Name: 공동 문화 시스템에 신경 연결의 형성을 평가하기위한 Optogenetic 접근 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: 배우세요 iPSC 유래 신경세포와 원발성 대뇌피질 신경세포를 이용한 공동 배양 시스템에서 광유전학적 자극으로 시냅스 연결성을 평가하는 방법을. 이 기법은 신경망 형성 및 성숙 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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우리는 IPSC 세대에 전문 지식과 프로토콜을 공유하기 위해, 각각 ChR2 및 Synapsin1-tdTomato 렌티 바이러스 구조에 대한 C. 차이를 K. Deisseroth 및 S. 이인제 감사, 와이오밍 레옹 기술 지원, 공유, 시약 및 전문 지식에 대한 총리 실험실의 구성원. 이 작품은 ELG에 경쟁력있는 연구 프로그램 (002-082 2008 NRF-CRP NRF)에 따라 연구 재단 싱가포르, 애보트 영양과 ELG에 우수 학술 센터 (ACE) 글락소 스미스 클라인 (GSK)에서 연구 수상에 의해 지원과 GJA, 교육, 과학, 한국의 기술 (교육 과학 기술부) 장관의 재원으로 한국 연구 재단의 세계 수준의 연구소 (WCI) 프로그램 (NRF)에 의해 (NRF 허가 번호 : 2009-003 WCI) GJA에

<ol><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+mapping+of+synaptic+connectivity+using+photostimulation+in+Channelrhodopsin-2+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">High-speed mapping of synaptic connectivity using photostimulation in Channelrhodopsin-2 transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (19), 8143-8148 (2007).</li>
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<li>Asrican, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+transgenic+mice+for+optogenetic+analysis+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Next-generation transgenic mice for optogenetic analysis of neural circuits.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7, 160(2013).</li>
</ol>

이해 상충이 선언되지 않았습니다.

