Name: 작은 올리고머 형성 막 단백질의 침전 평형 : 펜타 머 안정성에 히스티딘 양성자의 효과 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: 학습하세요 침전 평형법을 이용해 소수성 단백질 올리고머의 크기와 pH에 따른 안정성을 분석하는 방법을. 히스티딘 양성자가 펜타머 안정성에 미치는 영향을 밝히는 생화학 연구 기법입니다.

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이 프로토콜은 자세한 내용과 특별한 고려 사항 3, 25 ~ 28에 대해 언급 할 수있는 다음 자원을 기반으로합니다. H 2 O 2와 세제 미셀 1. 밀도 매칭 주 : 완충액의 농도는 세제 미셀 농도에 일치 될 필요가있다. 일반 밀도 조정 에이전트는 2 H 2 O, H 2 O (18), 2 H 2 O (18), 글리세롤과 자당 (29)를 포함한다. H 2 O (18)는 H 2 O 2와 같은 농도를 가지며, 교환 가능한 양성자 단백질의 중수 소화되지 않게 할 필요가있는 경우는 더 나은 선택 일 수있다. 이 절차에서, 50mM 트리스 pH가 7.3에서 3- (N, N-dimethylmyristylammonio) -propanesulfonate (C14SB)의 세제 농도는 100 mM의 NaCl을 2 H 2 O.과 일치 될 것이다 초기 추측으로 다음과 같은 농도H 2 O 2를 사용한다 : 10, 30, 50 % V / V. 1.1. 샘플 준비 <ol><li> 원액을 다음과 필터가 0.2㎛ 시린지 필터를 통해 살균 준비 : 50 ㎖의 500 mM 트리스 pH를 7.3 M의 NaCl 및 1 (10X 완충 용액); 1 mL를 250 mM의 C14SB (50X 세제 용액). </li><li> 20 ㎕의 10X 완충액 4 ㎕의 50X 세제 용액 20 μL H 2 O 2 (99.9 %), 156 μL를 혼합하여 시료 용액 200㎕를 준비하여 H 2 O를 탈 20 μL H 2 O 2 (99.9 %), 160 μL, 20 μL를 10X 완충 용액을 혼합함으로써 용액의 기준도 200 μl를 준비한 H 2 O를 탈 </li><li> 다른 2 H 2 O 농도 단계를 반복 1.1.2, 적절하게 2 H 2 O와 H 2 O 양을 조절, 30 % 및 50 % 즉. </li></ol> 1.2. 6 채널의 어셈블리UC 세포로 세포 및 샘플 로딩. 주의 : 샘플 로딩 방법에 따라 AUC 셀의 두 종류가있다. 셀을 밀봉 한 후 세포를로드 할 수있는 반면, 외부 입력 외부 충전없이 세포는 세포를 밀봉하기 전에 로딩되어야한다. 외부 입력 AUC 셀의 조립 이전에 3 기술되었다. 이 프로토콜에서, 외부 충전없이 6 채널 AUC 전지의 조립을 설명한다. 주요 차이점은 별도로 체결해야 양쪽 나사 링이 있는지이며 (도. 1) 플러그 하우징을 필요로하지 않는다. 조립 순서의 차이는 아래에 강조 표시됩니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52404/52404fig1.jpg" /> 그림 1. 외부 충전없이 6 채널 AUC 셀의보기를 폭발했다.이 수치는 콜터-50 TI의 수정 및-60 티 Analyti되었습니다CAL 회, 세포 및 평형 사용자 설명서. <ol><li> 사파이어 창 대신 석영 창 (그림. 2) 각 AUC 셀에 대해 두 개의 창 어셈블리를 준비합니다. 창 홀더에 창 가스켓을 놓습니다. 약간 윈도우를 구부리고 라이너 갭 창 홀더 키홈 향하여 형성되도록 창 홀더에 배치. 창 홀더 열쇠 구멍에 마크를 정렬, 윈도우 라이너 내부의 사파이어 창을 놓습니다. . 참고 사항 :이 밀도 일치하는 실험에서와 같이 30,000 rpm으로 위의 간섭 측정을위한 따라서 고속 (28), (30)에 더 많은 빛을 굴절을 생성 할 것이다, 따라서 석영 창을 압축하고, 사파이어 윈도우가 사용된다. 사파이어 창이 석영 창보다 무거운 그면에 에칭 &quot;X&quot;가. </li></ol><img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52404/52404fig2.jpg" /> 그림 2. 분해도 오F 창 조합.이 그림은 콜터-50 Ti 및-60 티타늄 분석 로터, 세포 및 평형 사용자 설명서에서 수정되었습니다 <ol><li> 부품 번호 거꾸로와 셀 하우징을 놓습니다. 주택 키를 사용하여 정렬 된 열쇠 구멍으로, (왼쪽 그림. 1) 아래로 향하게 창 하나의 창 어셈블리 다음, 먼저 세포 하우징 아래로 경 사진면을 6 섹터 중심에 밀어 넣습니다. </li><li> 가볍게 코트 spinkote로 나사 링 스레드와 나사 링 와셔. 윈도우 어셈블리의 상단에 나사 링 와셔를 놓습니다. 외부 직면하고있는 단어 &quot;OUT&quot;와 창 하우징에 나사 링을 설치합니다. 셀 정렬 도구를 사용하여 나사 링을 손으로 조. </li><li> 토크 렌치를 사용하여 60 인치 - 파운드 나사 반지를 조입니다. </li><li> 부품 번호 똑바로 세워 12 정오에 위치와 셀을 놓습니다. L왼쪽 행에 OAD 120 ㎕를 참조하고 오른쪽 행에 110 ㎕의 샘플. 각 샘플과 참조가 제대로 결합되어 있는지 확인합니다. 참고 : 정확한 샘플 량은 중요하지 않지만 샘플 메 니스 커스가 구별 될 수 있도록 참조 샘플 (5-10 μL)보다 약간 더 많은 양이 필요하다. </li><li> 조심스럽게 창 (그림. 1, 오른쪽) 아래로 향하도록 전지 하우징 하나의 창 조립품에 밀어 넣습니다. 지나치게 셀을 방해하고 내용을 흘리지 않도록주의하십시오. </li><li> 단계를 반복 1.2. 3 1.2. 4, 120 인치 - 파운드 두 번째 나사 링을 체결. 세포 전환, 120 인치 - 파운드로 제 1 나사 링을 다시 조입니다. </li><li> 회 전자에 세포를로드 원심 분리기 회 전자를 설치하고 제조업체의 지침 (28)에 따라 단색을 설치합니다. 참고 : 본 보안 목표 명세서에 대한 세부 사항을EP도이 문헌 3에서 찾을 수있다. </li></ol> 1.3. 