Name: 레이디 얼 이동성 및 레트로 바이러스 복제 벡터 형질 도입, 비 접착 Alloresponsive T 림프구의 세포 독성 기능 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: 배우세요 비접착 효과 T 림프구가 종양 세포 단층 위로 이동하는 과정을 세포 침강 매니폴드와 형광 현미경을 사용하여 관찰하는 방법입니다. 이 기술은 면역 유전자 치료 연구에 활용됩니다.

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NIH R01 CA121258, R01 CA125244, R01 CA154256, NIH / NCATS UCLA CTSI 허가 번호 UL1TR000124, USAMRMC W81XWH-08-1-0734, 그리고 조안 S. 홈즈 기념 연구 기금에 의해 부분적으로 지원됩니다. MJH와 GCO는 UCLA에서 조안 S. 홈즈 기념 박사후 원정대에서 지원 받았다. CSM 장치는 창조적 인 과학적인 방법에서 얻은 : www.creative-sci.com. 렌티 바이러스 벡터는 CURE / P30의 DK041301 지원하는 UCLA 벡터 코어에서 받았습니다.

1. 슬라이드 준비 <ol><li> 멸균 파우치에 휴대 침전 매니 폴드 슬라이드를 삽입하고 오토 클레이브 테이프로 밀봉. 봉지의 종이 측 플라스틱 웰에 침착을 방지하기 위해 슬라이드 테프론 코팅면에 직면한다. </li><li> 121 ℃에서 15 분간 멸균 파우치. </li><li> 멸균 150 X 15mm 멸균 페트리 접시에 바이오 안전성 캐비닛과 장소 내부 살균 주머니에서 슬라이드를 제거합니다. 네 개의 슬라이드까지 접시 당에 맞게 할 수 있습니다. 슬라이드 옆에 35 X 10mm 페트리 접시를 놓습니다. 가습을 제공하기 위해 멸균 H 2 O의 2-3 ML을 추가합니다. </li><li> 물론 전체를 커버하기에 충분한 양을 사용하여 100 ㎍ / ㎖의에 폴리 D 리신으로 미리 코팅 슬라이드. RT 이상의 시간 후, 용액을 흡인하고, 웰의 표면 위에 1X PBS 피펫 팅하여 잘 배의 표면을 헹군다. </li><li> 선택적으로, 더 강한 종양 세포 부착을 위해 피브로넥틴 또는 다른 ECM 성분을 추가한다. 충분한 볼륨 그쪽에서 5 ㎍ / ㎖의에서 피브로넥틴 추가웰 T RT에서 단시간 내에 건조하지 않습니다. <ol><li> 1 시간 후, 남아있는 솔루션을 대기음 1X PBS와 피펫 팅에 의해 아래로 두 번 씻는다. </li></ol></li><li> 종양이 도금을위한 준비가 될 때까지 우물에 PBS를 유지합니다. 사용 당일 슬라이드. </li><li> 원하는 점착성 종양 세포 유형의 융합 플라스크 수확. 적절히 완충 성장 매체 - 예를 들어 5 × 106 세포 / ml의 광 현미경 resuspend에 의해 트립 판 블루 염색 배제를 사용하여 생존 세포를 세어, 둘 베코 최소 필수 배지, 10 % 소 태아 혈청 (DMEM) (FBS), L- 글루타민 및 피루브산 나트륨. </li><li> 부착 성 세포 집단의 형광 영상을 원하는 경우, 중요한 형광 염료 또는 제조사에 의해 제공된 프로토콜에 따라 세포 증식 염료 부착 세포 집단 레이블. </li><li> 부드럽게 아에 거품을 만들지 않도록하기 위해 슬라이드 돌보는의 각 웰에 전체 매체의 10 μl를 피펫LS, 다음과 같이 균일 한 종양 세포의 부착을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 각 웰 (그림 1A)의 매체에 2.5-5.0 × 10 4 세포 (세포 현탁액의 5 ~ 10 μL)를 추가합니다. 