공동 문화 시스템에 신경 연결의 형성을 평가하기위한 Optogenetic 접근

다음 실험의 전반적인 목표는 채널 rhodopsin-2(ChR2)를 통한 배양 뉴런의 광자극 기반 유전적 접근법을 사용하여, 인간 유도만능줄기세포 유래 뉴런의 기능적 연결 형성 능력을 평가하기 위한 공동 배양 시스템을 구축하는 것입니다. 이는 먼저 일차 마우스 신경 전구세포(NPC)를 분리하여 성상교세포로 분화시킨 후, ChR2가 형질전환된 일차 쥐 피질 뉴런을 기존 뉴런 집단 역할을 하는 성상교세포 층 위에 플레이팅함으로써 달성됩니다.

그 다음, 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell) 또는 IPSC 배양에서 유래한 인간 NPC를 synapsin one 2D tomato 바이러스로 형질도입한 후, 성상교세포-신경세포 배양물 위에 배치하여 분화를 유도함으로써 시냅스 연결을 형성하게 합니다. 결과적으로, CHR two를 발현하는 피질 신경세포에 광유전학적 자극을 주었을 때 IPSC 유래 신경세포에서 포스트시냅스 전류의 전기생리학적 기록이 나타남으로써, IPSC 유래 신경세포가 쥐의 피질 신경세포와 시냅스 연결을 형성함을 보여줍니다. 인간 IPSC 유래 신경세포를 성상교세포하고만 공동 배양하는 기존 방식과 비교했을 때 이 방법의 주요 장점은 이러한 인간 신경세포의 성숙 시간이 더 짧다는 것입니다.

이는 일차 뉴런의 존재가 이 인간 뉴런의 성숙을 가속화할 수 있기 때문입니다. 실험 절차는 본 연구실의 대학원생 Uni Chin과 George Augustine 연구실의 suing Y가 시연하겠습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 쥐 배아 뇌를 수확하고 피질 조직을 분리한 후, 피질 조직을 미리 데워둔 피질 조직 소화액이 담긴 접시로 옮깁니다. 37°C에서 30분 동안 배양하기 전에 피질 조직을 가능한 한 잘게 다집니다. 배양 후 피질 조직을 50 mL 원심분리 튜브로 옮기고, 조직 조각이 없는 균질한 용액이 생성될 때까지 세롤로지컬 피펫을 사용하여 조직을 해리합니다.

남아 있는 조직 덩어리를 걸러내기 위해 조직 용액을 70 micron 셀 스트레이너(cell strainer)에 통과시킵니다. 용액 3 mL를 15 mL 원심분리 튜브에 분주합니다.

각 튜브 바닥에 7.5% BSA가 포함된 1X PBS 800 µL를 첨가하여 조직층 아래에 층을 형성한 후, 200 Gs에서 5분 동안 원심분리합니다. 그 다음 두 층의 경계면에서 흡입하여 상층액을 제거합니다. 이때 튜브 바닥에 있는 세포 펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하십시오.

1 mL의 일차 신경세포 배지를 사용하여 각 세포 펠렛을 재현탁한 후, 이를 15 mL 원심분리 튜브에 모두 합칩니다. 그다음 헤모사이토미터를 사용하여 세포 밀도를 측정합니다. 600만 개의 쥐 피질 신경세포를 200 Gs에서 5분 동안 원심분리하고, 상층액을 제거합니다.

전기천공법을 위해서는 최소 600만 개의 피질 뉴런이 필요합니다. 생존한 뉴런에 의한 뉴런 네트워크 형성을 보장하기 위해, 전기천공 용액 100 µL를 세포 펠릿에 첨가하고 부드럽게 재현탁합니다. 그런 다음, 세포 현탁액 100 µL를 6 µg의 CR two 플라스미드와 혼합하여 인증된 큐벳으로 옮깁니다.

제조업체의 지침에 따라 전기천공에 적합한 프로그램을 선택하여 적용하십시오. 전기천공 후, 500 µL의 MEM을 큐벳에 추가합니다. 세포를 11.5 mL의 1차 뉴런 배지에 옮기고 조심스럽게 재현탁하십시오.

그 후 마우스 성상교세포가 포함된 24-웰 플레이트의 각 웰에 500 µL를 첨가합니다. 플레이트를 37 °C, 5% CO2 조건에서 배양합니다. 유도만능줄기세포(iPSCs)를 생성한 후, 텍스트 프로토콜에 따라 세포를 인간 신경전구세포(NPC) 배양 상태로 유도하고 유지합니다.

이 예시에서는 성상교세포 배양물에 일차 뉴런을 추가한 다음 날, 렌티바이러스 벡터 synapse in one TD tomato를 사용하여 NPC를 라벨링합니다. 1XPBS를 사용하여 인간 NPC를 한 번 세척한 다음, 세포 분리 용액을 첨가하고 30°C에서 5분 동안 배양합니다. 모든 세포가 분리되었는지 확인하십시오.