간섭 측정 설정 <ol><li> 간단히 다음 단계로 요약 될 제조업체의 지시에 따라, AUC 기기 용 사용자 인터페이스 소프트웨어를 시작하고, 3000 rpm에서 각 셀에 대해 사용 된 레이저 및 반경 보정을 수행. </li><li> 충분한 진공 후 1.3.1.1은 (&lt;100 미크론), 3000 rpm에서 원심 분리기를 실행에 도달했습니다. 사용자 인터페이스 소프트웨어에서의 간섭 패턴을 미리 높은 콘트라스트를 얻기 위해 레이저 파라미터를 조정한다. </li><li> &quot;균형&quot;과 &quot;간섭&quot;측정을 지정 | (새 파일 파일) 새로운 설정 파일을 만듭니다. 침강 평형 방법 ( &quot;방법&quot;버튼) 20 ° C에서 실행 온도, 45,000 RPM 이상 중 단백질 시료에 대한 예상 최고 속도로 실행 한 검사를 수집하는 15 분 간격을 설정합니다. 과정 제어HeteroAnalysis 상기 데이터의 파일을 열어 12 시간 이상 이후에 &quot;매치&quot;기능을 선택하여 연구 진행 평형 (약 밤새도. 3). 참고 : 유사한 기능도 SEDFIT (옵션 |로드 옵션 | 평형에 시험 접근)에서 사용할 수 있습니다. </li></ol><img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52404/52404fig3.jpg" /> 도 HeteroAnalysis match 함수 3. 결과. 대전 함수는 연속적인 검사 및 최종 검사 사이 RMSD 비교함으로써 평형 진행 상황을 모니터링 할 수있다. X 축에 점근 RMSD 값으로 표시된 바와 같이이 예제는 8 시간 후에 평형의 달성을 보여줍니다. 1.4. 데이터 분석 <ol><li> 각 샘플 세트에 대해, H 2 O 2 농도에 대해서 방사상 분포 프로파일의 기울기를 플롯. 참고 : 분포가 매우 얕은 지수가 AP 될 것입니다proaches 선형성. X 축 절편은 일치하는 2 H 2 O 농도에 해당합니다. </li><li> 보다 정확한 결과를 위해, 몇 가지 반복 실험에 실험을 수행합니다. 대안으로, H 2 O 2 농도의 범위가 좁은 실험을 반복한다. </li></ol> C14SB 미셀의 SH 2. 침전 평형 2.1. 실행 매개 변수 <ol><li> SEDNTERP 버퍼를 사용하여 밀도 및 점도, 단백질 부분 체적 원심 분리 속도를 계산한다. D 2 O 농도를 포함하여, &quot;버퍼 데이터 ​​선택&quot;절에서 버퍼 밀도와 점도를 선택 계산을 계산하고 이에 따라 버퍼 구성 요소를 입력합니다. </li><li> 2.1.1.1는 &quot;V-바&quot;절에서 단백질 부분 특정 볼륨, 선택 계산을 계산하고 단백질의 아미노산 서열을 입력합니다. &quot;N =이 단량체 올리고머를 만들기&quot;에서 가장 높은 예상 올리고머 크기를 지정합니다필드,이 경우 N = 5. 메인 창에서 RPM 필드에 값을 입력하여 속도를 계산까지 σ ≈ 1; 이것은 방사상 분포 프로파일 (25)의 형상을 양호한 지수 보장 경험칙이다. 참고 : 다음과 같이이 실험에 대해 계산 된 값이었다 : ρ = 1.03839 g / ㎖, η = 1.0267 cP 인 = 0.7569 ㎖ / g, ω 1 = 16000 RPM. </li><li> 하나의 속도와 다음 25 배포 프로파일 사이에 충분한 차이를 확인하기 위해 수행 이후의 속도를 계산합니다. 참고 :이 또한 함수에서 수행 할 수 있습니다 계정에 솔루션 열 (충전 볼륨) 소요 SEDFIT에서 &quot;평형​​ 로터 기능을 속도 추정&quot;. </li></ol> 2.2. 샘플 준비 <ol><li> 5 mM의 C14SB 1 ㎖의 표준 용액 및 32.3 % 2 H를 준비 2 O 100 μL 10X 버퍼 solutio을 혼합하여 밀도 매칭 실험 (섹션 1)에서 결정N (1.1.1), 20 μL 50X 세제 용액 (1.1.1), 323 μL 2 H 2 O (99.9 %)과 527 μl의 H 2 O를 탈 </li><li> 메탄올 또는 50 % v / V를 아세토 니트릴 등의 적절한 용매에 동결 건조, HPLC 정제 SH 펩티드 (이전 31 설명 발현 및 정제)를 용해. 각 희석하여 280을 수득 세 샘플 마이크로 리터 규모 UV / 비스 분광 광도계 분취 액에 용해 된 펩타이드의 A280을 측정, 12mm = 0.3, 0.5, 0.8 (280, 10mm = 0.25, 0.417, 0.67) 130 μL. 밤새 동결 건조 샘플을 재현 탁하고 130 μl의 표준 용액 (단계 2.2.1)에서 샘플 용액을 얻었다. 주 : Trp의 티르 잔류 물을 포함하고 있기 때문에 SH 단백질 280 nm에서 UV / 마주 흡광도에서 검출 될 수있다. 방향족 잔기가없는 단백질, 또는 방해하여, 적합한 발색단로 태깅 함유 Trp의 돌연변이를 사용하여 검출 될 수있다대신 흡광도의 후부 측정. </li><li> 석영 창문이있는 6 채널 AUC 셀을 조립 1.2 절의 단계를 따르십시오. 가장 가까운 회 센터에서 회 센터와 가장 낮은 농도 샘플 (280, 12mm = 0.3) 멀리로 (280, 12mm = 0.8) 채널을 높은 농도 샘플을로드합니다. </li></ol> 2.3. 흡광도 측정 설정 <ol><li> &quot;균형&quot;과 &quot;흡광도&quot;측정을 지정 | (새 파일 파일) 새로운 설정 파일을 만듭니다. 검출기 파장 280 nm의를 지정합니다. </li><li> 단일 스캔을 방사형 스텝 크기 = 0.01 cm, 복제합니다 = 3 (낮은 해상도, 빠른)와 예를 들어, 낮은 해상도에서 데이터 수집을 지정, 검색 옵션에서 &quot;첫 번째 스캔하기 전에 레이디 얼 교정&quot;을 확인하고 실행하여 3000 rpm에서 반경 보정을 수행합니다 . 스캔이 완료된 후에, 옵션 선택을 해제. </li><li> &quot;(운전 방식을 침강 평형 방법을 설정&quot;버튼) D는 20 ° C에서, 단계 2.1.3에서 계산 된 최초의 속도로 실행하고, 1 스캔 30 분마다 수집합니다. 