종양 세포 유형의 성장 및 바람직한 일 수에 따라 최적의 수를 조정한다. 큰 종양 세포 또는 빠르게 성장하는 세포는 처음에는 적은 수의 세포를 필요로 할 수있다. 세포의 균일 한 분포를 확인하기 위해 위 아래로 중간 피펫을 추가하여 40 μL까지 잘 볼륨을 가져와. </li><li> 모든 웰은 시딩 한 후, 종양 세포는 그 후, 실온에서 접착 배치 뚜껑을 150 X 15mm 페트리 접시에 조심스럽게 최소 24 시간 동안 37 ℃ / 5 % CO 2 가습 인큐베이터 접시를 이동할 수있다. </li><li> 매일 문화 매체를 변경합니다. 조심스럽게 단층에서 소비 된 매체의 일부를 피펫 신선한 완전 배지로 교체합니다. 참고 : 증발하기 때문에, 더 볼륨을 꺼내어보다 추가해야합니다. 웰스 분석을위한 준비가되어있을 때조차, confl세포의 uent 층이 존재한다. 이 1~3일 초기 시딩 후 일반적이다. </li><li> 단계 1.4에서 설명하고 단일 층이 요구되는 경우 2 단계로 진행, 또는 단일 층에서 ECM 단백질을 추출 아래 1.13 단계 중 하나로 PBS로 가볍게 한 번 단층을 씻으십시오. </li><li> 완전 배지에서 0.5 % 트리톤 X (v / v)의 솔루션을 확인하고 각 웰에 30 μl를 추가합니다. 단분자막이어서, 2 분 동안 후드 다이제스트 전술 한 바와 같이 피펫 팅 완전 배지로 두 번 세척하자. 참고 : ECM 층은 광학 현미경 (그림 2)로 표시 될 수 있습니다. 바로 슬라이드를 사용하거나 1-2일의 가습 CO 2 배양기에서 완전한 매체에 보관하십시오. 우물이 건조 할 수 없습니다. </li></ol> 슬라이드에 미부착 된 T 세포의 침강 2. <ol><li> 미부착 된 세포 집단의 형광 이미징이 요구되는 경우, 이러한 CFSE, 셀 트랙커 레드 CMPTX 또는 eFluor 같은 중요한 형광 염료 미부착 된 세포 집단을, 레이블분석에 앞서 제조에서 1 시간 이상에 의해 제공된 프로토콜에 따라 670. 대안으로, 바이러스 벡터에 의해 코딩되는 형광 단백질을 발현하는 세포를 조작. </li><li> 상기 1.2에 기재된 바와 같이 오토 클레이브 파우치 셀 침강 매니 폴드를 압력솥. </li><li> 생물 안전 캐비닛의 보육과 장소에서 테프론 코팅 된 슬라이드를 포함하는 가습 실을 제거합니다. </li><li> 피펫 팅에 의해 1X PBS로 우물을 세척하고 아래로, 다음 10 % 이상 혈청을 포함하는 완전한 매체의 45 μl를 추가합니다. </li><li> 살균 봉투로부터 매니 폴드를 조심스럽게 제거하고 슬라이드 (도 1b)의 바닥에 닿을 매니 폴드의 끝에 &#39;후크&#39;까지 웰 위에 미끄러. </li><li> 배지는 각 채널에서 볼 수 있는지 확인하십시오. 아무 것도 볼 수없는 경우, 매니 폴드를 벗고 잘 대응에 더 많은 매체를 추가 한 다음 교체하고 다시 확인합니다. </li><li> 각 짱 단계를 반복 2.5에 채널 매니 폴드의, 또는 많은 우물을 위해 원하는대로. </li><li> 아니 이하 / 5 10 × 1.0 ~ 2.0보다 μL에서 비 부착 세포에 resuspend를 계산합니다. 세포의 1 μl를 작성하여 천천히 채널 (그림 1C)로 피펫. 물론 원하는 각각에 대해이 작업을 수행합니다. </li><li> 채널의 세포가 정착 할 수 있도록 20 ~ 30 분 동안 바이오 후드 안쪽 즉, 매니 폴드와 슬라이드 전체 셀로드 장치를, 두십시오. </li><li> 국소 적 우물 (그림 1D)의 중심에 놓는 세포를 방해하지 않도록 슬라이드에서 바로 들어 올려 부드럽게 양쪽 끝을 터치에 의해 매니 폴드를 제거합니다. </li><li> 비 접착 세포가 성공적으로 잘 매니 폴드 채널의 원주 내에 머무르는 중심 시딩 된되도록 각 웰을 검사한다. 