그 후 2배 용량의 D-M-E-M-F 12가 담긴 15 milliliter 튜브로 옮기고 200 G에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 신경 분화 배지를 사용하여 펠릿을 단일 세포로 부드럽게 재부유시킵니다. 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 세포 수를 측정합니다.

다음으로, 성상세포 피질 뉴런 배양 플레이트에서 배지를 조심스럽게 흡입하여 제거합니다. 신경 분화 배지에서 웰당 제곱센티미터당 5,000 cells 밀도로 인간 NPC를 배양합니다. 37 °C, 5% CO2 조건에서 배양하며, 최소 28일 동안 2~3일마다 배지를 교체합니다.

인간 IPC가 성숙한 뉴런과 같이 행동하는지 확인하기 위해, 60x 수침 렌즈가 장착된 공초점 현미경을 사용하여 인간 IPC에서 분화된 세포를 찾습니다. TD tomato를 시각화하여 확인합니다. 기록 피펫을 4~6 $\Omega$의 저항값이 되도록 제작하여 관류합니다.

세포를 95% 산소와 5% 이산화탄소가 지속적으로 버블링되는 외부 용액에 넣고 실온에서 유지합니다. 내부 용액을 사용하여 기록용 마이크로 피펫을 채운 후, 전세포 모드(whole cell mode)로 TD 토마토 양성 세포에 패치를 형성하고, 전류 클램프(current clamp) 상태에서 전류 주입에 반응하여 발생하는 활동전위의 발화를 기록합니다. 이는 ChR2를 발현하는 피질 세포의 활동전위가 빛 자극에 의해 안정적으로 유도되는지 확인하기 위한 것입니다.

먼저, 수은 아크 램프를 이용한 광조사와 480/40 nm 여기 필터 파장을 통해 GFP를 시각화하여 CR 두 개를 발현하는 피질 세포를 찾습니다. 전세포 모드의 전류 클램프 기록을 통해 활동 전위가 안정적으로 유도되는지 확인합니다. 유전적 자극을 수행하기 위해, 전세포 모드에서 TD tomato 양성 세포를 패치하고, 전체 시야 수은 램프와 480/40 여기 필터를 사용하여 전압 클램프를 -70 mV로 설정합니다.

전체 영역을 30초 동안 자극합니다. CHR2를 발현하는 시냅스 전 피질 뉴런의 광자극으로 인해 유도된 패치된 세포의 시냅스 후 전류(PSC)를 기록합니다. 진폭과 전류 영역의 임계값을 각각 5 pA 및 5 pA·s로 설정하고, 이러한 이벤트를 수동으로 검사하여 PSC가 아닌 트레이스는 모두 제거합니다.

본 영상에서 보여주는 바와 같이, iPSC 유래 뉴런, 일차 피질 뉴런 및 성상세포의 공배양을 생성하기 위해서는 여러 단계의 과정이 필요합니다. 이 이미지는 마우스 NPC가 성상세포로 분화된 지 2일째에 교세포 섬유성 산성 단백질 또는 GFAP 양성 성상세포를 쉽게 관찰할 수 있음을 보여줍니다. 마우스 NPC를 최소 일주일 동안 분화시킨 후, ChR2를 발현하는 피질 뉴런을 성상세포 단일층 위에 도말하였으며, 이 공배양 내의 두 세포는 GFAP와 ChR2의 면역형광 염색을 통해 확인되었습니다.

인간 NPC 분화를 3~4주간 진행한 후, 여기에서 보는 바와 같이 배양액에서 TD tomato 양성 뉴런이 검출되었습니다. 빛으로 자극했을 때, CHR two IPSC를 발현하는 피질 뉴런에서 활동 전위가 생성되었습니다. 유도된 뉴런 또한 흥분성을 가지며, 활동의 증가를 보여줍니다.

탈분극 전류 펄스의 진폭이 증가함에 따라 잠재적 발화가 나타났습니다. 빛이 없는 상태에서 IPSC 유래 뉴런은 자발적인 시냅스 입력을 받았습니다. 이러한 내향성 포스트-시냅스 전류는 주로 AMPA 수용체에 의해 매개되었습니다.

PSC의 빈도가 증가하는 동안 32번째 장광섬유 플래시(long light flash) 전반에 걸쳐 피질 뉴런의 광자극이 유지되었습니다. ChR2를 발현하는 피질 뉴런을 광자극했을 때, 그 진폭은 영향을 받지 않았습니다. 이 절차 이후, 관심 있는 특정 질환에 대한 후보 약물 화합물의 효과와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 서로 다른 환자 유래 세포 유형을 이용한 다른 공배양 시스템을 사용할 수 있습니다.