각 세포 &#39; &quot;세부 사항&quot;에서, 단계 2.3.2에서와 같이 낮은 해상도에서 데이터 수집을 지정합니다. 적어도 18 시간 후에 &quot;일치&quot;기능을 HeteroAnalysis 상기 데이터의 파일을 열어 선택하여 평형 과정을 모니터 (약 밤새도. 4). 주 : 이후의 속도는 시간이 덜 걸릴 것입니다 반면 균형의 달성은 제 속도를 실질적으로 긴 시간이 걸릴 수 있습니다. </li></ol><img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52404/52404fig4.jpg" /> HeteroAnalysis match 함수에서 그림 4. 결과. 제 1 및 제 2 속도는 (상단 왼쪽 및 오른쪽)이 평형에 도달 한 것으로 보인다,하지만 확실하게 몇 시간을 더 기다려야하는 것이 좋습니다. 비교에서, 세 번째와 네 번째 속도 (하단 왼쪽 및 오른쪽)을 명확하게 평형에 도달짧은 시간에. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52404/52404fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <ol><li> 평형에 도달하면, 레이디 얼 스텝 크기 = 0.001 cm, 복제합니다 = 10 (높은 해상도, 느린)와 높은 해상도, 예에서 단일 스캔을 수집합니다. </li><li> 스캔이 완료되면, 다음 단계 속도 2.3.4 및 2.3.3을 반복. </li><li> 시간이 각각의 속도에 대한 평형 알려진 (계산 또는 경험)입니다 도달하기 위해 필요한 경우 선택적으로, 각 평형 시간 이후 1 스캔을 수집하는 단계 및 2.1.3에서 계산 된 모든 속도를 포함하는 침강 평형 방법 스캔을 설정 속도. 이 경우, 각 셀 &#39;&#39;정보 &quot;의 고해상도 데이터 콜렉션을 지정. </li></ol> 2.4. SEDFIT 및 SEDPHAT에서 데이터 분석 참고 : 자세한 내용 및 데이터 분석 리더의 고려 사항은 t을 언급된다www.analyticalultracentrifugation.com : 다음 웹 사이트 오. <ol><li> 열기 고해상도 SEDFIT에서 스캔 (데이터 |로드 침강 평형 데이터) 및 3 채널 (; |로드 옵션 | 3 하위 집합에서 6 채널 원시 데이터를 저장 옵션이 서로 다른 각각의 샘플에 대한 농도에 해당)에 데이터를 분할합니다. </li><li> 다시 열고 SEDFIT에서 동일한 샘플과 동일한 농도하지만 서로 다른 속도에 속한 데이터 파일. 메 니스 커스 (수직 레드 라인), 셀 하단 (세로 블루 라인) 및 피팅 제한 (수직 녹색 선)을 조정하고 SEDPHAT에 사용하기 위해 데이터를 내보낼 (데이터 | SEDPHAT하는 데이터 내보내기). 입력 요청과 같이 회전 자형과 중심 형뿐만 아니라, 단계 2.1.1에서 산출 파라미터. 모든 샘플과 농도에 대해이 단계를 반복합니다. </li><li> SEDPHAT에서 동일한 샘플의 모든 데이터 (모든 농도 및 속도)을 열고 실험 매개 변수를 입력; 한 가지 예를 도시한다. 5. 참고 : D 2 O 버퍼, 신에 추가 될 때<html> 교환 가능한 양성자 eration 크게 특히 수용성 단백질, 단백질의 분자량을 변경할 수있다. 막 임베디드 지역 교환으로부터 보호되기 때문에 막 단백질, SH 단백질 같은 특히 작은 것들, 덜 영향을 받는다. 이 문제를 해결하려면, 입력 &quot;D에게 몰 분율 버퍼&quot;. 참고 :이 단계에서이 메뉴 데이터를 선택하여 개별적으로 편집 된 데이터 집합을 저장하는 것이 좋습니다 | 새로운 구성으로 복사 모든 데이터와 저장을. </li><li> 모델을 선택하고 그 모델에 대한 전역 매개 변수를 입력합니다. 참고 : 예를 들어, &quot;N 모노머 - 메르 셀프 협회&quot;모델 및 파라미터가도 2에 도시되어있다. 6. </li></ol><img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/52404/52404fig5.jpg" /> 그림 5. 실험 매개 변수를 입력하는 방법에 대한 예. 파일 / ftp_upload / 52404 / 52404fig6.jpg &quot;/&gt; 그림 6. 모노머 - 앤 - 메르 셀프 협회 모델 전역 매개 변수를 입력하는 방법에 대한 예. <ol><li> 메뉴 맞춤 선택하여 글로벌 맞춤을 실행 | 글로벌 맞춤을하고 적합 수렴 할 때까지 기다립니다. 아래 참고 (또는 화면을 캡처) 피팅 결과를, 특히 글로벌 축소 카이 광장과 K에게 값을 기록합니다. 열역학 정보를 표시 |에 맞춤 데이터와 메뉴 복사 및 디스플레이에서 피팅 잔차와 같은 다른 데이터의 압축을 풉니 다. </li><li> 전역 매개 변수로 돌아가서 (1) 단량체 분자량에 맞게 단계 2.4.5를 반복 M을 선택합니다. 장착 분자량 및 글로벌 축소 카이 제곱을합니다. </li><li> 단계를 반복 2.4.3 각 모델이 테스트하기 2.4.6 및 감소 된 글로벌 카이 제곱 값뿐만 아니라 피팅 잔차를 비교하여 각 모델의 적합성 품질을 비교할 수 있습니다. 참고 : 작은 임의 피팅 잔차는 일반적으로 잘 맞는을 나타내고, 것 가장 적합한 모델작은 글로벌 축소 카이 제곱 있습니다. 장착 모노머 분자량과 카이 제곱 값은 고정 (이론) 분자량의 실질적 차이가 나지 않습니다. </li><li> 첫 번째 선택 통계에 의해 값에 의해 얻어진 로그 카에 대한 신뢰 구간을 계산 | 심각한 오류 표면 돌기에 대한 카이 제곱 원하는 신뢰 구간을 입력. 로그 카에 대한 카이 제곱 값을 얻기 위해 전역 매개 변수 대화 상자에서 카 로그 1 차원 오류 표면에 돌기를 생성하고 선택 취소 | 다음, 통계로 이동합니다. 주 : 독자는이 방법 (33)의 방법 (32)뿐만 아니라 그림에 대한 자세한 내용은 다음 소스를 (http://www.analyticalultracentrifugation.com/ sedphat / statistics.htm)를 참조하시기 바랍니다. </li></ol>

