 고정하고 가위로 절단하여 신경을 차단하십시오.

신경에 너무 많은 견인력을 가하지 마십시오. 그렇지 않으면 뇌줄기에서 뽑혀 나올 수 있습니다. 그런 다음 신경 단면을 서로 떨어뜨리거나 신경의 일부 분절을 제거하여 재연결이 일어나지 않도록 합니다. 마지막으로 신경을 주의 깊게 검사하여 완전히 절단되었는지 확인하십시오.

적출 후, 모든 지방과 근육을 원래의 대략적인 위치로 되돌려 놓습니다. 그런 다음 7.5 밀리미터 상처 클립 봉합사 또는 시아노아크릴레이트 접착제를 사용하여 상처를 폐쇄합니다. 필요 시 이때 진통제를 투여하고, 마취를 중단한 후 쥐를 깔짚이 없는 빈 케이지로 옮깁니다.

동물이 회복되는 동안 안면 마비 징후가 있는지 확인하는데, 이때 수염이 마비됩니다. 수염이 뺨 쪽으로 뒤로 젖혀져 있다면 코가 휘어 보이고, 공기 분사에 반응하여 눈을 깜빡이지 않게 됩니다. 이제 동물이 암컷이라면 다른 암컷과 함께 사육하십시오.

하지만 수컷 생쥐의 눈 깜빡임 기능이 회복될 때까지는 단독 사육하며, 각막 합병증을 예방하기 위해 매일 안구 연고를 도포하십시오. 그동안 수술 부위가 치유될 때까지 생쥐에게 감염 징후나 기타 합병증이 나타나는지 관찰하십시오. 8주령에 안면 신경 절단을 시행한 야생형 동물의 경우, 생쥐의 연령과 유전적 배경에 따라 적출 후 운동 뉴런 소실 정도에 상당한 차이가 있습니다.

축삭 절단 후 28일 시점에 운동 신경세포의 약 86%가 생존하였습니다. 근위축성 측삭 경화증의 SOD1 마우스 모델과 면역 결핍 Rag2 knockout 마우스 레이저 캡처 모델에서는 세포 손실이 유의하게 더 많이 관찰되었습니다.

안면 운동핵에서 물질을 분리하기 위해 미세절단법을 사용하였습니다. 안면 운동핵 전체를 채취할 수 있으며, 또는 하핵들을 각각 개별적으로 수집할 수도 있습니다.

이 기술은 정밀도가 매우 높습니다. 운동 신경세포를 개별적으로 포착할 수 있으며, 남은 신경 펠렛 또한 이후 분석을 위해 수집할 수 있습니다. 점선으로 표시된 복내측핵과 실선으로 표시된 복외측핵의 하핵 샘플 내 유전자 발현을 조사하기 위해 정량적 PCR을 사용하였으며, 신경 재생 반응과 관련된 4가지 유전자의 발현을 측정하였습니다.

이들의 하위 핵들 사이에서 일부 차이점이 발견되었습니다. Gap 43 발현은 하위 핵들 간에 가장 큰 차이를 보였습니다. 이 기술을 숙달하면 수술을 단 몇 분 만에 완료할 수 있습니다.

동물을 올바르게 배치하고, 정확한 위치에 절개하며, 해부학적 지표를 사용하여 안면신경의 위치를 찾는 것이 중요합니다. 머리와 목 부위에서는 방향을 잃기 쉬우므로, 만약 위치를 찾기 어렵다면 연골성 외이도를 찾아 후방으로 추적하여 안면신경을 찾으십시오.