비 - 부착 세포는 이상적으로 약간 부드럽게 따라서 셀 PELLE 발생하지 않습니다 주위 슬라이드 이동, 단층 또는 ECM으로 서로 부착된다t은 분산합니다. 슬라이드를 밀다하지 마십시오. </li></ol> 3. 형광 현미경 <ol><li> 침강 확인 후 적절한 실험 장비, 영상을 수행합니다. 이상적으로, CO 2 및 습도 챔버가 장착되어 현미경을 사용합니다. 웰의 전체가 볼 수 있도록 여러 개의 이미지를 허용하는 낮은 전력, 즉 4X 또는 10X, 이미지에 더 큰 영역으로 채취한다. </li><li> 촬상 소프트웨어를 이용하여 디지털 이미지를 획득. 명 시야 및 / 또는 다 채널 형광 이미징을 수행한다. </li><li> 원하는 경우, 특정 영역에 서로 다른 채널의 이미지를 촬영하거나, 또는 가습 슬라이드를 유지하고 37 ° C / 5 % CO 2 배양기에서 수동으로 (원하는 시점에서 이미지에 그림을 취할 시간 경과를 설정 더 이상 시간 지점에 권장 1E &amp; F). </li></ol> 4. 분석 및 디스플레이 <ol><li> 이미지 편집 소프트웨어를 사용하여 광 및 FL 병합그래서 하나의 층에 여러 종류의 세포 및 마크로 uorescent 이미지는 동일한 이미지를 볼 수있다. 드래그 앤 각 개별 프로그램에 색상과 메시지가 표시되면, 여러 레이어와 이미지 파일을 만들 수있는 &#39;레이어를 추가&#39;옵션을 선택에 대한 이미지 파일을 삭제합니다. <ol><li> 높은 배율에서 취할 정렬하고 디지털 함께 잘에서 이미지 만들기. 두 이미지 사이의 보존 된 지역보고 완전한 그림이 생성 될 때까지 다른 상단에 하나의 이미지를 오버레이하여 파일을 맞 춥니 다. </li></ol></li><li> 각각의 세포가 마이그레이션 한 거리를 결정 캡처 소프트웨어를 사용하여 수집하는 동안 이미지 미크론 막대를 추가합니다. </li><li> 다양한 시간에 세포 이동을 결정 형광 T 세포 응집 또는 시간에 걸쳐 정량화, 즉 이미지 소프트웨어, ImageJ에 의해 표면 강도 형광을지도한다. <ol><li> 표면 플롯을 생성하는 단계 4.1 및 레이어 창에서 생성 된 레이어 이미지를 촬영하기 위해,원하는 채널에 해당하는 제외한 모든 레이어를 선택 취소합니다. 표면 그림이 EMD 발현을 시각화하고자하는 경우, 예를 들어,이 마커에 사용될 필터에 대응하는 전용 &quot;녹색&quot;층을 보여야한다. </li><li> 이미지를 평평하게하고 프로그램으로 이미지를 (예를 들어, .png를) 인식 할 수있는 파일 형식으로 저장 및로드합니다. 표면 플롯을 생성하기 위해, 8 비트에 이미지 형식을 변경 배경을 줄이기 위해 필요에 따라 밝기 / 명암을 변경하고 &#39;/ 표면 플롯 분석&#39;옵션을 선택합니다. 그림 5의 이미지는 &#39;그늘&#39;, &#39;축 그리기&#39;, &#39;하나의 다각형 당 선&#39;과 &#39;부드러운&#39;체크 박스를 선택하여 생성되었다. </li><li> 대안 적으로, 시간 제로 초점 셀로부터 입금 반경 또는 직경을 측정 할 그리고 상이한 시간 시점에서 최 세포에 비교한다. 테프론 웰의 직경은 6.0 mm이다. </li></ol></li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