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이 논문은 샘플 준비 및 평형 침을 사용하여 세제의 작은 막 단백질의 올리고머의 분석을위한 실험 프로토콜을 제공합니다. 밀도 정합 단계가 필요하지 않은 것으로 설명 프로토콜은 동등하게 유효한 -and simpler- 가용성 단백질이다. 실제로, 시스템은 세제와 단백질의 혼합물로 구성된다. 이 부유 입자에 기여하지 않도록 침강 연구를 수행하기 위해, 세제 중력장에 보이지이어야한다. 따라서, 세제의 밀도는 신중하게 사용하는 세제가 너무 치밀하면 예., SDS는, 심지어 100 % D 2 O가 일치 할 수있는 한계와, 버퍼 D 2 O의 첨가에 의해 일치되어야한다. 수용성 단백질로 작업 할 때 세제 샘플을 가지고 있지 않기 때문에 밀도 정합 단계는 필요하지 않다. 우리의 응용, 이온을 형성 chann 작은 바이러스 단백질ELS는 사용되어왔다. 모든 viroporins처럼, SH 단백질은 α 나선 횡단 도메인을 가지고 있으며, 따...

분석 용 초 원심 1-5, 생리 학적 조건하에 거대 분자의 상호 작용을 연구 강약의 상호 작용 모두에 액세스 가능한 가장 중요한 방법 중 하나이다. 방법은 라벨없는이고 광 흡수 또는 간섭을 사용하며, 심지어 형광 광학 시스템 (6)의 크기는 몇 배 이상 농도 범위를 액세스하기 위해 사용될 수있다. 대부분의 생화학 적 과정이 가역적 인 상호 작용에 의존하기 때문에이 방법은 특히 유용합니다. 이러한 상호 작용의 강도 화학량 정량적 생물학적 과정을 이해하는 것을 특징으로 할 수 있고, 다수의 방법이 목적 7,8 존재한다. 그러나, 과도 상호 작용을 연구 9 어렵다. 거대 분자의 상호 작용을 특성화하는 방법의 선택은 정적 또는 동적 인 특성에 의존한다. 첫 번째 경우, sedim<html> 정해져있는 속도 (SV)는 방사상 운송 속도가 측정되고, 복합체는 부력 질량 및 형상의 차이에 기초하여 분획 화되는 경우, 사용된다. 반면에, 실험의 시간 스케일에 가역적 동적 연결은 물리적으로 분리 될 수 없다. 이 경우, 자기 또는 비 - 공유 상호 작용으로 이어지는 헤테로 상호 작용은 총 단백질 농도에 의존 평형에있다. 이러한 동적 상호 작용 침강 평형 (SE) 및 침강 속도 (SV) (10) 모두 공부하실 수 있습니다. 그러나, 첫 번째 방법을 수행하는 단순하고 여기에 설명된다. 평형 확산 침강 사이 도달되도록 SE에서 원심 충분히 낮은 속도로 수행된다. 이 시점에서, 반경 방향 거리의 함수로서 광 신호 (UV-VIS)의 평형 프로필은, 연관 (11)에 대해 미리 설정된 열역학적 모델을 사용하여 분석 될 수있다. ve_content &quot;&gt; 본 논문에서는 침강 평형 연구 때문에 그 소수성. 이온 채널을 형성 바이러스 막 단백질의 자기 연관으로 제시되고, 실험은 세제의 존재 하에서 실행하고,이 때의 밀도이다 용매 세제와 정합되어야한다. 그러나,이 프로토콜에는 용매 농도 정합이 요구되지 것 이외에는, 수용성 단백질의 경우에서와 동일한 기재. 사용되는 단백질은 인간의 호흡기 세포 융합 바이러스 (hRSV),하기도 유아 질환, 노인과 면역 인구 전세계 12 원인 paramyxoviridae 제품군의 포락선 pneumovirus 인코딩됩니다. hRSV 감염의 최대 64,000,000보고 된 사례와 160,000 사망 매년 발생합니다. 게놈은 hRSV 세 막 단백질 F, G, 및 작은 소수성 (SH) 단백질을 포함한 11, 사본을 만듭니다. SH 단백질이 관여RSV 감염의 발병. SH 유전자 (RSVΔSH)를 결여 RSV는 실용적이었다 syncytia의 형성을 야기하고, 야생형 (WT) 바이러스뿐만 아니라 13-16 자랐다. 그러나 RSVΔSH 바이러스는 상부 호흡기 (15, 16)에보다 덜 효율적 WT 1/10 복제. 또한, RSVΔSH 바이러스는 생체 내 마우스와 침팬지 모델 13, 17에서 감쇠했다. SH 단백질 64 (RSV 하위 그룹 A) 또는 65 (RSV의 서브 그룹 B) 아미노산으로 유형 골지 실 (18)의 막에 주로 축적 II 세포막 단백질이다. SH 단백질은 하나의 높은 (20, 21)를 보존하는 나선 막 횡단 (TM) 도메인 (19) 예측이있다. C- 및 N- 말단 extramembrane 도메인은 lumenally / 세포 외 및 세포질, 각각 지향하고 있습니다. 모두 합성 TM 도메인 (잔류 물 (18)-43)과 전체 길이 SH 단백질은 세제의 다양한 homopentamers를 형성하는 것으로 나타났다. homopentameric 형태는 평면 22,23 지질 이중층에서 채널 활동에 대한 책임이있다. 지질 이중층의 TM 단량체의 올바른 방향은 먼저 그의-22는, 내강에 가까운 방향, 간 나선형의 제품에 보였다 사이트 특정 적외선 이색 (23)를 사용하여 측정 하였다. 동일한 TM 도메인 배향 (DPC)에 dodecylphosphocholine 펜타 머에게 전장 단백질의 나선 다발 (22)을 재구성 미셀 NMR 연구에 의해 확인 하였다. 이 &#39;미셀&#39;모델에서, 단일의 헬리컬 A- TM 도메인 확장 헤어핀 B-C에 의해 말단 나선 의해 N 말단 어귀 하였다. SH 단백질의 두 protonatable 잔류, 그의-22과 그분의-51, TM 도메인 (lumenally 방향)에 위치하며, extramembrane의 C- 말단 β 머리핀의 끝에서 각각, (지금까지 채널 기공에서). bicellar ENVIRO에서nment 그러나, TM의 α 나선 그의-51까지 연장하고, 그 잔류 물은 두 채널 (24)의 내강에 접근 할 수있다. 22 소수성 사이드 체인 (일드-32, 일드-36, 일드-40와 레우-44), 그리고 줄 지어 채널 구조는 깔때기 모양의 구조 (22), 좁은 지역 채택 (의 Cys-45 빼앗아-29)은 일드-36는 채널 루멘의 좁은 지점을 정의합니다. 그의-51가 가장 작은 개구 선단에있는 반면, 그의-22은,이 깔때기의 가장 큰 개방에 있습니다. 본 논문에서는 침강 평형 모드에서 원심 분리 분석이 그의 양성자 SH 량체 단백질의 안정성에 영향을 미치는지를 결정하기 위해 사용되어왔다. 이 경우, SH 단백질은 그 단백질 SH 형 펜타 머 올리고머 22 보여 이전에 사용 된-C14 베타 인 세제, 가용화 하였다.

