Name: 말라리아 모기 전송하기위한 다중 탐지 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: 학습하세요 MALDI-TOF SNP 유전자형 분석을 활용한 말라리아 모기 다중 특성 동시 탐지 방법을. 종 식별, 살충제 내성, 기생충 감염 및 숙주 선택 행동을 분석하여 말라리아 방제 전략 수립에 필수적인 역학 정보를 제공합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

우리는 박사 감사합니다. 탄자니아에서 모기 표본을 제공 글래스고 대학의 UC 데이비스 박사 카타리나 Kreppel에서 앤서니 코르 넬과 로라 노리스. 우리는 잠비아에서 모기 샘플을 공유하기 위해 공중 보건의 존스 홉킨스 대학원에서 양 Smita 다스 박사 더글러스 노리스 감사합니다. 우리는 또한 분석 디자인 교육에 대한 동물 유전학 연구소 이씨 V. 밀론 감사합니다. 이 작품은 R01AI 078183과 R21AI062929을 부여 건강의 국립 연구소에 의해 지원되었다.

1. PCR 증폭 <ol><li> 1.5 ㎖ 마이크로 튜브의 모든 PCR 프라이머를 (보충 테이블 S1 참조) 섞는다. 각각의 SNP는 두 개의 프라이머 (순방향 및 역방향)가 있습니다. 각 PCR 프라이머의 주식 농도를 100 μM로 유지되어 있는지 확인합니다. (보충 표 S2 참조) 벤치에서 오류와 시간을 피펫 팅 줄이기 위해 500 ~ 1,000 반응에 대한 충분한 프라이머 믹스를 확인합니다. 원하는 경우, -20 ° C에서 튜브 및 상점 당 100 ~ 200 반응의 분량을 준비합니다. </li><li> 제조 업체의 프로토콜 (표 1)에 설명 된대로 PCR 칵테일을 준비합니다. 96 반응의 부피는 20 %의 돌출부를 포함한다. 소용돌이 2,000 x g에서 30 초간 가볍게 PCR의 칵테일을 함유하는 원심 분리기 튜브. </li><li> 각각의 우물에 PCR 칵테일 3 μl를 96 웰 플레이트에 분주 비 스커트. 리피터 피펫은이 프로세스에 대해 시간을 절약 할 수 있습니다. </li><li> 각 웰에 모기의 적절한 게놈 DNA의 2 μl를 추가합니다. 주 : m으로부터 게놈 DNA를 얻는 공정<html> osquito 조직 (머리 / 흉부, 복부 또는 전신)는 다른 문헌 29 ~ 32에 설명되어 있습니다. (머리 / 흉부에 말라리아를) 감염 모기의 혈액 (복부)에서 말라리아와 사람들을 구별하기 위해 적절한 DNA 추출 프로토콜을 선택합니다. 우리는 일반적으로 모기의 신체 부위 (머리 / 흉부 또는 복부)에서 추출 된 DNA를 사용하므로 DNA 농도는 0.05-2ng / μL에 따라 다릅니다. 총 DNA 입력이 제조업체의 권장 사항 (5-10ng / RXN)보다 낮지 만, 우리는 일반적으로 강력한 SNP가 전체 게놈 증폭없이 DNA 샘플의 98 %에서 호출 얻을. </li><li> 370 x g에서 1 분간 혼합 또는 소용돌이, 원심 분리기 부드럽게, 플레이트를 밀봉합니다. </li><li> PCR 증폭을 수행하기 위해 다음과 같은 열 순환기 프로토콜을 사용한다 : (1) 94 ° C 2 분 동안, (2) 94 ° C 30 초, (3) 1 분 30 초 동안 56 ° C, (4) 72 ° C (5) 단계를 반복합니다 (2) - (4) 45 사이클, (6) 1 분, 4 ℃로 유지 72 ° C. </li></ol>_title &quot;&gt; 2. SAP 치료 <ol><li> 96 웰 플레이트에서 SAP 효소 용액을 제조 하였다 (표 2 참조). 접시에 96 샘플을 처리합니다. 96 반응의 부피는 20 %의 돌출부를 포함한다. </li><li> 소용돌이 2,000 × g으로 30 초 동안 SAP 효소 가볍게 솔루션과 원심 분리기 튜브. 각 웰에 SAP 효소 용액 2 μl를 분주한다. 다시 말하지만, 리피터 피펫은이 프로세스에 대해 시간을 절약 할 수 있습니다. </li><li> 370 x g에서 1 분간 혼합 또는 소용돌이, 원심 분리기 부드럽게, 플레이트를 밀봉합니다. 40 분 (1) 37 ° C, (2) 85 ° C를 5 분 동안 효소를 불 활성화 (3) 4 ° C를 유지, 다음과 같이 판을 품어. 이 단계의 완료시 계속하기 전에 -20 ° C에서 접시를 저장합니다. 