단일 세포 현탁액 중의 종양 세포는 테프론 마스크 슬라이드의 웰에 피펫 팅 하였다. 세포가 접착 가능하고 가습 된 5 % CO 2, 37 ℃ 배양기 (도 1a)에 단분자층을 형성 하였다. 단일 층에서 파생 설립 된 단일 층 또는 ECM 단백질은 이러한 분석 (그림 1B) 수확 할 수있다. EMD를 코딩하는 벡터로 중요한 형광 염료로 표지 또는 형질 이펙터 T 림프구 웰을 사용 CSM의 중심으로 시딩 하였다. 시간에 따른 단층 또는 ECM 단백질에 마이그레이션하는 미부착 된 효과기 T 림프구의 능력을 평가하고 그 다음 빛과 형광 현미경으로 정량 하였다. 여기서는 부분적으로 중요한 표적 U-87MG 교종 세포의 단층에 미부착 alloCTL 이펙터의 이동 및 세포 독성을 평가 하였다 (도 3 및도 5). 오직 인간 백혈구 항원의 일부를 표시하는이 표적 세포,원래 자극에서 볼 (HLA) 분자 (HLA-A2, B44)은, 관련...

방사형 단층 세포 이동 분석은 원래 세포 외 기질 (ECM) 단백질 5-7 또는 피브로넥틴 또는 라미닌 1,2- 개별 ECM 성분으로 코팅 된 슬라이드 부착 성 종양 세포의 1-4 침윤성 특성을 측정하기 위해 개발되었다. 기술은 스테인레스 스틸 셀 침강 매니 폴드 (CSM)을 사용하여 웰의 중심에 종양 세포의 단일 세포 현탁액을 시딩 관여. 침전 후, 종양 세포는 수평 운동의 속도를 설정하는 데 사용 된 시간과 웰 위에 초기 세포 집단의 직경 변화의 하단에 부착된다. 방사형 단층 세포 이동 분석은 세포의 체외 철새 능력을 분석하는 트랜스 웰 플레이트를 채용 기존의 방법에 비해 시각적 인 장점을 제공; 이러한 분석은 촬상 8 비 이바지. 뿐만 아니라, 또한 평가시기를 선택하는 자유도 다량 구비마이그레이션, 평가된다 시점들의 수에 제한이없는 연구자가 침전 후 이미지를 선택할 수있을 때에요. 이동하는 능력이 특히 그들은 바이러스 벡터에 대한 전달 비히클로서 사용될 수있다 면역 또는 여기서의 영역에서, 비 - 부착 세포에 중요한 기능을하기 때문에, 우리는 미부착 된 세포의 이동을 평가하기 CSM의 사용을 채택 종양 세포 단층상의 종류, ECM 단백질 이외에. 현미경, 또는 개별 ECM 구성 요소에 종양에서 고립 복잡한 ECM에, 가능한 종양 세포 단일 층에 비 부착 세포의 이동을 시각화의 추가 혜택이 분​​석은 다양한 있습니다. 하나의 세포 외 단백질로 코팅 우물을 사용하는 분석은 정확하게 세포가 생체 내에서를 통해 마이그레이션 것 ECM 조직 기판 또는 종양을 반영하지 않습니다. 여기서 우리는 주요 histocomp 민감 alloreactive 세포 독성 T 림프구 (alloCTL)를 사용우리의 대표적인 비 - 부착 세포 유형으로, 단방향 혼합 림프구 종양 세포 반응 (MLTR) 또는 혼합 림프구 반응 (MLR)을 사용하여 구 atibility 복합체 (MHC) 단백질. 우리는 모두 인간과 쥐 기원의 세포를 시험했다. 마이그레이션 종양 단층을 측정 한 결과, 고용 종양 세포가 부분적으로 관련 대상 MHC 분자의 전체 세트와 이펙터, 또는 완전히 관련 목표를 감작하는 데 사용되는 세포 집단에서 발견 동일한 MHC 단백질의 일부​​를 표시되었는지 이펙터를 향해 민감했다. 일부 실험에서, 우리는 이펙터와 대상 세포를 구분하는 형광 CellTracker 레드 CMPTX 또는 세포 증식 염료 eFluor (670)을 사용했다. 또한 세포를 시각화하는 추가적인 방법으로 형광 단백질 바이러스 벡터로 형질 도입 인코딩을 사용했다. 특정 분석을 위해, 우리는 에메랄드 그린 (EMD) 형광 단백질 (10, 11)을 코딩하는 레트로 바이러스 복제 벡터 (RRV)로 alloCTL를 형질 도입; OTH에 대한ERS 종양 세포 mStrawberry 코딩하는 렌티 바이러스 벡터로 형질 도입 하였다. alloCTL 종양 세포 단층에서 수확 종양 세포 단층 또는 ECM 하나의 중심으로 매니 폴드의 채널을 통해 접종 하였다. 점착성 및 비 점착성 세포 상호 작용에 의해 빛 및 / 또는 시간에 따른 형광 현미경에 의해 가시화 하였다. 고전력 파편과 핵 저전력 종양 세포 단일 층 붕괴, 또는 종양 세포는 각각 분해 및 아폽토시스에 의한 세포 손상의 지표였다. 우리는 디지털 단층 배양 위에 미부착 된 형광 T 세포의 이동을 나타내는 표면 형광 세기 맵을 생성. 우리는 또한 세포 독성이 포개어 미부착 alloCTL의 클러스터 형성 후 부착 신경 교종 세포 단층에 생기게 언급. 뿐만 아니라, 신경 교종 단층에 alloCTL에서 RRV-EMD의 수평 전달이 관찰되었다.

<table><tbody><tr><td>테프론 마스크 현미경 슬라이드</td><td>Creative Scientific Methods</td><td>CSM002</td><td></td></tr><tr><td>Cell Sedimentation Manifold</td><td>Creative Scientific Methods</td><td>CSM001</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시, 150mm</td><td>코닝</td><td>430597</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시, 35mm</td><td>코닝</td><td>430588</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Mediatech</td><td>21-040</td><td></td></tr><tr><td>20 &뮤; l Pipetman</td><td>Gilson</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; l Pipetman</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; l 피펫 팁</td><td>VWR</td><td>89003-060</td><td></td></tr><tr><td>증류수, 탈이온수(멸균)</td><td>Mediatech</td><td>25-055</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Mediatech</td><td>25-054-CL</td><td></td></tr><tr><td>Celltracker Red CMPTX</td><td>Invitrogen</td><td>C34552</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express (optional)</td><td>Gibco</td><td>12604</td><td></td></tr><tr><td>종양 세포 배양 배지(예: DMEM)</td><td>Mediatech</td><td>10-013</td><td></td></tr><tr><td>AIM-V 무혈청 매체</td><td>Invitrogen</td><td>12055-083</td><td></td></tr><tr><td>태아 혈청</td><td>오메가 사이언티픽</td><td>FB-02</td><td></td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPOT 고급</td><td>진단 기기</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Millipore</td><td>A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>BD</td><td>354008</td><td></td></tr><tr><td>31/2 x 51/4 오토클레이브 파우치</td><td>Crosstex</td><td>SCXS2</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Mediatech</td><td>25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td>세포 증식 eFluor 670</td><td>eBioscience</td><td>65-0840-85</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