Optogenetics 뉴런 (13)의 정의 인구의 활성화를위한 시간과 공간 정밀도를 제공합니다. 실험에서, 현미경의 대물 필드는 전체 ChR2 표현 광 자극에만 피질 뉴런에 30 초 동안 조사 하였다. 이 시냅스 연결이 공동 문화 내에서 뉴런의 서로 다른 집단 사이에 형성되었는지를 우리가 결정하는 것을 허용했다. 우리의 결과는 photostimulation이 뉴런 ChR2을 표현하는 시냅스 대뇌 피질의 뉴런에서 시냅스 입력을받을 것을 증명하는 IPSC 파생 된 신경 세포 PSC 주파수를 증가시키는 것으로 나타났다. 이것은, 차례로, IPSC 유래 신경 성공적 피질 뉴런 회로에 통합하는 것이 확립. 본 공 배양 시스템의 생성을위한 몇몇 중요한 단계가있다. 그것은 도금을 진행하기 전에 마우스 NPC 파생 성상 세포 배양, 최소한의 세포 죽음으로 건강 있는지 확인하는 것이 중요하다다른 세포 유형. 대뇌 피질의 신경 세포와 인간의 NPC 건강 성상 세포에 잘 부착 및 전기 생리학 녹음 배양 조건에 크게 의존한다. 이 프로토콜의 다른 주요 단계는 성상 세포 배양 상에 전기와 대뇌 피질의 뉴런의 도금입니다. 다수의 셀이 전기 천공 후 다이로서, 적어도 6,000,000 피질 신경 세포를 24- 웰 플레이트에서 성상 세포 배양 물에 도금을위한 전기 천공되도록하는 것이 중요하다. 우리는보다 적은 세포 6,000,000 일렉트로 때, 뉴런의 생존 수를 전기 생리 학적 기록에 영향을 치밀 신경 네트워크를 형성하지 않은 것을 발견했다. 각 공동 배양 실험을 상이한 시험의 비교를 허용하기위한 전기 천공 피질 뉴런의 수는 일치한다. 소화 효소를 포함하는 모든 단계의 경우, 너무 오래는 세포 죽음으로 이어질 수 있으므로에 대한 소화 용액에서 세포를 남기지 않도록 필수적이다. 이방법은 다른 신경 세포와 시냅스 접촉을 형성하기 위해 환자 별 섬유 아세포 유래의 신경 세포의 기능을 스크리닝하는데 사용될 수있다. 신경 발달 장애 레트 증후군 (RTT)을 앓고있는 환자에서 섬유 아세포 유래의 신경 세포가 시냅스 전달 결함을 나타낸다 : RTT 뉴런 아마도 인해 덜 시냅스 연결 14 건강한 신경 세포에 비해 PSC 주파수 및 진폭의 상당한 감소를 나타낸다. 우리의 공동 문화 시스템은 발달 결함을 표시하는 신경 세포에 약물 효과를 검사 할 수 있습니다. 이 병에 걸린 사람의 NPC 시드 동안뿐만 아니라 신경 세포의 분화의 시간에 걸쳐 연속 화합물 노광 중에 관심 화합물의 첨가를 통해 수행 될 수있다. 본 공 배양 시스템은 또한 약물 테스트에 대한 모델로서 사용될 수 있지만,이 방법의 한계는 각 후보 화합물의 효과를 조사하는 과정이 길고 지루 수 있다는 것이다그것은 높은 처리량 스크리닝 방법이 아닙니다. 후보 화합물과 치료 후, I​​PSC 파생 뉴런은 개별적으로 PSC를 각 화합물의 효과를 결정하기 위해 패치해야합니다. 또한, 현재 환자의하지 사용할 수있는 많은 섬유 아세포 및 iPSCs있다. 따라서, 환자의 세포를 더 갖고 있으며 높은 처리량 스크리닝이 프​​로토콜을 적응 가까운 미래에 관심이있을 것이다. 예를 들어, 이온 또는 막 전위의 유전자 인코딩 센서 등의 작동 표시와 IPSC 유래의 신경 세포를 라벨링함으로써, 사이드 스테핑 시간이 소요되는 전기 생리 학적 절차에 의해 실질적으로 처리 속도를 높일 수있다. 전기 생리 학적 기록을 수행 아세포 재 프로그래밍에서,이 공존 배양 시스템을 생성하는 전체 프로세스로서, 90 일 이상, 그것은 각각 리 프로그래밍 및 신경 유도 단계 후에, 인간 iPSCs 나 NPC의 하나가 확장 될 것을 권장 필요동결 보존 및 미래 실험에 필요한 시간을 감소시킨다. 우리의 실험에서, 우리는 synapsin1 프로모터에서 대뇌 피질의 신경 세포에 ChR2을 표현했다. 이 프로모터는 팬의 연결이기 때문에, 우리는 아마 모두 억제와 흥분 대뇌 피질의 신경 세포를 photostimulating했다. 미래의 실험의 목적은 구체적으로 흥분성 또는 억제 회로 중 심문하는 경우,보다 특이 적 프로모터가 사용될 수있다. 또한, 대뇌 피질의 신경 세포는 유전자 변형 (또는 바이러스가 주입 된 쥐) ChR2 표현 특별히 신경 세포의 유전자 정의 주민들을 대상으로 얻을 수 있었다. 예를 들어, Cre 호텔 재조합 효소가 마우스에서 수확 대뇌 피질의 조직 ChR2을 표현하는 유일한 대뇌 피질의 신경 세포가 태양 광 발전의 interneurons 15됩니다 상황을 얻을 것입니다 floxed ChR2와 마우스로 교차 parvalbumin 함유의 interneurons (태양 광 발전의 interneurons)로 표현. 이러한 ChR2 발현 우리에서의 interneurons을 공동 CU의 사용lture 시스템 패치 IPSC 유래 뉴런의 PV의 interneurons와 회로에 통합 할 수 있는지 여부의 판단을 가능하게 할 것이다. 이전 연구 (9)을 바탕으로, 대뇌 피질의 신경 세포는 체외 14 일 후에 수상 돌기 겹치는 성숙. photostimulation 패치 된 IPSC 유래 신경 세포 반응을 유발하지 않는 경우 즉, 그것은 뉴런 피질 뉴런과 시냅스 연결을 할 수있는 능력을 갖고 있지 않음을 표시한다. IPSC 파생 된 신경 세포는 다른 IPSC 파생 된 신경 세포 또는 대뇌 피질의 신경 세포에서 하나의 시냅스 입력을 수신 할 수있다. 전통적인 패치 클램프 기록을 사용한 경우, 시냅스 입력이 어디에서 오는 구별 할 수 없을 것이다. 우리의 시스템의 장점은 피질 시냅스 입력에서 시냅스 반응은 선택적으로 유발하고 식별 할 수있다. 여기에 설명 된 절차를 통합하는 IPSC 유래 신경 세포의 능력을 평가하는 간단한 방법을 제공한다정의 된 신경 네트워크에.