이주 내에 저장 판을 처리합니다. </li></ol> 3. SNP 확장 <ol><li> 샘플 플레이트 SAP 처리 후에 고정되는 경우, 진행하기 전에 실온으로 해동 할 수있다. </li><li> 확장 프라이머 믹스 (보충 표 S2)를 준비합니다. 각각의 SNP는 하나의 엑스 테가nsion 프라이머. 500 μM에서 각 확장 프라이머의 주식 농도를 유지합니다. 선택적으로, -20 ° C에서 튜브 및 매장 당 100 ~ 200 반응에 나누어지는. </li><li> 96 반응 부피가 20 %의 돌출부를 포함 표 3에 기술 된 바와 같이 확장 믹스를 준비한다. </li><li> 소용돌이 2,000 × g으로 30 초 동안 연장 가볍게 칵테일과 원심 분리기 튜브. 각 웰에 확장 칵테일 2 μl를 분배. 다시 말하지만, 리피터 피펫은이 프로세스에 대해 시간을 절약 할 수 있습니다. </li><li> 370 x g에서 1 분간 혼합 또는 소용돌이, 원심 분리기 부드럽게, 플레이트를 밀봉합니다. 도 1에 도시 된 바와 같이 열 순환 플레이트. 이때, 질량 분석을 진행 또는 이주에 -20 ° C에서 최대 플레이트를 저장한다. </li></ol> 4. 컨디셔닝 SNP 확장 제품 질량 분석기 분석을 최적화하는 <ol><li> 샘플 플레이트 SNP 확장 후에 특히 동결이 진행하기 전에 실온으로 해동 할 수있다. </li><li> 그 접점에서 수지의 15 mg을 이동연장 된 스푼을 사용하여 딤플 접시에 INER. 딤플 판의 우물에 수지를 확산 스크레이퍼를 사용합니다. 수지를 확산 딤플 접시에 걸쳐 좌우로 스크레이퍼 스윕. 수지는 각 웰에가 있는지 확인합니다. </li><li> 스크레이퍼를 사용하여 딤플의 접시를 초과하는 수지를 쳤어요. 수지가 적어도 20 분 동안 플레이트 딤플 스탠드하자. 수지, 딤플 플레이트에 서 샘플 플레이트의 각 웰에 HPLC 등급의 물을 41 μL를 추가시키는있다. </li><li> 조심스럽게 딤플 판에 샘플 판 거꾸로 놓으십시오. 딤플 판의 우물 시료 판의 우물을 정렬 딤플 판의 작은 둥근 게시물에 대한 샘플 판 재설정해야합니다. </li><li> 수지는 샘플 플레이트의 우물에 딤플 판에서 쓰러 함께 샘플 플레이트와 딤플 판을 잡고 천천히을 뒤집어. 수지는 샘플 플레이트에 빠지고 있도록 딤플 판을 누릅니다. 디에 있는지 모든 수지 확인mple 플레이트는 샘플 판 우물에 빠지고. 30 초 동안 3,200 XG에서 접시를 원심 분리기. </li><li> RT에서 5 분 동안 회전에서 샘플 판을 돌립니다. 로테이터는 샘플 판을 장축을 약 360도 회전한다. </li><li> 5 분 동안 3,200 XG에서 샘플 판을 원심 분리기. 이 단계 후에, 다음 단계로 진행하기 전에 이주 -20 ° C에서 샘플 플레이트를 저장한다. </li></ol> 5. MALDI-TOF 질량 분석 <ol><li> 제조업체의 지침에 따라 같은 SpectroCHIP로 bioarray에 조절 된 SNP 확장 제품을 전송합니다. 우리는이 단계 MassArray Nanodispenser를 사용합니다. </li><li> 전송이 완료되면, 분석 및 플레이트가 분석 데이터베이스에 설정되는 방법을 정의한다. 각각의 판은, 특정 분석 설계 (보충 표 S3)에 링크 고유 식별자를 갖도록 분석과 판의 이름을 지정합니다. </li><li> 분석 접시가 정의 된 후, 질량 분석계를 사용하여 스펙트럼을 획득. </li></ol><ol><li> 이러한 타이 퍼 분석기 나 TyperViewer (Sequenom)로서 실시간 PCR 분석 데이터 해석 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 수행한다. 각 웰에 대한 샘플 레이아웃, 질량 스펙트로 포함 .XML 형식으로 데이터를 구하는, 이름을 포함 마커 정보, 대응하는 SNP의 각 변이체에 대한 예상 질량, 및 오류 또는 각각의 반응과 관련된 경고 메시지. 결과 질량 스펙트로 그램 그림 2를 참조하십시오. </li><li> . 각 유전자형 허용 공차 / 차이 (잡음비 크기 또는 신호) 검출 임계 값을 설정하여 SNP 유전자형 클러스터링 분석을 수행 3 04707-KDR # 2 SNP 유전자형 클러스터의 예를 보여준다. </li><li> 스프레드 시트 프로그램에 결과 SNP 유전자형 호출을 보냅니다. </li></ol>