레이디 얼 이동성 및 레트로 바이러스 복제 벡터 형질 도입, 비 접착 alloresponsive t 림프구의 세포 독성 기능

Radial Mobility and Cytotoxic Function of Retroviral Replicating Vector Transduced, Non-adherent Alloresponsive T Lymphocytes

우리는 먼저 형광 표지 된, 비 - 부착 인간 또는 뮤린 효과기 면역 세포의 운동성을 측정하기 위해, 세포 외 기질 단백질에 부착 된 종양 세포의 반경 방향 이동을 측정하는 것으로보고, 방사형 단층 세포 이동 분석법 신규 적응을보고한다. 이 기술은 스테인리스 매니 폴드 10 웰 테플론 슬라이드 국소 적 융합 성 종양 세포 단층 또는 세포 외 기질 단백질로 제조 중 웰로 미부착 된 T 세포를 증착하기 위해 사용한다. 광 및 / 또는 다 채널 형광 현미경은 시간이 지남에 이펙터 세포의 이동 및 동작을 추적하는 데 사용된다. 형광 염료 및 / 또는 형광 유전자에 대한 코드가 차등 이미징 세포 유형에 라벨을 사용하는 바이러스 벡터. 이 방법은 슬라이드 챔버, 한천 또는 트랜스 웰 플레이트를 이용하여 수평 또는 수직 마이그레이션 / 침략을 추적 체외 분석에서 비슷한 유형 구별된다. 분석은 상세한 영상 데이터가 ㄱ 할 수 있습니다특정 형광 마커에 의해 구별 다른 종류의 세포로 수집 된 전자; 세포의 경우에도 특정 하위 집단 (즉, nontransduced / 형질)을 모니터링 할 수 있습니다. 표면 강도 형광 플롯 이주 셀 타입에 대응하는 특정 형광 채널을 이용하여 생성된다. 이것은 특정 시간에 비 부착 면역 세포 이동의 더 나은 시각화 할 수 있습니다. 그것은뿐만 아니라, 세포를 대상으로 같은 세포 독성 또는 이펙터에서 바이러스 벡터의 전송과 같은 다른 이펙터 세포 기능의 증거를 수집 할 수 있습니다. 따라서,이 방법은 연구자들이 다양한 유형의 미시적 부착 세포 차분 적 표지 된, 비 - 부착의 세포 간 상호 작용을 기록 할 수있다. 이러한 정보는 기능의 시각적 증거가 암 치료를위한 이들의 사용 전에 종양 표적 세포에 요구되는 생물학적 활성 또는 조작 면역 세포 유형의 평가에 특히 적합 할 수있다.

형광 단백질 코딩하는 바이러스 벡터는, 또는 그 대신에 형광 염료의에 더하여 사용될 수있다. 바이러스 형질 도입은 운동성 분석에 앞서 수행되어야한다. 두 점착성 및 비 점착성 세포 유형 차등하게 표지 될 수있다. 전달을위한 프로토콜을 이용할 벡터의 종류에 따라 달라질 것이다. 여기서, 우리는 (12)을 설명하는 프로토콜을 사용하는 분석에 앞서도 RRV EMD-3, 5, 6, 적어도 이틀 alloCTL를 형질 도입. 또한 mStrawberry 적색 형광 단백질 (도 4)을 표현하는 종양 세포를 형질 도입하기 위해, 렌티 바이러스 벡터, CMV-IRES-딸기 FLUC2을 사용했다. 이 형질 도입 지점은, 신선한 배지를 첨가 한 48 시간 동안 세포를 플라스크에 벡터를 가산함으로써 달성 하였다. 제한 희석, 세포 이틀 동안 회복시킨 후 100 % 형질 도입 된 세포 집단을 생성하기 위해 수행 하였다. <p class...

세포 침전 매니폴드/슬라이드 장치를 사용하여 시험관 내에서 비부착 면역 세포의 방사상 이동성을 모니터링하는 프로토콜을 설명합니다. 세포 이동은 종양 세포의 단층 또는 세포외 기질 단백질에서 추적됩니다. 광학 및 형광 현미경에 의한 검사를 통해 세포 이동성 및 세포 독성 기능을 관찰할 수 있습니다.

레이디 얼 이동성 및 레트로 바이러스 복제 벡터 형질 도입, 비 접착 Alloresponsive T 림프구의 세포 독성 기능

We report a novel adaptation of the Radial Monolayer Cell Migration assay, first reported to measure the radial migration of adherent tumor cells on ...