최근 몇 년 동안, 신경 세포와 신경 회로 기능에 대한 우리의 이해는 신경 세포의 흥분을 제어하는​​ 여러 optogenetic 도구에 의해 혁명되었습니다. 이러한 도구 중 하나가 빛 활성화 양이온 채널입니다, channelrhodopsin-2 (ChR2) : 가벼운 자극 1-3 응답 ChR2 화재의 활동 전위를 표현하는 뉴런. 신경 세포는 빛에 일반적으로 구분하지 않습니다 때문에,이 놀라운 능력은 뉴런 4의 유전자 정의 인구의 활동의 정확한 시간적 및 공간적 제어를위한 새로운 길을 열어 크게 뇌 기능의 연구를 가속화하고있다. ChR2 신경망 (6)의 활동을 조절에 신경 개발 5 모니터링에서, 서로 다른 목적을위한 줄기 세포 연구에 적용되고있다. 여기서 우리는 신경 세포 공동 배양 시스템의 유용성을 높이기 위해 ChR2을 사용했다. 공동 문화 시스템은 서로 다른 종류의 세포 사이의 상호 작용에 대한 평가를 할 수 있습니다.신경원과 신경교의 공동 배양, 신경계의 주된 세포 유형은 일반적으로 서로 다른 세포 유형 간의 시그널링을 조사 할뿐만 아니라 생리적 반응이 시그널링의 중요성을 평가하기 위해, 손상 및 전파를 조사하는 데 사용 잠재적으로 7 시그널링에 관여하는 분자 메커니즘. 이전 연구는 인간의 iPSCs 쥐 대뇌 피질의 차 문화를 포함하는 신경 세포, 성상 세포, 희소 돌기 아교 세포 및 미세 아교 세포 (8)의 존재에 신경 세포에 매우 빠르게 분화 것으로 나타났다. 이 프로토콜에서 우리는 인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)에서 파생 된 쥐의 대뇌 피질의 뉴런과 뉴런 사이의 시냅스 연결을 심문하기 위해 공동 배양 시스템에서 ChR2을 활용하는 방법을 보여줍니다. 우리는 성상 세포로 해부하는 단계와 수확 뇌 조직 (9)뿐만 아니라 마우스 신경 전구 세포를 유지하고 차별화 (NPC들)을 설명하고 인간의 NPC 값 int오 신경 세포 공동 배양 시스템을 만들 수 있습니다. 본 공 배양 시스템을 구축하기 위해, 우리는 오키타 동부 등에 의해 설명 된 통합 무 리 프로그래밍 방법을 사용 하였다. 10 인간 iPSCs를 생성하기. 리 등에 의해 기술 된 바와 같이 선택된 iPSCs는 효율적 소분자 억제제를 사용하여 화학적으로 정의 된 조건에서의 NPC를 분화시켰다. 11 공동 문화에서 신경 세포의 다른 인구 토마토 (tdTomato) 이량 체 형광 단백질, 탠덤를 통해 IPSC 파생 된 신경 세포의 대뇌 피질의 뉴런에서 ChR2 표현의 감지 및 태그를 통해 확인할 수있다. 피질 뉴런의 optogenetic photostimulation와 IPSC 유래 뉴런으로부터 전기 생리 레코딩 결합 서로 회로를 형성하는 뉴런이 두 가지 유형의 능력을 평가할 수있다. 특히, 대뇌 피질의 뉴런 ChR2가 발현의 photostimulation는 시냅스 회로를 형성 IPSC 파생 된 신경 세포의 시냅스 반응을 불러 일으킨다광 여기 대뇌 피질의 신경 세포 네트워크와. 우리는 증가 된 시냅스 후 전류가 실제로 이러한 조건에서 IPSC 파생 된 신경 세포에서 발견되는 것을 보여줍니다. 이 프로토콜은 병 환자로부터 유래의 섬유 아세포를 이용하여 iPSCs 다른 신경 학적 질병 모델의 재현부 포함한 실험 조건 하에서 다양한 시냅스 회로의 평가를 허용한다.