<ol><li>Ayala, F. J., Coluzzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+speciation%3A+humans%2C+Drosophila%2C+and+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chromosome speciation: humans, Drosophila, and mosquitoes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, Suppl 1. 6535-6542 (2005).</li>
<li>Coetzee, M., Craig, M., le Sueur, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+African+malaria+mosquitoes+belonging+to+the+Anopheles+gambiae+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol+Today%22%5BJournal%5D)">Distribution of African malaria mosquitoes belonging to the Anopheles gambiae complex.</a> Parasitol Today. 16, 74-77 (2000).</li>
<li>Favia, G., Lanfrancotti, A., Spanos, L., Siden-Kiamos, I., Louis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+ribosomal+DNA+polymorphisms+discriminating+among+chromosomal+forms+of+Anopheles+gambiae+s.s%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of ribosomal DNA polymorphisms discriminating among chromosomal forms of Anopheles gambiae s.s.</a> Insect Mol Biol. 10, 19-23 (2001).</li>
<li>Fanello, C., Santolamazza, F., Torre, della, A, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+identification+of+species+and+molecular+forms+of+the+Anopheles+gambiae+complex+by+PCR-RFLP%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Vet+Entomol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous identification of species and molecular forms of the Anopheles gambiae complex by PCR-RFLP.</a> Med Vet Entomol. 16, 461-464 (2002).</li>
<li>Santolamazza, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analyses+reveal+discrepancies+among+results+of+commonly+used+methods+for+Anopheles+gambiae+molecular+form+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+J%22%5BJournal%5D)">Comparative analyses reveal discrepancies among results of commonly used methods for Anopheles gambiae molecular form identification.</a> Malar J. 10, 215(2011).</li>
<li>Santolamazza, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertion+polymorphisms+of+SINE200+retrotransposons+within+speciation+islands+of+Anopheles+gambiae+molecular+forms%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+J%22%5BJournal%5D)">Insertion polymorphisms of SINE200 retrotransposons within speciation islands of Anopheles gambiae molecular forms.</a> Malar J. 7, 163(2008).</li>
<li>Santolamazza, F., Della Torre, A., Caccone, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+report%3A+A+new+polymerase+chain+reaction-restriction+fragment+length+polymorphism+method+to+identify+Anopheles+arabiensis+from+An.+gambiae+and+its+two+molecular+forms+from+degraded+DNA+templates+or+museum+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">Short report: A new polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism method to identify Anopheles arabiensis from An. gambiae and its two molecular forms from degraded DNA templates or museum samples.</a> Am J Trop Med Hyg. 70, 604-606 (2004).</li>
<li>Lee, Y., Marsden, C. D., Nieman, C., Lanzaro, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+multiplex+SNP+genotyping+assay+for+detecting+hybridization+and+introgression+between+the+M+and+S+molecular+forms+of+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol+Resour%22%5BJournal%5D)">A new multiplex SNP genotyping assay for detecting hybridization and introgression between the M and S molecular forms of Anopheles gambiae.</a> Mol Ecol Resour. , (2013).</li>
<li>Scott, J. A., Brogdon, W. G., Collins, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+single+specimens+of+the+Anopheles+gambiae+complex+by+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">Identification of single specimens of the Anopheles gambiae complex by the polymerase chain reaction.</a> Am J Trop Med Hyg. 49, 520-529 (1993).</li>
<li>White, B. J., Cheng, C., Simard, F., Costantini, C., Besansky, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+association+of+physically+unlinked+islands+of+genomic+divergence+in+incipient+species+of+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol%22%5BJournal%5D)">Genetic association of physically unlinked islands of genomic divergence in incipient species of Anopheles gambiae.</a> Mol Ecol. 19, 925-939 (2010).</li>
<li>Hahn, M. W., White, B. J., Muir, C. D., Besansky, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+evidence+for+biased+co-transmission+of+speciation+islands+in+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">No evidence for biased co-transmission of speciation islands in Anopheles gambiae.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 367, 374-384 (2012).</li>
<li>Lee, Y., Marsden, C. D., Nieman, C., Lanzaro, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+multiplex+SNP+genotyping+assay+for+detecting+hybridization+and+introgression+between+the+M+and+S+molecular+forms+of+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol+Resour%22%5BJournal%5D)">A new multiplex SNP genotyping assay for detecting hybridization and introgression between the M and S molecular forms of Anopheles gambiae.</a> Mol Ecol Resour. 14, 297-305 (2014).</li>
<li>Reimer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+kdr+mutation+and+resistance+to+pyrethroid+and+DDT+insecticides+in+natural+populations+of+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Entomol%22%5BJournal%5D)">Relationship between kdr mutation and resistance to pyrethroid and DDT insecticides in natural populations of Anopheles gambiae.</a> J Med Entomol. 45, 260-266 (2008).</li>
<li>Weill, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kdr+mutation+occurs+in+the+Mopti+form+of+Anopheles+gambiae+s.s.+through+introgression%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The kdr mutation occurs in the Mopti form of Anopheles gambiae s.s. through introgression.</a> Insect Mol Biol. 9, 451-455 (2000).</li>