다음 실험의 전반적인 목표는 부착성 종양 세포 단층 위로 비부착성 작동 T 림프구의 이동을 보여주는 것입니다. 이는 먼저 poly D lysine이 코팅된 Teflon 마스크 슬라이드의 웰에 부착성 종양 세포 단층을 형성함으로써 달성되며, 두 번째 단계로 세포 침강 매니폴드를 사용하여 형광 표지된 작동 T 림프구를 단층의 중앙으로 침강시킵니다. 다음으로, 광학 및 형광 현미경을 사용하여 단층 위로 비부착성 세포가 이동하는 모습을 시각화합니다.결과는 부착성 종양 세포 단층과 공동 배양된 비부착성 T 림프구의 이동 및 작동 기능이 레트로바이러스 벡터로 형질전환된 후에도 유지됨을 보여줍니다. 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 부착성 종양 세포와의 공동 배양 상태에서 비부착성 작동 T 림프구의 방사형 이동을 측정할 수 있다는 점입니다. 이는 사이토신 데아미나제(cytosine deaminase)와 같은 프로드러그 활성제 유전자를 발현하도록 수정된 동종 세포독성 T 림프구가 뇌 종양 제거를 위한 다중 모드 접근 방식으로 테스트되고 있기 때문에, 원발성 또는 전이성 뇌종양 환자에게 광범위한 시사점을 갖습니다.일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 종양 세포의 부착 특성이 성장 과정에서 이질적이기 때문에 부착성 종양 세포 단일층을 형성하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다. 균일한 종양 단일층을 생성하고 비부착성 L-O-C-T-L을 효과적으로 침전시키기 위해서는 두 세포 유형의 특성에 대한 숙련된 이해가 필요하므로, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 우선, 최대 4개의 멸균된.멸균된 150 millimeter by 15 millimeter 페트리 접시에 10웰 테플론 코팅 슬라이드를 넣습니다. 습도를 유지하기 위해 2~3 milliliters의 멸균수를 담은 35 millimeter by 10 millimeter 페트리 접시를 슬라이드 옆에 배치합니다. 다음으로, 각 웰을 100 micrograms per milliliter 농도의 poly D lycine 또는 poly L lysine 용액으로 덮어 슬라이드를 사전 코팅합니다.슬라이드를 실온에서 1시간 동안 배양한 다음, 용액을 흡입 제거하고 샘플 웰이 준비된 상태에서 PBS로 웰 표면을 2회 헹굽니다. 부착성 종양 세포가 가득 찬 플라스크를 수확합니다. 광학 현미경으로 생존 세포 수를 측정한 후, 세포를 5×10⁶ cells/mL 농도로 부유시킵니다.완충 성장 배지 내에서 종양 세포 유형에 따라 각 웰에 5~10 µL의 세포 현탁액을 첨가하고, 배지를 사용하여 웰의 부피를 40 µL로 맞춘 후 피펫으로 천천히 섞어 세포를 균일하게 분산시킵니다. 웰에 세포를 분주한 후, 종양 세포가 가라앉을 수 있도록 상온에서 30분 동안 둡니다. 그런 다음 페트리 접시에 뚜껑을 닫고 37 °C, 5% CO2 조건의 습윤 배양기로 조심스럽게 옮겨 최소 24시간 동안 배양합니다.단층 세포층에서 배지의 일부를 조심스럽게 제거하고, 더 많은 양의 신선한 완전 T세포 배지로 교체하여 웰의 배양 배지를 매일 변경하십시오. 세포들은 일반적으로 1~3일 이내에 합쳐지며, 이를 통해 종양 세포 단층 위로 침강시키기 위한 세포 준비가 완료됩니다. 비부착 T세포를 회수하고, 분석 시작 최소 1시간 전에 제조사의 프로토콜에 따라 세포 증식 염색약으로 라벨링하십시오.다음으로 종양 세포 슬라이드가 들어 있는 습윤 챔버를 생물학적 안전 작업대에 놓습니다. 피펫팅을 통해 웰을 PBS로 세척한 후, 10% 혈청이 포함된 완전 배지 45 µL를 웰에 첨가합니다. 멸균된 세포 침강 매니폴드를 웰 위로 밀어 넣어 매니폴드 끝의 갈고리가 슬라이드 바닥에 닿게 합니다.배지가 매니폴드 채널에 보이는지 확인하십시오. 