<table><tbody><tr><td>Neurocult Proliferation Kit (Mouse)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5702</td><td>Contains NSC Basal medium and NSC Proliferation Supplement</td></tr><tr><td>Epi5 Episomal iPSC Reprogramming Kit</td><td>Invitrogen</td><td>A15960</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Lonza</td><td>12719F</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>글루타민이 없는 21103049 MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11090081</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Invitrogen</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX 보충제</td><td>Invitrogen</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>시그마</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>인간 LIF</td><td>Invitrogen</td><td>PHC9484</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130103926</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>시그마</td><td>S4317</td><td></td></tr><tr><td>화합물 E</td><td>Merck Millipore</td><td>565790</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Merck Millipore</td><td>324856</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>R& D Systems</td><td>233FB025</td><td></td></tr><tr><td>연구 등급 FBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV30160.03</td><td>성상세포 분화 매체용</td></tr><tr><td>정의된 FBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30070.03</td><td>1차 뉴런 매체용</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td>1차 뉴런 배지용</td></tr><tr><td>설탕</td><td>시그마</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>헤파린</td><td>EMD 밀리포어</td><td>375095</td><td></td></tr><tr><td>파파인</td><td>워딩턴</td><td>3126</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7923</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>용 수확 뇌</td></tr><tr><td>EBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14155063</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine</td><td>Sigma</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; m 세포 여과기</td><td>BD Biosciences&nbsp; &nbsp;</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>20 &마이크로; m 필터 유닛</td><td>Sartorius Stedim</td><td>16534K</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Fluka</td><td>71505</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7520</td><td>전기생리학적 연구용</td></tr><tr><td>K-글루코네이</td>트 <td>Sigma</td><td>P1847</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>KANTO Chemical</td><td>3234400</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>전기생리학적 연구용</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Na2ATP</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>Na3GTP</td><td>Sigma</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>붕규산 유리 모세관</td><td>World Precision Instruments, Inc</td><td>1604323</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 원심분리기 튜브</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td>352096</tr><tr><td>50 ml 원심분리기 튜브</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>24-웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>9761146</td><td></td></tr><tr><td>6-웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>720083</td><td></td></tr><tr><td>T25 플라스크</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>12 mm 커버 안경</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>111520</td><td></td></tr><tr><td>AMAXA 랫 뉴런 핵펙터 키트& 주의;</td><td>Lonza</td><td>VPG1003</td><td>주요 피질 뉴런의 전기천공을 위해</td></tr><tr><td>Neon Transfection System&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>MPK5000</td><td>인간 섬유아세포의 전기천공을 위한</td></tr><tr><td>미니 분석&nbsp;</td><td>Synaptosoft</td><td>Mini Analysis v.6</td><td>PSC 측정을 위해</td></tr><tr><td>Normal Dermal Human Fibroblasts</td><td>PromoCell</td><td>C12300</td><td></td></tr><tr><td>pLenti-Synapsin-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE</td><td>Addgene</td><td>20945</td><td></td></tr><tr><td>Mercury short-arc lamp</td><td>OSRAM</td><td>HBO 103 W/2</td><td></td></tr></tbody></table>

공동 문화 시스템에 신경 연결의 형성을 평가하기위한 optogenetic 접근

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

여기서 우리는 2개의 서로 다른 뉴런 집단으로 구성된 공동 배양을 생성하는 프로토콜을 설명합니다. 유도만능줄기세포(iPSC)는 에피솜 벡터를 사용하여 인간 섬유아세포에서 재프로그래밍됩니다. iPSC의 집락은 섬유아세포 재프로그래밍을 시작한 후 30일 후에 관찰할 수 있습니다. 만능 집락은 신경 전구 세포(NPC)로 분화할 수 있도록 신경 유도 배지에서 수동으로 선택하고 성장합니다. iPSC는 1주일 이내에 신경 상피 세포로 빠르게 전환되며 높은 배양 밀도로 유지될 때 자가 재생 능력을 유지합니다. 1차 마우스 NPC는 7일 동안 혈청 함유 배지에 노출되어 성상세포로 분화되고 배아 18일(E18) 쥐 피질 뉴런(채널로돕신-2(ChR2)로 형질주입됨)이 추가된 단층을 형성합니다. 형광 단백질인 탠덤 이량체 토마토(tdTomato)로 태그된 인간 NPC는 다음 날 성상세포/피질 뉴런 배양에 파종되고 28-35일 동안 분화됩니다. 우리는 이 시스템이 iPSC 유래 뉴런과 피질 뉴런 사이에 시냅스 연결을 형성한다는 것을 보여주며, 이는 피질 뉴런의 광자극에 따른 시냅스 전류의 빈도 증가에서 분명합니다. 이 공동 배양 시스템은 다른 신경 세포 집단과 시냅스 연결을 생성하는 iPSC 유래 뉴런의 능력을 평가하기 위한 새로운 플랫폼을 제공합니다.