<li>Tripet, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+survey+of+knockdown+resistance+to+pyrethroid+%28kdr%29+in+Mali%2C+West+Africa%2C+and+evidence+of+its+emergence+in+the+Bamako+form+of+Anopheles+gambiae+s.s%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">Longitudinal survey of knockdown resistance to pyrethroid (kdr) in Mali, West Africa, and evidence of its emergence in the Bamako form of Anopheles gambiae s.s.</a> Am J Trop Med Hyg. 76, 81-87 (2007).</li>
<li>Martinez-Torres, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+pyrethroid+knockdown+resistance+%28kdr%29+in+the+major+malaria+vector+Anopheles+gambiae+s.s%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of pyrethroid knockdown resistance (kdr) in the major malaria vector Anopheles gambiae s.s.</a> Insect Mol Biol. 7, 179-184 (1998).</li>
<li>Diabate, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KDR+mutation%2C+a+genetic+marker+to+assess+events+of+introgression+between+the+molecular+M+and+S+forms+of+Anopheles+gambiae+%28Diptera%3A+Culicidae%29+in+the+tropical+savannah+area+of+West+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Entomol%22%5BJournal%5D)">KDR mutation, a genetic marker to assess events of introgression between the molecular M and S forms of Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) in the tropical savannah area of West Africa.</a> J Med Entomol. 40, 195-198 (2003).</li>
<li>Chandre, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+distribution+of+a+pyrethroid+resistance+gene+%28kdr%29+in+Anopheles+gambiae+complex+from+west+Africa+and+further+evidence+for+reproductive+isolation+of+the+Mopti+form%5BTitle%5D)+AND+%22Parassitologia%22%5BJournal%5D)">Current distribution of a pyrethroid resistance gene (kdr) in Anopheles gambiae complex from west Africa and further evidence for reproductive isolation of the Mopti form.</a> Parassitologia. 41, 319-322 (1999).</li>
<li>Fornadel, C. M., Norris, L. C., Franco, V., Norris, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+anthropophily+in+the+potential+secondary+malaria+vectors+Anopheles+coustani+s.l.+and+Anopheles+squamosus+in+Macha%2C+Zambia%5BTitle%5D)+AND+%22Vector+Borne+Zoonotic+Dis%22%5BJournal%5D)">Unexpected anthropophily in the potential secondary malaria vectors Anopheles coustani s.l. and Anopheles squamosus in Macha, Zambia.</a> Vector Borne Zoonotic Dis. 11, 1173-1179 (2011).</li>
<li>Snounou, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sensitivity+of+detection+of+human+malaria+parasites+by+the+use+of+nested+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+biochemical+parasitology%22%5BJournal%5D)">High sensitivity of detection of human malaria parasites by the use of nested polymerase chain reaction.</a> Molecular and biochemical parasitology. 61, 315-320 (1993).</li>
<li>Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genus-+and+species-specific+nested+polymerase+chain+reaction+malaria+detection+assay+for+epidemiologic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">A genus- and species-specific nested polymerase chain reaction malaria detection assay for epidemiologic studies.</a> Am J Trop Med Hyg. 60, 687-692 (1999).</li>
<li>Oyedeji, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+PCR-based+detection+of+Plasmodium+falciparum+infections+based+on+single+and+multicopy+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+J%22%5BJournal%5D)">Comparison of PCR-based detection of Plasmodium falciparum infections based on single and multicopy genes.</a> Malar J. 6, 112(2007).</li>
<li>Gama, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+PCR+versus+conventional+PCR+for+malaria+parasite+detection+in+low-grade+parasitemia%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+parasitology%22%5BJournal%5D)">Real-time PCR versus conventional PCR for malaria parasite detection in low-grade parasitemia.</a> Experimental parasitology. 116, 427-432 (2007).</li>
<li>Kent, R. J., Norris, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+mammalian+blood+meals+in+mosquitoes+by+a+multiplexed+polymerase+chain+reaction+targeting+cytochrome%5BTitle%5D)+AND+%22B.+Am+J+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">Identification of mammalian blood meals in mosquitoes by a multiplexed polymerase chain reaction targeting cytochrome.</a> B. Am J Trop Med Hyg. 73, 336-342 (2005).</li>
<li>Fornadel, C. M., Norris, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+endophily+by+the+malaria+vector+Anopheles+arabiensis+in+southern+Zambia+and+identification+of+digested+blood+meals%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">Increased endophily by the malaria vector Anopheles arabiensis in southern Zambia and identification of digested blood meals.</a> Am J Trop Med Hyg. 79, 876-880 (2008).</li>
<li>Teeter, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+variable+genomic+architecture+of+isolation+between+hybridizing+species+of+house+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">The variable genomic architecture of isolation between hybridizing species of house mice.</a> Evolution. 64, 472-485 (2010).</li>
<li>Han, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+association+study+of+survival+in+small-cell+lung+cancer+patients+treated+with+irinotecan+plus+cisplatin+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22The+pharmacogenomics+journal%22%5BJournal%5D)">A genome-wide association study of survival in small-cell lung cancer patients treated with irinotecan plus cisplatin chemotherapy.</a> The pharmacogenomics journal. 14, 20-27 (2014).</li>