<table><tbody><tr><td>3-(N,N-dimethylmyristylammonio)프로판설포네이</td>트 <td>시그마</td><td>T0807</td><td></td></tr><tr><td>듀테륨 옥사이드 99.8%</td><td>캠브리지 동위원소</td><td>DLM-4-99.8</td><td></td></tr><tr><td>An-50 Ti 로터, 분석, 8-Place</td><td>Beckman Coulter</td><td>363782</td><td></td></tr><tr><td>An-60 Ti Rotor, 분석, 4-Place</td><td>Beckman Coulter</td><td>361964</td><td></td></tr><tr><td>Cell housing</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td>334784</tr><tr><td>12mm 6채널 센터피스, 에폰 숯으로 채워진</td><td>Beckman Coulter</td><td>331376</td><td></td></tr><tr><td>윈도우 홀더</td><td>Beckman Coulter</td><td>305037</td><td></td></tr><tr><td>윈도우 개스킷</td><td>Beckman Coulter</td><td>327021</td><td></td></tr><tr><td>윈도우 라이너</td><td>Beckman Coulter</td><td>362329</td><td></td></tr><tr><td>사파이어 윈도우</td><td>Beckman Coulter</td><td>307177</td><td></td></tr><tr><td>쿼츠 창</td><td>Beckman Coulter</td><td>301730</td><td></td></tr><tr><td>나사 링 와셔</td><td>Beckman Coulter</td><td>362328</td><td></td></tr><tr><td>나사 링</td><td>Beckman Coulter</td><td>301922</td><td></td></tr><tr><td>Spinkote</td><td>Beckman Coulter</td><td>306812</td><td></td></tr><tr><td>토크 스탠드 어셈블리</td><td>Beckman Coulter</td><td>361318</td><td></td></tr><tr><td>카운터 밸런스</td><td>Beckman Coulter</td><td>360219</td><td></td></tr><tr><td>세포 정렬 도구</td><td>Beckman Coulter</td><td>362340</td><td></td></tr><tr><td>SEDNTERP</td><td></td><td></td><td>http://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page</td></tr><tr><td>HeteroAnalysis&nbsp;</td><td></td><td></td><td>http://www.biotech.uconn.edu/auf/?i=aufftp</td></tr><tr><td>SEDFIT</td><td></td><td></td><td>http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedfit.htm</td></tr><tr><td>SEDPHAT</td><td></td><td></td><td>http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedphat/default.htm</td></tr></tbody></table>