여기서, 성상 세포로 구성된 공존 배양 생성에 관련된 여러 단계를 설명하는 프로토콜, 및 인간 대뇌 피질 뉴런 뉴런 도시된다. 인간 iPSCs 고밀도 (그림 1A)에서 유지되었다 NPC들 (11)을, 작은 분자 억제제의 칵테일 신경 계통에 에피 솜을 사용하여 섬유 아 세포를 재 프로그래밍하여 얻은 10 벡터 및 지정되었습니다. tdTomato (그림 1B) 태그 인간의 NPC의 성상 세포에 마우스의 NPC의 차별화, ChR2을 표현하는 쥐의 대뇌 피질의 뉴런의 도금 및 시드 : 몇 가지 단계가 공동 문화를 생성해야합니다. 분화 일 2시, 아교 섬유 성 산성 단백질 (GFAP) + 성상 세포는 쉽게 우리의 문화 (그림 1C)에서 관찰 할 수있다. 마우스의 NPC는 성상 세포 단일 층 (그림 1D)에 ChR2을 표현하는 대뇌 피질의 신경 세포를 도금하기 전에 적어도 일주일 차별화시켰다. 3 후인간의 NPC 분화의 사주로, tdTomato + 뉴런은 문화 (그림 1E)에서 검출되었다. 이 공동 문화 시스템은 빛의 자극 (그림 2A)에 대응하여 개별 IPSC 파생 된 신경 세포의 시냅스 전류의 일관성을 검출 할 수있다. 빛에 의해 자극되면, 활동 전위는 ChR2 (그림 2B)를 표현하는 대뇌 피질의 신경 세포에서 생성되었다. 전류 펄스를 탈분극의 진폭 증가 활동 전위 소성을 보여 뉴런도 (그림 2C) 고르기가 있습니다 IPSC 파생 (그림 2D)를 증가 하였다. 따라서, 이들 세포는 성숙한 신경 특성을 나타낸다. 광 부재에서 IPSC 유래 신경 자발 시냅스 입력 (도 2e)을 받았다. GABA 수용체를 통해 전류가 외부 것이기 때문에이 안쪽으로 시냅스 전류는 주로, AMPA 수용체에 의해 매개하고 NMDA 수용체는 전류를 운반하지 않습니다-70 MV의 유지 가능성을 t. 빛 자극이 크게 시냅스 후 전류 (그림 2E)의 주파수를 증가하기 때문에 적어도 이러한 입력의 일부는, ChR2 표현 시냅스 대뇌 피질의 뉴런에서 있었다. 시냅스 입력의 증가의 시간 과정은 그림 2 층에 표시됩니다 : 대뇌 피질의 뉴런의 photostimulation은 30 초 긴 빛 플래시에 걸쳐 지속되었다. ChR2 - 표현 대뇌 피질의 뉴런 (그림 2G) 광 여기 때 PSC를의 주파수가 상승하는 동안, 자신의 진폭 (그림 2H)의 영향을받지이었다. 요약하면, 이러한 결과는 IPSC 파생 된 신경 세포가 성숙한 신경 세포의 특성을 나타내과 연접 대뇌 피질의 뉴런과 시냅스 연결을 형성 할 수 있음을 나타냅니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52408/52408fig1highres.jpg" /> 그림 1 : 공동 문화의 생성을위한 개략도iPSCs 및 NPC들에 신경 유도로 인간의 섬유 아 세포를 재 프로그래밍 시스템. (A) 타임 라인. 대뇌 피질의 신경 세포와 성상 세포 문화에 성숙한 신경 세포로 인간의 NPC의 터미널 차별화를위한 (B) 타임 라인. (C) 마우스의 NPC가 빠르게 GFAP로 분화 + 성상 세포 (2) 후 체외에서 일. (D) 일주 후, ChR2을 표현하는 대뇌 피질의 신경 세포가 GFAP + 성상 세포에 배양 하였다. (E) 4~5주에서 인간의 NPC의 분화 후, 전기 생리학 녹음은 tdTomato + 뉴런에서 수행되었다. 스케일 바는 100 μm의를 나타냅니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52408/52408fig2highres.jpg" /> 그림 2 : 기능 시냅스 연결의 Optogenetic 분석. tdTomato (빨간색) 태그 (A) IPSC 유래 세포는 대뇌 피질의 신경 세포가 발현와 공동 배양 한 빛 활성화채널 ChR2 (녹색). IPSC 파생 된 신경 세포에서 녹음은 대뇌 피질의 신경 세포 또는 다른 IPSC 파생 된 신경 세포 하나에서 올 수 시냅스 전류 (PSC) 응답을 밝혔다. (B) 조명 (파란색 막대)는 ChR2을 표현하는 대뇌 피질의 신경 세포의 활동 전위의 시리즈를 유발. ( C) IPSC 유래 세포 ChR2 - 표현 대뇌 피질의 신경 세포 (E) Photostimulation (파란색 막대). IPSC 파생 된 세포의 전류 곡선 대 D) 발사 (. 전류 주입에 의해 유발 IPSC 파생 된 신경 세포에서 PSC를의 주파수를 증가 . photostimulation 의해 제조 PSC 주파수의 증가 (F) 경시. 블루 바는 photostimulation의 시간을 나타냅니다. PSC 주파수 photostimulation (G) 증가 동안 (G, H), PSC 진폭은 영향을받지 않습니다 (H)이었다. * P &lt;0.05는 학생의 t-test로 대조군에 비해 나타냅니다.

유도만능줄기세포(iPSC), 일차 피질 뉴런 및 성상세포에서 유래한 뉴런으로 구성된 공동 배양 시스템을 생성하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 공동 배양 시스템을 통해 새로운 iPSC 유래 뉴런과 채널로돕신-2를 발현하는 기존 피질 뉴런 사이의 시냅스 접촉 및 회로 형성을 감지할 수 있습니다.