<li>Chakraborti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+polyethyleneimine-functionalized+ZnO+nanoparticles+with+bovine+serum+albumin%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir+%3A+the+ACS+journal+of+surfaces+and+colloids%22%5BJournal%5D)">Interaction of polyethyleneimine-functionalized ZnO nanoparticles with bovine serum albumin.</a> Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 28, 11142-11152 (2012).</li>
<li>Marsden, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity%2C+differentiation%2C+and+linkage+disequilibrium%3A+prospects+for+association+mapping+in+the+malaria+vector+Anopheles+arabiensis%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Diversity, differentiation, and linkage disequilibrium: prospects for association mapping in the malaria vector Anopheles arabiensis.</a> G3 (Bethesda). 4, 121-131 (2014).</li>
<li>Methods in Anopheles Research. , Second edition, MR4. Available from:
 <a target="_blank" href="
 http://www.mr4.org/AnophelesProgram/TrainingMethods.aspx">
 http://www.mr4.org/AnophelesProgram/TrainingMethods.aspx</a> 1725-1732 (2010).</li>
<li>Tripet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+analysis+of+transferred+sperm+reveals+significant+levels+of+gene+flow+between+molecular+forms+of+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol%22%5BJournal%5D)">DNA analysis of transferred sperm reveals significant levels of gene flow between molecular forms of Anopheles gambiae.</a> Mol Ecol. 10, 1725-1732 (2001).</li>
<li>Slotman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+subdivision+within+the+M+molecular+form+of+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol%22%5BJournal%5D)">Evidence for subdivision within the M molecular form of Anopheles gambiae.</a> Mol Ecol. 16, 639-649 (2007).</li>
<li>Basu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MassARRAY+Spectrometry+is+More+Sensitive+Than+PreTect+HPV-Proofer+and+Consensus+PCR+for+Type-Specific+Detection+of+High-Risk+Oncogenic+HPV+Genotypes+in+Cervical+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">MassARRAY Spectrometry is More Sensitive Than PreTect HPV-Proofer and Consensus PCR for Type-Specific Detection of High-Risk Oncogenic HPV Genotypes in Cervical Cancer.</a> J Clin Microbiol. , (2011).</li>
<li>Fu, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MassARRAY+assay%3A+a+more+accurate+method+for+JAK2V617F+mutation+detection+in+Chinese+patients+with+myeloproliferative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">MassARRAY assay: a more accurate method for JAK2V617F mutation detection in Chinese patients with myeloproliferative disorders.</a> Leukemia. 22, 660-663 (2008).</li>
<li>Gabriel, S., Ziaugra, L., Tabbaa, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNP+genotyping+using+the+Sequenom+MassARRAY+iPLEX+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">SNP genotyping using the Sequenom MassARRAY iPLEX platform.</a> Curr Protoc Hum Genet. 2 (Unit 2.12), (2009).</li>
<li>Jurinke, C., van den Boom, D., Cantor, C. R., Koster, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+MassARRAY+technology+for+high+throughput+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Biochem+Eng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The use of MassARRAY technology for high throughput genotyping.</a> Adv Biochem Eng Biotechnol. 77, 57-74 (2002).</li>
<li>Wright, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+MassARRAY+spectrometry+%28iPLEX%29+produces+a+fast+and+economical+test+for+56+familial+hypercholesterolaemia-causing+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Genet%22%5BJournal%5D)">Multiplex MassARRAY spectrometry (iPLEX) produces a fast and economical test for 56 familial hypercholesterolaemia-causing mutations.</a> Clin Genet. 74, 463-468 (2008).</li>
<li>Turner, T. L., Hahn, M. W., Nuzhdin, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+islands+of+speciation+in+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Genomic islands of speciation in Anopheles gambiae.</a> PLoS Biol. 3, e285(2005).</li>
<li>Turner, T. L., Hahn, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locus-population-specific+selection+and+differentiation+between+incipient+species+of+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">Locus-population-specific selection and differentiation between incipient species of Anopheles gambiae.</a> Mol Biol Evol. 24, 2132-2138 (2007).</li>
<li>Stump, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centromere-proximal+differentiation+and+speciation+in+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Centromere-proximal differentiation and speciation in Anopheles gambiae.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 15930-15935 (2005).</li>
<li>Lee, Y., Seifert, S. N., Fornadel, C. M., Norris, D. E., Lanzaro, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleotide+polymorphisms+for+high-throughput+genotyping+of+Anopheles+arabiensis+in+East+and+southern+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Entomol%22%5BJournal%5D)">Single-nucleotide polymorphisms for high-throughput genotyping of Anopheles arabiensis in East and southern Africa.</a> J Med Entomol. 49, 307-315 (2012).</li>
<li>Holt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+sequence+of+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The genome sequence of the malaria mosquito Anopheles gambiae.</a> Science. 298, 129-149 (2002).</li>
<li>Lawniczak, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+divergence+between+incipient+Anopheles+gambiae+species+revealed+by+whole+genome+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Widespread divergence between incipient Anopheles gambiae species revealed by whole genome sequences.</a> Science. 330, 512-514 (2010).</li>
</ol>