그런 다음 부착되지 않은 세포 수를 측정하고, 배지 내 세포 농도가 1~2 × 10⁵ cells/µL가 되도록 현탁하십시오.세포 침강을 방해할 수 있는 세포 응집물을 제거하기 위해 세포를 부드럽게 분산시킵니다. 세포 현탁액 1 µL를 각 웰의 매니폴드 채널로 천천히 피펫팅합니다. 그 후, 채널 내의 세포가 단층 위에 가라앉을 수 있도록 장치를 실온에서 20~30분 동안 배양합니다.세포가 가라앉은 후, 슬라이드에 닿지 않게 매니폴드를 수직으로 천천히 들어 올립니다. 세포 펠렛이 매니폴드 채널의 둘레 내에 잘 안착되었는지 확인하십시오. 현미경으로 관찰했을 때, 안착된 세포들이 단일층에 살짝 부착되어 슬라이드를 가볍게 움직여도 펠렛이 흩어지지 않아야 합니다.세포가 침전되었음을 확인한 후, 이산화탄소 및 습도 챔버가 장착된 도립 현미경으로 슬라이드를 옮깁니다. 4배 x 대물렌즈를 사용하여 세포의 명시야 및 다채널 형광 이미지를 촬영합니다. 특정 영역의 명시야 및 형광 채널 이미지를 획득한 다음, 이미지 캡처 소프트웨어를 사용하여 마이크론 바를 추가합니다.모든 시점의 이미지를 획득한 후, 각 시점 사이에 슬라이드를 가습 인큐베이터에 보관하십시오. 이미지 파일들을 이미지 편집 프로그램으로 드래그 앤 드롭한 다음, 레이어 추가 옵션을 선택하여 다중 레이어 이미지 파일을 생성하십시오. 명시야 이미지와 형광 이미지를 하나의 레이어로 병합하십시오.획득 소프트웨어를 사용하여 8 mm x 8 mm 영역의 이미지를 촬영합니다. 소프트웨어는 웰 전체에서 가장 잘 표현되는 채널을 사용하여 캡처된 이미지들을 자동으로 병합(stitch)하도록 설정해야 합니다. 형광 채널만 촬영하는 경우, 부착 세포를 촬영하는 채널을 선택해야 합니다.또는 이미지 편집 소프트웨어를 사용하여 이미지를 스티칭할 수 있습니다. 이는 이미지 간에 공통으로 나타나는 영역을 정렬하고, 전체 이미지가 생성될 때까지 이미지들을 서로 겹쳐서 수행합니다. 이미지 소프트웨어를 사용하여 이미지들을 함께 스티칭하십시오.Image J 소프트웨어를 사용하여 결합된 이미지로 표면 강도 형광 맵을 제작함으로써 T-세포의 응집 또는 시간에 따른 확산을 시각화합니다. 에메랄드 녹색 형광 단백질 발현 유전자를 인코딩하는 복제 가능 레트로바이러스 벡터로 형질전환된 인간 동종 반응 세포독성 T 림프구(Allo CTL)를 신경교종 세포 단일층의 중심에 배치했습니다. 4시간 후, 모든 Allo CTL은 24시간까지 가시적인 응집체를 형성했습니다.부착 세포 단층에 빈 공간이 나타난 것은 종양 세포의 용해를 나타내며, 일부 동종 CTL이 선단 너머로 이동했음을 보여주었습니다. 형광 표지된 마우스 동종 CTL을 형광 표지된 신경교종 세포 단층의 중앙에 배치했습니다. 1시간 후, 동종 CTL은 신경교종 세포와 밀접하게 결합했으며, 48시간 후에는 동동 CTL이 단층의 중앙에서 멀리 이동했습니다. Image J 소프트웨어를 사용하여 이 이미지들로부터 형광 맵을 생성하였으며, 48시간 후 중앙에서 상당한 거리가 떨어진 곳으로 이동했음을 보여줍니다.종양 세포 단층의 건강한 배양 조건을 유지하기 위해 배양액을 매일 교체하는 것이 중요합니다. 또한, 숙련된 경우 이 절차에 따른 비부착 세포의 침강은 약 20분 정도 소요됩니다. Allo CTL이 단층을 가로질러 이동하는 속도나 세포독성 기능을 수행하며 종양 세포와 접촉하는 시간에 관한 의문을 해결하기 위해 세포 경로 추적과 같은 다른 방법들을 사용할 수 있습니다.본 프로토콜은 면역 유전자 치료 분야의 연구자들이 종양 세포와의 공동 배양 환경에서 유전자 변형 T 림프구의 이동을 탐구하는 데 도움을 줄 것입니다. 이 영상을 시청하고 나면, 공동 배양을 위한 비부착성 세포와 부착성 세포의 준비 방법 및 세포 침강 매니폴드를 사용하여 종양 세포 단일층 위에서 비부착성 세포의 수평 방사형 이동을 연구하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