작은 올리고머 형성 막 단백질의 침전 평형 : 펜타 머 안정성에 히스티딘 양성자의 효과

Sedimentation Equilibrium of a Small Oligomer-forming Membrane Protein: Effect of Histidine Protonation on Pentameric Stability

분석 용 초 원심 분리 (AUC)은 상호 작용의 세기의 광범위한 생리 학적 조건 하에서 고분자 사이의 가역적 인 상호 작용을 연구하는데 사용될 수있다. 이 AUC를 정량적으로 화학 양론과 호모 생화학 적 과정에 과도 되돌릴 수 있습니다 헤테로 협회의 열역학을 평가하기 위해 선택하는 방법을합니다. 침강 평형 양상 (SE)에서, 확산 침강 간의 균형은 특정 관계 모델에 따라 반경 방향 거리의 함수로서 프로파일을 제공한다. 여기서, SE 상세한 프로토콜 분석 초 원심 분리기를 사용하여 작은 막 단백질 올리고머의 크기와 연관 단량체 단량체 에너지를 결정하기 위해 설명된다. AUC-ES는 단지 물리적 원리에 기초하여, 라벨없는이며, 모두 수용성 단백질 및 막에 사용될 수있다. 예는 후자의 도시, 인간 호흡기 합 포체 바이러스의 작은 소수성 (SH) 단백질 (hRSV), 펜타 머 이온 채널을 형성하는 단일 나선 α 횡단 (TM) 도메인과 65 아미노산 폴리펩티드. 기반 구조 NMR 데이터는 SH 단백질이 채널의 루멘에 대향 배향의 막 횡단 도메인의 두 protonatable 그의 잔기를 갖는 것을 보여준다. SE 실험은 pH가 협회 상수와 SH 단백질의 올리고머 크기에 영향을 미치는 방법을 결정하기 위해 설계되었습니다. 펜타 머 형태는 모든 경우에 유지되었지만, 그 연관 상수는 낮은 pH에서 환원시켰다. 이러한 데이터는 SH 단백질의 두 그의 잔류의 내강 방향과 일치 SH 채널 활동에 대한 관찰과 유사한의 pH 의존성과 일치한다. 후자는 낮은 pH에서 정전 기적 반발력 감소 올리고머 안정성이 발생할 수 있습니다. 생리 학적 조건의 미묘한 단백질 - 단백질 연관 변경 정량적 정보를 측정 할 수있을 때마다 요약하면,이 방법은 적용 가능하다.