저자는 공개할 것이 없습니다.

- 비행 (MALDI-TOF) 질량 분석 33-37 시간 PCR 증폭, 새우 알칼리 포스 파타 아제 (SAP) 반응, SNP 확장, 확장 제품 에어컨, 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 : MDA는 5 개의 주요 단계로 구성되어있다. 첫 번째 PCR 증폭 단계는 충분한 주형 DNA가 SNP 확장 단계에서 사용할 수 있도록 각각의 SNP를 측면에서는 DNA를 증폭한다. SAP 반응은 다음과 SNP 확장 단계를 방해 할 수있는 사용하지 않은 dNTPs를 중화. SNP 확장은 SNP의 궤적과 대량 수정 터미네이터 뉴클레오티드 당 하나의 확장 프라이머를 포함한다. 3&#39;- 말단이 변형 된 뉴클레오티드 프라이머 확장에 혼입되는 것을 방지 후속 뉴클레오티드. 따라서, 단일 염기의 질량은 해당 SNP의 유전자형을 나타낸다. 이 접근법의 성공을 보장하는 가장 중요한 단계는 대상 생물체의 존재 다형성 좋은 데이터 세트를 구비한다의. 우리는 종 식별 (N&gt; 9...

학질 모기의 arabiensis, 학질 모기의 coluzzii 아노 펠 레스 gambiae 아프리카 1 말라리아 전송을 담당하는 주요 벡터입니다. 이 세 종은 형태 학적으로 2 구별 만 분자 분석 3-9으로 구별 할 수있다. 또한, 정기적으로 역학 및 인구 유전학 연구를 지원하기 위해 실시 많은 다운 스트림 분석이있다. 이들은 분화 섬 10-12 (1) 유전자형 분석, (2) 아미노산 코돈 파라 유전자의 위치 번째 1014 비 동의어 SNP를 인식 유전자형 분석 (녹다운 저항 또는 KDR, SNP) (13)를 포함 -18, (3) 기생충 검출 PCR 19-23, 모기 midguts 24, 25에서 호스트 별 DNA (4) 검사. 우리의 목표와 하나의 멀티 플렉스 반응으로 모든 분석을 결합한 다중 탐지 분석 (MDA)을 개발아프리카에서 말라리아 벡터의 역학적으로 중요한 특성을 alyzing. MDA 분석 여러 (1) 종을 검출하기위한 마커 (A.의 arabiensis, A.의 gambiae, A.의 coluzzii, 또는 3 개)의 기타 (없음) KDR의 SNP로 표현, (2) 살충제 저항을 포함 (L1014F 및 L1014S 모두) 두 가지 주요 말라리아 기생충, (3)의 존재, 말라리아 원충 및 P. 삼일 열, 하나의 조류와 여섯 포유류 호스트에서 (4) 혈액 소스. 전통적으로, 이러한 분석은 분리 된 중합 효소 연쇄 반응을 수행 하였다. 이러한 모든 분석은 종래의 PCR 플랫폼을 사용을 완료하면, 그것은 8-10 PCR 반응 분석을 수행하고 전기 영동 단계를 수반하는 요구한다. 여기에 제시된 MDA 방식은 전체에서 약 5 시간 소요하면서 문서화 결과에 준비에서 각 PCR 반응은, 4 ~ 5 시간이 걸립니다. 이 단독으로 노동 비용을 90 % 절감하는 것과 같습니다. MDA는 여기에 제시된 5 달러 비용샘플 당 모두 33 개의 SNP 유전자형합니다. 이것은 상당히 저렴 샘플 당 약 $ 1.50의 요금으로 하나의 아가 로스 젤 기반 분석,보다. MDA 의해 덮여 모든 특성을 검출 분석은 샘플 당 $ 12-15의 비용 8-10 별도 아가 로스 겔 - 기재 분석법의 최소 필요하다. 또한, MDA 크게 각 기생충 또는 호스트 소스 검출에 대해 적어도 3 개의 마커를 이용하여, 거짓 포지티브 또는 네거티브의 발생 가능성을 감소시킨다. 우리가 활용 플랫폼은 말라리아 벡터에 한정되지 않고, 의약, 수의학, 및 기초 생물학 26-28 같은 다양한 애플리케이션에 사용될 수있다. 심층 많은 샘플 (100 단위의 순서) 번호를 포함하는 관련 연구 또는 집단 유전학 연구는 동시에 여러 마커에 대한 비용 효과 분석 검사를 필요로한다. 둘 이상의 별개 PCR 분석법을 이용하는 대부분의 연구는 더 낮은 비용으로 더 빠른 결과를 위해 MDA를 구현할 수있다. </p&gt;

