침투 림프구의 분석을위한 비 효소 해리 신선한 인간의 조직에 대한 간단하고 빠른 프로토콜

본 절차의 전반적인 목표는 효소 소화 과정 없이 인간 조직 조각을 빠르게 균질화하여 단일 세포 현탁액으로 만들어, 정성 및 정량 분석과 특정 림프구 하위 집단의 분리를 수행하는 것입니다. 이를 위해 먼저 멸균 메스로 조직 조각을 작은 크기로 다집니다. 그다음, 조직 슬러리를 기계적 해리 튜브로 옮겨 조각들을 단일 세포 현탁액으로 더욱 균질화합니다.

그 다음, 후속 분석을 위해 원심분리법으로 세포를 수집합니다. 최종적으로, 유세포 분석법을 사용하여 침윤 림프구와 그 하위 집단들을 분석할 수 있습니다. 저희 실험실은 종양 침윤 림프구의 고유한 상태에 큰 영향을 주지 않으면서 이미징할 수 있는 방법을 찾던 중 이 기술을 개발하게 되었습니다.

우리는 세포를 신속하게 분리하여 수술 당시의 상태 그대로 분석할 수 있는 방법을 원했습니다. 이 기술은 본 연구실에서 300개 이상의 유방암 종양 및 정상 조직에 적용되었으며, 사용법이 간단하여 매일 사용할 수 있습니다. 또한 예후 마커, 치료 반응 및 장기적인 임상 결과를 조사하는 데 활용될 수 있습니다.

오늘 이 기술을 시연할 사람은 저희 실험실의 테크니션인 John Nicola Loic입니다. 먼저 조직 샘플의 무게를 측정한 다음, 조직의 길이, 너비, 높이를 측정하는 것으로 시작하십시오. 그런 다음 조직 조각을 1 mL의 적절한 화학적으로 정의된 무혈청 조혈 세포 배지가 담긴 작은 페트리 접시에 옮기고, 멸균된 메스를 사용하여 샘플을 1~2 mm² 크기의 작은 조각으로 다지십시오.

다음으로, 디쉬의 내용물을 기계적 해리용 C 튜브로 옮기고 디쉬와 메스를 2 mL의 배지로 헹굽니다. 세척액을 C 튜브에 추가한 다음, 0.01 기계적 해리 프로그램을 연속으로 2회 실행하여 조직 파편을 단일 세포 현탁액으로 부드럽게 균질화합니다. 두 번째 사이클이 끝나면, 균질물을 40 µm 세포 스트레이너를 통해 50 mL 원추형 튜브에 디캔트합니다.

그런 다음 페트리 접시를 세척할 때 사용했던 동일한 피펫을 사용하여 C 튜브에 남아 있는 모든 액체를 세포 스트레이너(cell strainer)로 옮깁니다. 이어서, 1 mL 마이크로 피펫을 사용하여 여과된 액체를 15 mL 원추형 튜브로 옮기고, C 튜브를 배지 3 mL로 추가로 헹굽니다. 이 세척액을 세포 스트레이너를 통해 50 mL 튜브로 옮깁니다.

그다음 깨끗한 1 mL 팁을 사용하여 균질화되지 않은 조직을 스트레이너 위에서 부드럽게 움직여, 조직에 갇힌 잔여 액체가 최대한 50 mL 튜브로 짜내어지도록 합니다. 이제 셀 스트레이너를 기존의 C 튜브 위에 거꾸로 놓은 후, 스트레이너를 배지로 3 mL 더 헹구어 균질화되지 않은 조직이 다시 C 튜브로 떨어지게 합니다. 앞서 시연한 것과 같이 조직을 두 주기 더 재균질화한 후, 이 두 번째 균질물을 셀 스트레이너에 부어 여과합니다.

다시 한번 C 튜브를 3 mL의 배지로 헹굽니다. 그런 다음 상층액을 스트레이너로 여과하고, 방금 시연한 것과 같이 조직에서 잔류 액체를 짜냅니다. 이 시점에서 15 mL 튜브에는 약 2.5 mL의 단일 세포 현탁액이 들어 있어야 하며, 50 mL 튜브에는 약 9 mL가 관찰되어야 합니다.

조직 상층액을 세포와 분리하기 위해, 먼저 두 개의 균질액 튜브를 600 Gs, 실온에서 15분 동안 원심분리합니다. 15 mL 튜브의 상층액을 1.5 mL 튜브로 옮겨 4 °C에 보관하고, 50 mL 튜브의 상층액은 폐기합니다. 그다음, 각 튜브를 딱딱한 표면에 가볍게 두드려 세포 펠렛을 각각 분쇄합니다. 50 mL 튜브에 있는 느슨해진 세포 펠렛을 500 µL의 배지로 재부유시키고, 이 세포들을 15 mL 튜브로 옮겨 두 번째 펠렛을 재부유시킵니다.

그다음 50 mL 튜브를 배지 500 µL로 다시 헹구고, 세포 회수율을 최대화하기 위해 세척액을 15 mL 튜브로 옮깁니다. 트라이판 블루(trypan blue) 배제법으로 생존 세포 수를 계산한 후, 세포 현탁액을 원심 분리하여 펠렛화합니다. 마지막으로, 따로 보관해 둔 조직 상층액을 원심 분리하여 가라앉힙니다.

그 다음, 펠렛에 닿거나 영향을 주지 않도록 주의하며 상층액을 최소 하나 이상의 깨끗한 튜브로 옮기고, 향후 후속 분석을 위해 -80 °C에서 보관합니다. 이 그래프들에는 해리된 종양 세포 균질액에 대해 백혈구 및 상피 세포 마커에 특이적인 항체를 사용하여 라벨링한 후 얻은 대표적인 유세포 분석 도트 플롯이 예시와 같이 나타나 있습니다. 본 프로토콜은 CD 45 양성 세포의 생존율을 유의하게 변화시키지 않습니다.

하지만 생존 가능한 EPAM 양성 세포의 상당한 손실이 발생합니다. 그럼에도 불구하고, 생존 가능한 EPAM 양성 및 CD 45 양성 하위 집단은 크기와 구조를 기준으로 대형 상피 종양 세포, 소형 상피 세포, 또는 대형 및 소형 CD 45 양성 세포로 분리할 수 있습니다. 주요 종양 침윤 하위 집단의 대표적인 유세포 분석 도트 플롯이 여기에 제시되어 있으며, 림프구는 CD 45 양성 세포의 생존 능력을 기준으로 게이팅되었습니다.

마지막으로, 유방암 상층액에 존재하는 사이토카인 발현 또는 총 면역글로불린을 정상 유방 조직의 상층액과 비교할 수 있으며, 본 대표 실험에서 입증된 바와 같이 종양 조직과 관련된 두 종류의 단백질 모두가 증가한 것을 확인할 수 있습니다. 이 절차를 수행하는 동안, 신속하고 청결하게 작업하고 각 단계에서 최대한의 물질을 회수하여 최종 분석에 충분한 수의 세포를 확보하는 것이 중요합니다.