radial-mobility-cytotoxic-function-retroviral-replicating-vector

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 기술은 인간의 oncogene을 인코딩 복제 - 결함 retroviral 주식을 준비하는 효율적인 방법을 보여줍니다, 그리고 이후 마우스 모델에 myeloproliferative 질병의 유도에 사용.

293T 세포의 과도 Transfection하여 복제 - 결함이 레트로 바이러스의 생산

우리는 retroviral 전달을 사용하여 항원 - 특정 마우스 T - 세포를 생산하는 프로토콜을...

마우스 T - 세포에서 T - 세포 수용체의 Retroviral 전달

의 생성에 대한 신속, 간단하고 비용 효율적인 프로토콜 기증자 파생 CMV, EBV 감염 또는 교수실을 개발하는 위험 allogeneic 조혈 줄기 세포 이식 (HSCT) 수신자에게 주입을위한 multivirus 특정 CTLs (rCTL을). 이 제조 과정은 GMP 준수하고 전문 센터 이외 T - 세포 immunotherapy의 광범위한 구현을 보장한다.

Multivirus 특정 T 세포 생성 Allogeneic 조혈 줄기 세포 이식 후 바이러스 감염을 예방 / 치료

순진 CD4 콕 사키 아데노 바이러스 수용체의 유전자 발현과 T 세포에 아데노 바이러스 유전자 전달은 규제 T 세포 분화의 분자 분석을...

나이브 CD4의 아데노 바이러스 형질은 Treg의 분화를 연구하는 세포를 T

우리는 단일 T 세포 수용체(TCR) 레트로바이러스 기반 생체 내 발현 시스템을 위한 빠르고 유연한 프로토콜을 제시합니다.  레트로바이러스 벡터는 골수 전구 세포를 transduction하여 TCR 형질전환 마우스의 대안으로 in vivo에서 단일 TCR의 T 세포 발달 및 기능을 연구하는 데 사용됩니다.

골수 전구 세포의 레트로 바이러스 형질 도입은 T 세포 수용체 Retrogenic 마우스를 생성하는

많은 실험 시스템은 면역 반응의 T 세포의 발달 및 기능을 조절하는 메카니즘을 이해하는 데에 이용되고있다. 여기 레트로 바이러스 형질 도입을 이용하여 유전 적 접근 경로를 규정하는 식별 경제적 시간 효율적이고, 무엇보다도 매우 유익하다 설명한다.

공부하는 유전 적 접근으로 헬퍼 T 세포의 레트로 바이러스 형질 도입은 메커니즘 자신의 차별화 및 기능 제어

단일 셀 쌍 인간의 TCR 알파와 베타 체인 시퀀싱과 현재 프로토콜 결합 유선형 retroviral 벡터 생체 외에서 그리고 vivo에서 TCR 식와 호환의 세대.

단일 셀 TCR 고립과 Retroviral 벡터 생체 외에서 의 생성과 Vivo에서 표현의 인간의 TCRs 간소화

여기, 우리는 인간 세포에서 Moloney 뮤린 백혈병 바이러스 기반의 레트로 바이러스 벡터의 통합 사이트의 게놈 전체 매핑을위한 프로토콜을 설명합니다.

레트로 바이러스 스캐닝 : MLV 통합 사이트 맵핑으로 세포 특정 규제 지역 정의

여기서 우리는 생체 내 B-1a 세포 이동 및 국소화를 검사하기 위해 뮤린 B-1a 세포의 레트로바이러스 과발현 및 입양 전달방법을 설명한다. 본 프로토콜은 기증자 B-1a 세포 국소화의 정량화 또는 기증자 세포 유래 분비 인자의 분석 후 입양 전달을 포함하는 다양한 다운스트림 기능 성 분석을 위해 확장될 수 있다.

뮤린 B-1a 세포에 CXCR4의 레트로 바이러스 과발현 및 골수와 IgM 생산에 표적 B-1a 세포 이동을 위한 채택 전송

현재 연구는 바이러스 특이적 TFH 세포의 조기 운명 헌신을 평가하고 이러한 세포에서 유전자 발현을 조작하기 위한 프로토콜을 보여줍니다.

급성 LCMV에 감염된 마우스에서 바이러스 특이적 여포 도우미 CD4+ T 세포의 조기 분화에 접근

우리는 수용체 매개 장기 및 미세환경 특이적 림프구 위치를 연구하기 위해 트래픽 수용체의 레트로바이러스 전달과 경쟁적 귀환을 위한 개선된 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 면역 세포 이동 메커니즘에 대한 귀중한 통찰력을 제공하며 향후 기초 및 치료 연구에 잠재적으로 응용될 수 있습니다.

다양한 조직 미세환경에서 GPCR 매개 T 세포 국소화 연구를 위한 효율적인 레트로바이러스 형질도입 및 경쟁력 있는 호밍(Competitive Homing)

배우세요 비접착 효과 T 림프구가 종양 세포 단층 위로 이동하는 과정을 세포 침강 매니폴드와 형광 현미경을 사용하여 관찰하는 방법입니다. 이 기술은 면역 유전자 치료 연구에 활용됩니다.

레이디 얼 이동성 및 레트로 바이러스 복제 벡터 형질 도입, 비 접착 Alloresponsive T 림프구의 세포 독성 기능

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