<table><tbody><tr><td>MassARRAY 분석기 Compact</td><td>Sequenom</td><td>MT9</td><td>MALDI-TOF 핵산 분석을 위한 게놈 응용 분야용 질량 분석법.</td></tr><tr><td>MassARRAY 나노 디스펜서</td><td>Sequenom</td><td>RS1000</td>은 SAP 키트를 포함한 iPLEX 분석에 사용되는 SpectroCHIP iPLEX Gold Genotyping 시약 세트 Sequenom 10158 시약<td>으로 완성된 iPLEX 반응 생성물을 전송합니다</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>.</td></tr></tbody></table>

말라리아 모기 전송하기위한 다중 탐지 분석

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

과 아노 펠 레스 gambiae 종 단지는 아프리카에서 모기를 전송하는 주요 말라리아가 포함되어 있습니다. 이들 종은 의료 중요하기 때문에, 여러 가지 특성은 전형적 역학 연구에 도움 분자 분석법을 이용하여 특성화된다. 이러한 특성은 종 식별, 살충제 저항, 기생충 감염 상태, 호스트 환경 설정을 포함한다. 과 아노 펠 레스 gambiae 복합체의 형태 학적 집단 구별하기 때문에, 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)은 전통적 종을 식별하는 데 사용된다. 종이 알려지면, 여러 하위 분석은 정기적으로 추가 특성을 규명하기 위해 수행된다. 예를 들어, 파라 유전자 KDR이라고도 돌연변이는 DDT 및 피레스 로이드 계 살충제에 대해 내성을 부여. 또한, 효소 면역 분석법 (ELISA를) 또는 변형체 기생충 DNA 검출 PCR 분석법 모기 조직 기생충 존재를 검출하기 위해 사용된다. 마지막으로, combinatioPCR과 제한 효소 다이제스트의 N은 호스트 별 DNA의 모기 bloodmeal을 선별하여 호스트 환경 설정 (예를 들어, 동물의 혈액 대 인간) 규명하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 96 시간에 384 샘플에 대해 단일 ​​멀티 플렉스 반응 유전자형 33SNPs으로 상기 분석을 모두 겸비한 다중 검출법 (MDA)을 개발 하였다. MDA 종, 말라리아 검출 및 호스트 혈액 식별을위한 여러 마커를 포함하기 때문에, 오탐 (false positive) 또는 네거티브를 생성하는 가능성은 크게 특성 당 하나의 마커를 포함 이전 분석에서 감소한다. 이 강력하고 간단한 분석은 비용 효율적으로 기존 분석의 시간의 틈새에서 이러한 주요 모기의 특성을 감지 할 수 있습니다.

종 식별 : 샘플이 세 종 중 하나가 아닌 경우 다음과 같은 5 개의 SNP 함께. 세 가지의 SNP (01073-213, 04679-157과 10,313 세 종 (A.의 arabiensis, A.의 coluzzii와 A.의 gambiae) (표 4)를 식별 -052)는 증폭 실패합니다. 살충제 저항을 추론하기위한 KDR 유전자형 : 파라 전압 관문 나트륨 채널의 1014 번째 코돈 KDR에 대응한다. 1014 번째 코돈의 2 차 및 3 차베이스에 두 개의 SNP는 세 가지 아미노산을 결정합니다. . 유전자형의 가능한 조합은 표 5에 나와있는...

말라리아 전염 모기는 분자 기술을 통해서만 감지할 수 있는 역학적으로 중요한 여러 가지 특성을 가지고 있습니다. MALDI-TOF 기반 SNP 유전형 분석 플랫폼을 활용하여 말라리아 매개체의 여러 주요 특성(종, 살충제 내성, 기생충 감염 및 숙주 선택)을 동시에 검출할 수 있는 분석을 개발했습니다.

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

a-multi-detection-assay-for-malaria-transmitting-mosquitoes

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

유전자가 말라리아에 대한 잠재적 내화물로 식별되면, 그것은 모기 이내 Plasmodium 감염을 예방의 역할에 대해 평가해야합니다. 이 프로토콜은 모기의 plasmodium 감염의 범위가 assayed 수있는 방법을 보여줍니다. gametocyte 문화, 멤브레인 수유 모기 인간의 혈액을 준비하고 모기 midgut에서 바이러스 titers을 시금에 대한 기술은 증명됩니다.

모기와 감염 표현형 결정에서 Plasmodium falciparum 감염에 대한 프로토콜

쥐 말라리아 기생충의 유전자 십자가는 모기에 두 유전자 별개의 기생충을 먹이에 의해 수행됩니다. 재조합 자손은 모기가 감염된 쥐를 물어 수 있도록 후 마우스 혈액에서 복제됩니다. 이 비디오의 유전자 십자가를 생산하는 방법을...