공동 문화 시스템에 신경 연결의 형성을 평가하기위한 Optogenetic 접근

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

다음 실험의 전반적인 목표는 채널 rhodopsin-2(ChR2)를 통한 배양 뉴런의 광자극 기반 유전적 접근법을 사용하여, 인간 유도만능줄기세포 유래 뉴런의 기능적 연결 형성 능력을 평가하기 위한 공동 배양 시스템을 구축하는 것입니다. 이는 먼저 일차 마우스 신경 전구세포(NPC)를 분리하여 성상교세포로 분화시킨 후, ChR2가 형질전환된 일차 쥐 피질 뉴런을 기존 뉴런 집단 역할을 하는 성상교세포 층 위에 플레이팅함으로써 달성됩니다.그 다음, 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell) 또는 IPSC 배양에서 유래한 인간 NPC를 synapsin one 2D tomato 바이러스로 형질도입한 후, 성상교세포-신경세포 배양물 위에 배치하여 분화를 유도함으로써 시냅스 연결을 형성하게 합니다. 결과적으로, CHR two를 발현하는 피질 신경세포에 광유전학적 자극을 주었을 때 IPSC 유래 신경세포에서 포스트시냅스 전류의 전기생리학적 기록이 나타남으로써, IPSC 유래 신경세포가 쥐의 피질 신경세포와 시냅스 연결을 형성함을 보여줍니다. 인간 IPSC 유래 신경세포를 성상교세포하고만 공동 배양하는 기존 방식과 비교했을 때 이 방법의 주요 장점은 이러한 인간 신경세포의 성숙 시간이 더 짧다는 것입니다.이는 일차 뉴런의 존재가 이 인간 뉴런의 성숙을 가속화할 수 있기 때문입니다. 실험 절차는 본 연구실의 대학원생 Uni Chin과 George Augustine 연구실의 suing Y가 시연하겠습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 쥐 배아 뇌를 수확하고 피질 조직을 분리한 후, 피질 조직을 미리 데워둔 피질 조직 소화액이 담긴 접시로 옮깁니다. 37°C에서 30분 동안 배양하기 전에 피질 조직을 가능한 한 잘게 다집니다. 배양 후 피질 조직을 50 mL 원심분리 튜브로 옮기고, 조직 조각이 없는 균질한 용액이 생성될 때까지 세롤로지컬 피펫을 사용하여 조직을 해리합니다.남아 있는 조직 덩어리를 걸러내기 위해 조직 용액을 70 micron 셀 스트레이너(cell strainer)에 통과시킵니다. 용액 3 mL를 15 mL 원심분리 튜브에 분주합니다.각 튜브 바닥에 7.5% BSA가 포함된 1X PBS 800 µL를 첨가하여 조직층 아래에 층을 형성한 후, 200 Gs에서 5분 동안 원심분리합니다. 그 다음 두 층의 경계면에서 흡입하여 상층액을 제거합니다. 이때 튜브 바닥에 있는 세포 펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하십시오.1 mL의 일차 신경세포 배지를 사용하여 각 세포 펠렛을 재현탁한 후, 이를 15 mL 원심분리 튜브에 모두 합칩니다. 그다음 헤모사이토미터를 사용하여 세포 밀도를 측정합니다. 600만 개의 쥐 피질 신경세포를 200 Gs에서 5분 동안 원심분리하고, 상층액을 제거합니다.전기천공법을 위해서는 최소 600만 개의 피질 뉴런이 필요합니다. 생존한 뉴런에 의한 뉴런 네트워크 형성을 보장하기 위해, 전기천공 용액 100 µL를 세포 펠릿에 첨가하고 부드럽게 재현탁합니다. 그런 다음, 세포 현탁액 100 µL를 6 µg의 CR two 플라스미드와 혼합하여 인증된 큐벳으로 옮깁니다.제조업체의 지침에 따라 전기천공에 적합한 프로그램을 선택하여 적용하십시오. 전기천공 후, 500 µL의 MEM을 큐벳에 추가합니다. 세포를 11.5 mL의 1차 뉴런 배지에 옮기고 조심스럽게 재현탁하십시오.그 후 마우스 성상교세포가 포함된 24-웰 플레이트의 각 웰에 500 µL를 첨가합니다. 플레이트를 37 °C, 5% CO2 조건에서 배양합니다. 유도만능줄기세포(iPSCs)를 생성한 후, 텍스트 프로토콜에 따라 세포를 인간 신경전구세포(NPC) 배양 상태로 유도하고 유지합니다.이 예시에서는 성상교세포 배양물에 일차 뉴런을 추가한 다음 날, 렌티바이러스 벡터 synapse in one TD tomato를 사용하여 NPC를 라벨링합니다. 1XPBS를 사용하여 인간 NPC를 한 번 세척한 다음, 세포 분리 용액을 첨가하고 30°C에서 5분 동안 배양합니다. 모든 세포가 분리되었는지 확인하십시오.