침투 림프구의 분석을위한 비 효소 해리 신선한 인간의 조직에 대한 간단하고 빠른 프로토콜
2014년 12월 6일
이 프로토콜은 다양한 정상 및 악성 인간 조직에 존재하는 CD45+ 세포(림프구/백혈구)의 정성적 및 정량적 평가를 위해 신선한 인체 조직 조각의 신속한 비효소적 해리를 설명합니다. 또한, 일차 조직 균질액으로부터 얻어진 상등액은 추가 분석 또는 실험을 위해 수집 및 저장될 수 있습니다.
이 절차의 전반적인 목표는 정성적 및 정량적 분석과 특정 림프구 하위 집단의 분리를 위해 효소 분해 없이 인간 조직 조각을 단일 세포 현탁액으로 빠르게 균질화하는 것입니다. 이것은 먼저 멸균 메스를 사용하여 조직 조각을 작은 조각으로 깍둑썰기함으로써 이루어집니다. 다음으로, 조직 슬러리는 기계적 해리 튜브로 옮겨져 단편이 단일 세포 현탁액으로 더욱 균질화됩니다.
그런 다음 다운스트림 분석을 위해 원심분리를 통해 세포를 수집합니다. 궁극적으로 유세포 분석은 침윤 림프구, 하위 집단 아시아인을 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 제 연구실에서 이 기술을 개발한 이유는 종양이 림프구에 침투하는 경우 원래 상태에 큰 영향을 주지 않고 종양을 이미지화할 수 있는 방법을 찾고 있었기 때문입니다.
우리는 세포를 신속하게 분리하고 수술 시와 같이 분석할 수 있는 것을 원했습니다. 이 기술은 우리 실험실에서 300개 이상의 유방 종양 및 정상 조직에 사용되었으며 사용하기 쉽고 매일 사용할 수 있습니다. 예후 마커, 치료에 대한 반응 및 장기적인 임상 결과를 검사하는 데 사용할 수 있습니다.
오늘 이 기술을 시연할 사람은 존 니콜라 로익(John Nicola Loic)입니다. 내 실험실의 기술자 조직 샘플의 무게를 측정한 다음 조직의 길이, 너비 및 높이를 측정하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 조직 조각을 화학적으로 정의된 적절한 혈청이 없는 조혈 세포 배지 1밀리리터가 들어 있는 작은 페트리 접시에 옮기고 멸균 메스를 사용하여 샘플을 1-2제곱밀리미터 조각으로 깍둑썰기합니다.
다음으로, 접시 내용물을 기계적 해리 C 튜브로 옮기고 접시와 메스를 2밀리리터의 배지로 헹굽니다. 세척액을 C 튜브에 첨가한 다음 0.01 기계적 해리 프로그램을 두 번 연속으로 실행하여 조직 조각을 단일 세포 현탁액으로 부드럽게 균질화합니다. 두 번째 주기 후, 40마이크로미터 세포 여과기를 통해 균질산물을 50ml 원추형 튜브로 디캔팅합니다.
그런 다음 페트리 접시를 세척할 때 사용한 것과 동일한 해충을 피펫으로 사용하여 C 튜브에 남아 있는 액체를 세포 여과기로 옮깁니다. 다음으로, 1ml 마이크로 피펫을 사용하여 여과된 액체를 15ml 원뿔형 튜브로 옮기고 C 튜브를 3ml의 배지로 추가로 헹굽니다. 이 세척제를 셀 스트레이너를 통해 50ml 튜브로 옮깁니다.
그런 다음 깨끗한 1ml 팁으로 균질화되지 않은 조직을 스트레이너 주위로 부드럽게 움직여 조직에 갇힌 잔류 액체의 최대량을 50ml 튜브에 짜냅니다. 이제 세포 여과기를 원래 C 튜브 위에 거꾸로 놓고 균질화되지 않은 조직이 C 튜브로 다시 떨어지도록 배지 3ml로 여과기를 헹굽니다. 방금 설명한 것처럼 두 번의 더 주기 동안 조직을 다시 균질화한 다음 이 두 번째 균질액을 세포 여과기를 통해 붓습니다.
다시 말하지만, C 튜브를 3ml의 배지로 더 헹굽니다. 그런 다음 여과기를 통해 상층액을 여과하고 방금 설명한 것처럼 조직에서 잔류 액체를 짜냅니다. 이 시점에서, 약 2.5 밀리리터의 단일 세포 현탁액의 부피가 15 밀리리터 튜브에 존재해야 하고, 약 9 밀리리터가 50 밀리리터 튜브에 존재해야 한다.
세포에서 조직 상등액을 분리하기 위해 첫 번째 원심 분리기, 균질화의 두 튜브를 600 Gs 및 실온에서 15 분 동안 15 밀리리터 튜브에서 1.5 밀리리터 튜브로 디캔팅하여 섭씨 4도에 놓고 50 밀리리터 튜브에서 상등액을 버립니다. 그런 다음 단단한 표면에서 각 튜브를 부드럽게 두드려 각 세포 펠릿을 분해합니다. 느슨한 세포 펠릿을 500 마이크로리터 배지로 50 밀리리터 튜브에 재현탁시키고, 세포를 15 밀리리터 튜브로 옮겨 두 번째 펠릿을 재현탁합니다.
그런 다음 50ml 튜브를 다른 500마이크로리터의 배지로 헹구고 세척액을 15ml 튜브로 옮겨 세포 회수를 극대화합니다. trian blue exclusion에 의해 생존 가능한 세포의 수를 계수한 후 세포 현탁액을 펠렛화합니다. 마지막으로, 예약된 조직 상층액을 스핀다운합니다.