50mM 트리스에서 C14SB 세제 미셀의 방사상 분포 프로필, 100 mM의 NaCl을 pH가 7.3 형태 선형 모델 (도 7A)에 장착 될 수있는 매우 얕은 지수. 이 분포의 기울기는 반대로 D 2 O 농도 (그림 7B)에 관련된다. 기울기가 0 인 점은, 정합 D 2 O 농도는 32.3 % 인 ​​것으로 밝혀졌다, 즉. 아래 그림 7을 참조하십시오. 동일한 실험은 다른 버퍼에 대해 반복 하였다는 50mM 인산 나트륨, 5.5 100 mM의 NaCl을 pH 및 50 mM의 포스페이트 - 시트 레이트, 100mM의 염화나트륨 pH 3으로 각각 D를 30.3 %와 41.0 %의 2 O 농도 일치 얻었다. <p class="jove_cont...

Sedimentation equilibrium (SE)은 생리학적 환경에서 단백질-단백질 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 원고는 인간 세포융합 호흡기 바이러스(hRSV)에 의해 암호화된 작은 소수성(SH) 단백질에 의해 형성된 호모펜타머의 안정성에 대한 pH의 영향을 결정하기 위해 이 기술의 사용을 설명합니다.

Analytical ultracentrifugation (AUC) can be used to study reversible interactions between macromolecules over a wide range of interaction strengths and ...

다음 실험의 전체적인 목표는 C 14 sulfalane 계면활성제 내에서 작은 소수성 폴리펩타이드에 의해 형성된 올리고머의 크기를 결정하고, pH 변화에 따른 이 올리고머의 안정성을 확인하는 것입니다. 이를 위해 먼저, 계면활성제 미셀의 밀도와 일치하여 부력을 중화시키는 중수(deuterium oxide) 농도를 결정합니다. 두 번째 단계로, 가용화된 작은 소수성 단백질 시료들에 대해 일련의 침강 평형 실험을 수행합니다.C 14 sulfalane 세제 내에서 결정된 세제 산화물 농도로 실험을 진행합니다. 다음으로, 다양한 pH 값에서 단백질의 침강 프로파일을 비교하기 위해 서로 다른 pH에서 첫 번째와 두 번째 단계를 반복합니다. 결과는 이 세제 내에서 작은 소수성 단백질의 올리고머 크기와 C 14 sulfalane 세제 내에서 이 올리고머의 안정성에 미치는 pH의 영향을 모두 보여줄 것입니다.조립, 세포 로딩, 밀도 매칭 및 평형 상태 도달과 같이 여러 단계가 포함되어 있어 초보 사용자가 쉽게 혼란을 느끼거나 어려워할 수 있으므로, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 이러한 단계에서 발생하는 작은 실수는 잠재적으로 며칠 분의 실험 시간을 낭비하게 만들 수 있습니다. 전체 절차는 본 연구실의 박사 과정 학생인 Suria가 시연하겠습니다.먼저 10 x buffer와 50 x detergent를 준비합니다. 10 x buffer와 50 x detergent 스톡 용액을 0.2 µm 시린지 필터로 여과 멸균하여 1.5 mL 에펜도르프 튜브에 각각 담아 스톡 용액으로 준비합니다. 부피 기준으로 deuterium oxide가 10%, 30%, 50% 함유된 세 가지 별도의 샘플 용액을 각각 200 µL씩 준비합니다.외부 충전재 없이 6채널 분석용 한외여과 셀을 조립하려면, 윈도우 가스켓을 윈도우 홀더에 넣고 윈도우 라이너를 약간 구부려 윈도우 홀더의 키웨이 반대편에 틈이 생기도록 윈도우 홀더에 배치하십시오. 그런 다음 사파이어 윈도우의 표시 부분을 윈도우 홀더에 맞추어 윈도우 라이너 내부에 배치하십시오. 파트 번호가 기재된 셀 하우징을 키웨이가 하우징 키와 일직선이 되도록 뒤집어서 배치하십시오.모서리가 깎인 측면이 아래로 향하도록 6섹터 센터피스를 셀 하우징에 밀어 넣은 다음, 창문이 아래를 향하게 하여 윈도우 어셈블리 하나를 넣습니다. 그다음 스크류 링 나사산과 스크류 링 와셔에 스핀 코트 윤활제를 가볍게 도포합니다. 윈도우 어셈블리 위에 스크류 링 와셔를 놓습니다. 'out'이라는 단어가 바깥쪽을 향하도록 스크류 링을 윈도우 하우징에 설치하고, 셀 정렬 도구를 사용하여 스크류 링을 손으로 조입니다.그런 다음 토크 렌치를 사용하여 스크류 링을 60 inch pounds로만 조입니다. 이어서 해당 부품 번호의 셀을 똑바로 세워 12시 방향에 배치합니다. 왼쪽 열에는 120 µL의 표준 용액을, 오른쪽 열에는 110 µL의 시료 용액을 주입합니다.200 µL 피펫을 사용하여 각 시료와 표준 물질이 정확하게 짝지어졌는지 신중하게 확인하십시오. 윈도우 어셈블리의 윈도우 면이 아래를 향하도록 하여 셀 하우징에 밀어 넣되, 내부 물질이 쏟아질 수 있으므로 셀을 과도하게 흔들지 않도록 주의하십시오. 이전 단계들을 반복하고, 두 번째 나사 링을 120 inch pounds로 조이십시오.그 다음 셀을 뒤집고 첫 번째 나사 링을 120 inch pounds로 다시 조입니다. 셀을 로터에 장착합니다. 로터를 원심분리기에 설치하고, 제조사의 지침에 따라 단색광 장치를 설치합니다.충분한 진공 상태에 도달하면, 원심분리기를 3000 RPM으로 가동하십시오. 사용자 인터페이스 소프트웨어에서 간섭 패턴을 미리 확인하고, 가장 높은 대비를 얻을 수 있도록 레이저 파라미터를 조정하십시오. 그다음, 평형 및 간섭 측정을 지정하여 새로운 설정 파일을 생성하십시오.단백질 샘플의 경우 45,000 rpm 또는 예상되는 최고 속도로 작동하도록 침강 평형법을 설정하고, 작동 온도는 20 °C로 지정하십시오. 데이터를 한 번 수집한 후, 최소 12시간 동안 15분 간격으로 스캔하십시오. hetero analysis에서 데이터 파일을 열고 match function을 선택하여 평형 진행 상태를 모니터링하십시오. 이때, 이전과 동일한 방식으로 석영 창이 있는 6채널 분석용 초원심분리 셀을 조립하십시오.겔 로딩 팁을 사용하여, 이전에 준비한 가장 높은 농도의 소수성 소형 단백질 샘플을 로터 중심과 가장 가까운 채널에 로딩하고, 가장 낮은 농도의 샘플을 로터 중심에서 가장 먼 채널에 로딩합니다. 흡광도 측정을 설정하려면 평형 도달 및 흡광도 측정을 지정하여 새로운 설정 파일을 생성합니다. 검출기 파장은 280 nanometers로 지정합니다.그 다음, 첫 번째 스캔 전 반경 보정 확인 및 스캔 옵션을 통해 3000 RPM에서 반경 보정을 수행합니다. 저해상도로 데이터 수집을 지정하고 단일 스캔을 실행합니다. 스캔이 완료되면 해당 옵션의 체크를 해제하십시오.20 °C에서 이전에 계산된 첫 번째 속도로 작동하도록 침강 평형법을 설정하고, 각 셀의 세부 설정에서 30분마다 한 번씩 스캔 데이터를 수집하십시오. 최소 18시간 후에 저해상도로 데이터를 수집하도록 지정하십시오. hetero analysis에서 데이터 파일을 열고 평형에 도달한 후 match 함수를 선택하여 평형 진행 상황을 모니터링하십시오.스캔이 완료되면 고해상도로 단일 스캔을 수집하십시오. 각 속도별로 평형에 도달하는 데 필요한 시간을 알고 있는 경우, 다음 속도에 대해 이전 단계들을 반복하십시오. 이전에 계산된 모든 속도를 포함하고 각 속도별 평형 시간 이후에 한 번의 스캔을 수집하도록 침강 평형법(sedimentation equilibrium method) 스캔을 설정하십시오.이 사례에서는 각 셀에서 고해상도 데이터 수집을 지정하여 C 14 sultan 세제 마이셀과 50 molar 인산나트륨 완충액(pH 7.3)의 방사상 분포를 상세히 분석하였습니다. 이는 선형 모델로 피팅 가능한 매우 완만한 지수 함수 형태를 나타냅니다. 이 프로파일의 기울기는 중수(deuterium oxide) 농도에 따라 달라지며, 기울기가 0이 되는 농도는 32.3%로 확인되었습니다. 동일한 실험을 pH 5.5 및 pH 3에서도 반복하여 각각 30.3%와 41%의 일치하는 중수 농도를 얻었습니다.pH 7.3에서 소수성 소단백질과 계면활성제는 겉보기 친화도 상수의 로그값이 21.05인 5량체(pentamer)를 형성하는 것으로 나타났습니다. 결합 상수는 pH 5.5에서 변하지 않았으나, pH 3에서는 유의미하게 감소했습니다. 이는 pK가 약 4.5일 때 낮은 pH에서 전도도가 감소한다는 이전의 보고들과 일치합니다.평형 세포 조립에 숙달되면, 적절히 수행할 경우 로딩 및 실험 설정은 1시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 침강 평형 실험을 준비하는 방법에 대해 충분히 이해하여, 막 단백질의 oligomeric size를 결정하고 안정성 및 서로 다른 실험 조건을 비교할 수 있게 될 것입니다.