그 후 2배 용량의 D-M-E-M-F 12가 담긴 15 milliliter 튜브로 옮기고 200 G에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 신경 분화 배지를 사용하여 펠릿을 단일 세포로 부드럽게 재부유시킵니다. 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 세포 수를 측정합니다.다음으로, 성상세포 피질 뉴런 배양 플레이트에서 배지를 조심스럽게 흡입하여 제거합니다. 신경 분화 배지에서 웰당 제곱센티미터당 5,000 cells 밀도로 인간 NPC를 배양합니다. 37 °C, 5% CO2 조건에서 배양하며, 최소 28일 동안 2~3일마다 배지를 교체합니다.인간 IPC가 성숙한 뉴런과 같이 행동하는지 확인하기 위해, 60x 수침 렌즈가 장착된 공초점 현미경을 사용하여 인간 IPC에서 분화된 세포를 찾습니다. TD tomato를 시각화하여 확인합니다. 기록 피펫을 4~6 $\Omega$의 저항값이 되도록 제작하여 관류합니다.세포를 95% 산소와 5% 이산화탄소가 지속적으로 버블링되는 외부 용액에 넣고 실온에서 유지합니다. 내부 용액을 사용하여 기록용 마이크로 피펫을 채운 후, 전세포 모드(whole cell mode)로 TD 토마토 양성 세포에 패치를 형성하고, 전류 클램프(current clamp) 상태에서 전류 주입에 반응하여 발생하는 활동전위의 발화를 기록합니다. 이는 ChR2를 발현하는 피질 세포의 활동전위가 빛 자극에 의해 안정적으로 유도되는지 확인하기 위한 것입니다.먼저, 수은 아크 램프를 이용한 광조사와 480/40 nm 여기 필터 파장을 통해 GFP를 시각화하여 CR 두 개를 발현하는 피질 세포를 찾습니다. 전세포 모드의 전류 클램프 기록을 통해 활동 전위가 안정적으로 유도되는지 확인합니다. 유전적 자극을 수행하기 위해, 전세포 모드에서 TD tomato 양성 세포를 패치하고, 전체 시야 수은 램프와 480/40 여기 필터를 사용하여 전압 클램프를 -70 mV로 설정합니다.전체 영역을 30초 동안 자극합니다. CHR2를 발현하는 시냅스 전 피질 뉴런의 광자극으로 인해 유도된 패치된 세포의 시냅스 후 전류(PSC)를 기록합니다. 진폭과 전류 영역의 임계값을 각각 5 pA 및 5 pA·s로 설정하고, 이러한 이벤트를 수동으로 검사하여 PSC가 아닌 트레이스는 모두 제거합니다.본 영상에서 보여주는 바와 같이, iPSC 유래 뉴런, 일차 피질 뉴런 및 성상세포의 공배양을 생성하기 위해서는 여러 단계의 과정이 필요합니다. 이 이미지는 마우스 NPC가 성상세포로 분화된 지 2일째에 교세포 섬유성 산성 단백질 또는 GFAP 양성 성상세포를 쉽게 관찰할 수 있음을 보여줍니다. 마우스 NPC를 최소 일주일 동안 분화시킨 후, ChR2를 발현하는 피질 뉴런을 성상세포 단일층 위에 도말하였으며, 이 공배양 내의 두 세포는 GFAP와 ChR2의 면역형광 염색을 통해 확인되었습니다.인간 NPC 분화를 3~4주간 진행한 후, 여기에서 보는 바와 같이 배양액에서 TD tomato 양성 뉴런이 검출되었습니다. 빛으로 자극했을 때, CHR two IPSC를 발현하는 피질 뉴런에서 활동 전위가 생성되었습니다. 유도된 뉴런 또한 흥분성을 가지며, 활동의 증가를 보여줍니다.탈분극 전류 펄스의 진폭이 증가함에 따라 잠재적 발화가 나타났습니다. 빛이 없는 상태에서 IPSC 유래 뉴런은 자발적인 시냅스 입력을 받았습니다. 이러한 내향성 포스트-시냅스 전류는 주로 AMPA 수용체에 의해 매개되었습니다.PSC의 빈도가 증가하는 동안 32번째 장광섬유 플래시(long light flash) 전반에 걸쳐 피질 뉴런의 광자극이 유지되었습니다. ChR2를 발현하는 피질 뉴런을 광자극했을 때, 그 진폭은 영향을 받지 않았습니다. 이 절차 이후, 관심 있는 특정 질환에 대한 후보 약물 화합물의 효과와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 서로 다른 환자 유래 세포 유형을 이용한 다른 공배양 시스템을 사용할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리는 시험 관내 CNS 축삭 - glia의 상호 작용 연구를위한 새로운 다중 구획 신경 공동 문화 microsystem 플랫폼을 개발했습니다. 플랫폼은 병렬 여섯 독립적인 실험까지 실시 수 있으며, 새로 개발된 마이크로 / 매크로 하이브리드 제조 방법을 사용하여 가공했습니다.