그런 다음 펠릿을 건드리거나 방해하지 않고 상층액을 하나 이상의 깨끗한 튜브로 조심스럽게 옮기고 향후 다운스트림 분석을 위해 섭씨 마이너스 80도에서 보관합니다. 이 그래프에서는 해리된 종양 세포 균질화의 대표적인 유세포 분석 점도표와 백혈구 및 상피 세포 마커에 대한 특정 항체로 라벨링한 것이 시연된 바와 같이 표시됩니다. 이 프로토콜은 CD 45 양성 세포의 생존력을 크게 변화시키지 않습니다.
그러나 생존 가능한 EPAM 양성 세포의 상당한 손실이 있습니다. 이러한 실행 가능한 EPAM 양성 및 CD 45 양성 하위 집합은 크기와 구조에 따라 큰 상피 종양 세포, 작은 상피 세포 또는 크고 작은 CD 45 양성 세포로 분리할 수 있습니다. 주요 종양 침윤 subset의 대표적인 유세포 분석 점도표가 여기에 CD 45 양성 세포의 생존력에 의존하는 림프구와 함께 표시됩니다.
마지막으로, 유방암 상등액에 존재하는 사이토카인 발현 또는 총 면역글로불린은 이 대표적인 실험에서 입증된 바와 같이 종양 조직과 관련된 두 가지 유형의 단백질에서 증가를 나타내는 정상 유방 조직의 상등액과 비교할 수 있습니다.참석자는 절차이지만 충분한 수의 세포를 얻기 위해 절차의 각 단계에서 빠르고 깨끗하게 작업하고 최대한의 물질을 복구하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 엔드포인트 분석.
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개요
이 프로토콜은 신선한 인간 조직 조각의 신속한 비효소적 분리 방법을 설명하며, 림프구 및 백혈구를 포함한 CD45+ 세포의 정성 및 정량 평가를 가능하게 합니다. 이 기술은 세포의 원래 상태를 보존하여 추가 분석을 용이하게 합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 세포 생물학
- 면역학
배경
- 인간 조직의 면역 세포 구성을 이해하는 것은 다양한 연구 응용을 위해 매우 중요합니다.
- 전통적인 효소 방법은 세포의 원래 상태를 변경할 수 있습니다.
- 이 프로토콜은 조직 분리를 위한 비침습적 대안을 제공하는 것을 목표로 합니다.
- 흐름 세포 분석은 특정 림프구 하위 집단을 분석하는 데 사용됩니다.
연구 목적
- 인간 조직을 단일 세포 현탁액으로 균질화하는 신속한 방법을 개발합니다.
- 림프구 집단의 정성 및 정량 분석을 가능하게 합니다.
- 영상 분석을 위한 종양 침윤 림프구의 원래 상태를 보존합니다.
사용된 방법
- 신선한 인간 조직 조각은 무균 메스를 사용하여 작은 조각으로 잘라냅니다.
- 조직 슬러리는 추가 균질화를 위해 기계적 분리 튜브로 옮겨집니다.
- 세포는 하위 분석을 위해 원심분리를 통해 수집됩니다.
- 흐름 세포 분석을 활용하여 침윤 림프구와 그 하위 집단을 분석합니다.
주요 결과
- 이 방법은 인간 조직 조각으로부터 단일 세포 현탁액을 성공적으로 생성합니다.
- CD45+ 세포의 정성 및 정량 평가를 효과적으로 수행할 수 있습니다.
- 이 기술은 림프구의 원래 상태 보존을 허용합니다.
- 흐름 세포 분석 결과는 특정 림프구 하위 집단을 분석할 수 있음을 입증합니다.
결론
- 이 비효소적 분리 방법은 인간 조직 림프구를 분석하는 데 효과적입니다.
- 이 프로토콜은 다양한 정상 및 악성 조직에 적용할 수 있습니다.
- 향후 연구에서 이 기술을 활용하여 면역 세포 역학에 대한 더 깊은 통찰을 얻을 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Rapid, non-enzymatic dissociation of fresh human tissues enables high-fidelity analysis of tumor-infiltrating lymphocytes, supporting immune-oncology discovery and translational research. This protocol preserves cell surface markers and viability, providing reliable quantitative and qualitative data for target validation and mechanistic de-risking. The approach enhances predictive confidence at the interface of early discovery and translational biomarker development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
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- Preserves native cell states for accurate phenotypic and functional analysis.
- Supports mechanistic de-risking by maintaining surface receptor expression.
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Screening & Assay Development
- Generates high-viability single-cell suspensions suitable for flow cytometry and molecular assays.
- Standardizes sample preparation, improving reproducibility across experiments.
- Provides quantitative outputs for downstream immunological and molecular screening.
- Enables reliable evaluation of immune cell subpopulations for assay development.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by analyzing cells proximate to their in vivo state.
- Supports translational biomarker discovery through comparative analysis of normal and malignant tissues.
- Facilitates continuity from tissue acquisition to preclinical immune profiling.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on immune contexture data.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates at the interface of tissue acquisition, immune profiling, and translational biomarker workflows, supporting early discovery through preclinical research.
- Discovery Biology: Provides high-integrity immune cell suspensions for hypothesis testing and pathway analysis.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative cell preparations for immunophenotyping and molecular assays.
- Analytics: Enables robust measurement of lymphocyte subpopulations and soluble immune mediators.
- Translational Research: Supports biomarker alignment by comparing immune profiles across tissue types.
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Operational & Enterprise Impact
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- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of immunotherapy candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue handling and immunological assays.
- Needs access to mechanical dissociation instruments and flow cytometry platforms.
- Demands cross-team standardization for consistent sample processing.
- Adaptable to various tissue types with attention to tissue-specific characteristics.
- Cell yield and viability may vary depending on tissue composition and handling speed.