sedimentation-equilibrium-small-oligomer-forming-membrane-protein

Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

트립토판 형광으로 막 단백질 폴딩의 깁스 자유 에너지를 얻기 위해이 동영상 기사 세부 실험 절차.

막 단백질 폴딩의 열역학은 형광 분광학에 의해 측정

단일 패스 transmembrane 도메인의 oligomerization의 성향 (TMDS)을 평가하는 효율적인 절차를 설명합니다. ToxR에 융합 TMD 구성된 키메라 단백질은 E. 대장균 기자 스트레인에 표현됩니다. TMD 유도 oligomerization는 ToxR, 해독 및 기자 단백질의 생산, - galactosidase의 활성의 dimerization이 발생합니다.

ToxR 분석에 의해 결정 Transmembrane 도메인 Oligomerization의 성향

효소에있는 물 분자의 수송 채널은 활성 부위 매화 및 촉매 작용에 영향을 미친다. 여기에서 우리는 실리 컴퓨터 모델링 및 실험에 기초하여 다음과 같은 추가 촉매 주제의 엔지니어링을위한 프로토콜을 제시한다. 이 효소의 촉매 작용에 용매 역학의 영향에 대한 우리의 이해를 향상시킬 것입니다.

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이 프로토콜은 형광 현미경을 사용하여 재구성된 막 연결 세포골격 네트워크의 역학을 연구하기 위해 지지된 지질 이중층의 형성과 세포골격 필라멘트 및 운동 단백질의 추가를 설명합니다.

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