다중 구획 CNS 뉴런 - glia 공동 문화 Microfluidic 플랫폼

이 연구는 소설 neuronal 축삭과 (천체) glia 공동 문화 플랫폼을 설정하는 절차를 설명합니다. 이 공동 문화 시스템에서 하나의 축삭 (및 단일 glial 세포) 사이의 직접 상호 작용 조작은 glial 신호에 대한 상호 신경 세포의 기계론의 분석을 수 있도록 가능한된다.

마이크로 유체 문화 플랫폼에 Glia 상호 작용 (MCP) 기반 Neuronal 축삭과 Glia 공동 문화 시스템에 신경의 영상 분석

이 동영상은 인간 신경전구세포(NPC)를 뉴런으로 분화하는 방법을 보여줍니다. NPC는 확립된 마우스 성상세포-쥐 피질 뉴런 공동 배양에 도입되어 NPC가 뉴런으로 분화되는 것을 촉진합니다. 분화는 컨포칼 현미경으로 세포를 시각화하여 확인됩니다.

인간 신경전구세포를 뉴런으로 분화시키기 위한 공동 배양 기술

이 비디오는 인간 유도 뉴런(iN)과 유도 희소돌기아교세포 전구세포(iOPC)의 공동 배양 확립을 보여줍니다. iNm은 공동 배양에서 iOPC와 혼합된 다음 두 iNm이 뉴런으로, iOPC가 희소돌기아교세포로 성숙하는 것을 지원하기 위해 배양됩니다. 뉴런은 다른 뉴런 및 희소돌기아교세포와 시냅스 연결을 형성하는 반면, 희소돌기아교세포는 뉴런의 축삭돌기 주위에 수초를 발달시킵니다.

뉴런-희소돌기아교세포 상호작용을 모델링하는 공동 배양 방법

이 비디오는 iPSC 유래 뉴런과 쥐 피질 뉴런 사이의 신경 연결을 평가하기 위한 전기생리학적 기록을 보여주고, 빛에 민감한 이온 채널을 활성화하고 시냅스후 전류를 감지하여 공동 배양에서 시냅스 접촉을 확인합니다.

전기생리학적 기록을 사용한 공동 배양에서의 신경 연결 형성 평가

우리는 시험관 내에서 신경 세포 집단을 광자극하기 위해 광유전학적 접근 방식을 사용하여 전뇌 회로의 기능적 지형 및 시냅스 특성을 특성화하는 방법을 설명합니다.

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개체 발생 과정 억제 GABA 성 시냅스의 형성을 좌표 공동 분자 메커니즘은 크게 알려져 있지 않다. 이러한 프로세스를 연구하기 위해, 우리는 기능 GABA의 수용체를 표현 안정적으로 형질 전환 된 인간 배아 신장 293 (HEK293) 세포와 함께 배양 한 배아 매체 가시 GABA 성 신경 세포를 통합하는 공동 문화 모델 시스템을 개발했다.

공동 문화 모델, 설립 GABA 성 중간 가시 신경 세포 및 HEK293 세포에서 억제 시냅스 형성 안정적으로 GABA를 표현 수용체

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간접 신경-성상 세포 공동 배양 분석 일 :<em&gt; 체외</em&gt; 신경 세포 - glia 상호 작용의 상세한 조사를위한 셋업

이 프로토콜 thalamocortical 축 삭 분기 및 시 냅 스 대형의 organotypic cocultures에서 시상과 대뇌 피 질의 동시 이미징 하는 방법을 설명합니다. 개별 thalamocortical 축 삭 및 그들의 연 접 맨끝 DsRed와 GFP 태그 synaptophysin 단일 셀 electroporation 기법으로 시각화 됩니다.

분기 Thalamocortical 축 삭과 시 냅 스의 시각화 Organotypic Cocultures에서 형성

여기서 우리는 급성 설치류 뇌 조각에서 시냅스 특이적 전기생리학적 특성을 허용하기 위해 광유전학적 구조를 가진 분리된 뇌 영역의 바이러스 형질도입을 설명하는 프로토콜을 제시합니다.

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공동 문화 시스템에 신경 연결의 형성을 평가하기위한 Optogenetic 접근

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