쥐 말라리아 기생충의 유전자 크로스의 생산을위한 프로토콜

이 비디오는 암컷 모기에 대한 새로운 작용 모드를 가진 테스트 화합물의 폐사율과 번식력을 평가하기 위한 혈액 공급 분석을 보여줍니다. 이 기술은 새로운 종류의 살충제를 스크리닝하여 모기의 저항성 개체군을 죽이고 질병 확산을 통제하는 데 도움이 됩니다.

모기 먹이 분석: 성체 암컷 모기의 폐사율 및 생식력에 대한 테스트 복합 효과를 평가하는 방법

고해상도 융점 분석은 이종 집단에서 단일 염기 다형성을 구별 할 수있는 능력을 제공하지만, 돌연변이 대립 유전자 증폭 바이어스 샘플 내의 비교적 낮은 비율로 존재 대립 유전자를 검출하는 능력을 증가시킬 수있다. 이 프로토콜은 고해상도 융점 분석의 감도를 향상 개선을 설명한다.

방법은 말라리아에 단일 염기 다형성 유전자형 녹는 고해상도의 감도를 증가

인간 말라리아 기생충에 설치류 말라리아 기생충의 생활 주기 그리고 생물학의 눈에 띄는 유사성 때문에, 설치류 말라리아 모형은 말라리아 연구를 위해 필수불가결하게 되었습니다. 본 명세서에서, 우리는 야생형 및 형질전환 설치류 말라리아 종의 표현형 분석에 사용되는 가장 중요한 기술중 일부를 표준화하였다.

설치류 말라리아 기생충 무성 및 성적 혈액 단계 및 모기 단계의 현상형 분석

현재 다중화 Zika, chikungunya, 뎅 그 열 바이러스 복잡 한 샘플 준비 및 비싼 장비를 요구 하 고 저 리소스 환경에서 사용 하기 어려운 검출 하는 진단. 우리는 감지 하 여 높은 감도와 특이성이이 바이러스를 차별화 대상 특정 가닥 displaceable 프로브 등온 증폭을 사용 하는 진단을 보여줍니다.

멀티플렉스 등온 증폭 Zika, Chikungunya, 뎅 그 열의 1 감지 진단 플랫폼을 기반으로

제시된 프로토콜은 봉쇄 환경에서 Zika와 같은 주어진 바이러스에 대한 Aedes aegypti 모기 집단의 벡터 역량을 결정할 수 있다.

지카 바이러스를 사용하여 Aedes aegypti 모기에 벡터 역량 분석

이 프로토콜은 gRNA 유도 Cas9 분열 및 DNA 수리 에 따른 표적 부위에서 비균성 최종 결합(NHEJ) 이벤트의 식별 및 정량화를 위한 분석을 포함하여 디지털 물방울 PCR(ddPCR)에 대한 실험용 설정에 DNA 추출에서 단계를 제공합니다. 이 방법의 그밖 용도는 다형성 검출 및 유전자 편집 이체 확인과 같은 응용을 포함합니다.

유전자 변형 된 Anopheline 모기 인구에서 인델 돌연변이를 감지하는 디지털 물방울 PCR

이 프로토콜은 모기에서 타액선 포자석을 검출하기 위한 샌드위치 효소 결합 면역 흡착 분석을 설명합니다. 쉽게 구할 수 있는 단클론 항체를 사용하는 이 방법은 Plasmodium falciparum 또는 Plasmodium vivax를 운반하는 모기를 비용 효율적으로 고처리량으로 검출할 수 있습니다. 이 방법은 매개체 조사를 포함한 말라리아 전염 연구에 적합합니다.

효소 결합 면역 흡착 분석을 사용한 Anopheles 모기의 Plasmodium sporozoites 검출

표준 막 공급 분석(SMFA)은 잠재적인 항말라리아 화합물의 평가 및 식별을 위한 황금 표준으로 간주됩니다. 이 인공 먹이 시스템은 Plasmodium falciparum 기생충의 강도와 유병률에 대한 이러한 화합물의 영향을 추가로 평가하기 위해 모기를 감염시키는 데 사용됩니다.

Anopheles 모기 벡터에서 플라스모듐 팔시파룸 감염 검출을 위한 표준 막 공급 분석

다중 형광 면역분석법은 혈청학 검사의 참고 자료가 되고 있습니다. 그러나 이들의 적용은 복잡성과 시간이 많이 걸리는 비드-분석물 결합 공정으로 인해 제한됩니다. 이 보고서는 결과 도출 시간을 크게 단축하면서 표준 방법과 비교할 수 있는 반자동 재현 가능한 다중 마이크로스피어 비드 커플링 프로토콜을 제시합니다.

아르보바이러스에 대한 항체 반응 검출을 위한 다중 혈청학적 분석

학습하세요 MALDI-TOF SNP 유전자형 분석을 활용한 말라리아 모기 다중 특성 동시 탐지 방법을. 종 식별, 살충제 내성, 기생충 감염 및 숙주 선택 행동을 분석하여 말라리아 방제 전략 수립에 필수적인 역학 정보를 제공합니다.

말라리아 모기 전송하기위한 다중 탐지 분석

더 많은 동영상 탐색