레이디 얼 이동성 및 레트로 바이러스 복제 벡터 형질 도입, 비 접착 Alloresponsive T 림프구의 세포 독성 기능

다음 실험의 전반적인 목표는 부착성 종양 세포 단층 위로 비부착성 작동 T 림프구의 이동을 보여주는 것입니다. 이는 먼저 poly D lysine이 코팅된 Teflon 마스크 슬라이드의 웰에 부착성 종양 세포 단층을 형성함으로써 달성되며, 두 번째 단계로 세포 침강 매니폴드를 사용하여 형광 표지된 작동 T 림프구를 단층의 중앙으로 침강시킵니다. 다음으로, 광학 및 형광 현미경을 사용하여 단층 위로 비부착성 세포가 이동하는 모습을 시각화합니다.

결과는 부착성 종양 세포 단층과 공동 배양된 비부착성 T 림프구의 이동 및 작동 기능이 레트로바이러스 벡터로 형질전환된 후에도 유지됨을 보여줍니다. 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 부착성 종양 세포와의 공동 배양 상태에서 비부착성 작동 T 림프구의 방사형 이동을 측정할 수 있다는 점입니다. 이는 사이토신 데아미나제(cytosine deaminase)와 같은 프로드러그 활성제 유전자를 발현하도록 수정된 동종 세포독성 T 림프구가 뇌 종양 제거를 위한 다중 모드 접근 방식으로 테스트되고 있기 때문에, 원발성 또는 전이성 뇌종양 환자에게 광범위한 시사점을 갖습니다.

일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 종양 세포의 부착 특성이 성장 과정에서 이질적이기 때문에 부착성 종양 세포 단일층을 형성하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다. 균일한 종양 단일층을 생성하고 비부착성 L-O-C-T-L을 효과적으로 침전시키기 위해서는 두 세포 유형의 특성에 대한 숙련된 이해가 필요하므로, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 우선, 최대 4개의 멸균된.

멸균된 150 millimeter by 15 millimeter 페트리 접시에 10웰 테플론 코팅 슬라이드를 넣습니다. 습도를 유지하기 위해 2~3 milliliters의 멸균수를 담은 35 millimeter by 10 millimeter 페트리 접시를 슬라이드 옆에 배치합니다. 다음으로, 각 웰을 100 micrograms per milliliter 농도의 poly D lycine 또는 poly L lysine 용액으로 덮어 슬라이드를 사전 코팅합니다.

슬라이드를 실온에서 1시간 동안 배양한 다음, 용액을 흡입 제거하고 샘플 웰이 준비된 상태에서 PBS로 웰 표면을 2회 헹굽니다. 부착성 종양 세포가 가득 찬 플라스크를 수확합니다. 광학 현미경으로 생존 세포 수를 측정한 후, 세포를 5×10⁶ cells/mL 농도로 부유시킵니다.

완충 성장 배지 내에서 종양 세포 유형에 따라 각 웰에 5~10 µL의 세포 현탁액을 첨가하고, 배지를 사용하여 웰의 부피를 40 µL로 맞춘 후 피펫으로 천천히 섞어 세포를 균일하게 분산시킵니다. 웰에 세포를 분주한 후, 종양 세포가 가라앉을 수 있도록 상온에서 30분 동안 둡니다. 그런 다음 페트리 접시에 뚜껑을 닫고 37 °C, 5% CO2 조건의 습윤 배양기로 조심스럽게 옮겨 최소 24시간 동안 배양합니다.

단층 세포층에서 배지의 일부를 조심스럽게 제거하고, 더 많은 양의 신선한 완전 T세포 배지로 교체하여 웰의 배양 배지를 매일 변경하십시오. 세포들은 일반적으로 1~3일 이내에 합쳐지며, 이를 통해 종양 세포 단층 위로 침강시키기 위한 세포 준비가 완료됩니다. 비부착 T세포를 회수하고, 분석 시작 최소 1시간 전에 제조사의 프로토콜에 따라 세포 증식 염색약으로 라벨링하십시오.

다음으로 종양 세포 슬라이드가 들어 있는 습윤 챔버를 생물학적 안전 작업대에 놓습니다. 피펫팅을 통해 웰을 PBS로 세척한 후, 10% 혈청이 포함된 완전 배지 45 µL를 웰에 첨가합니다. 멸균된 세포 침강 매니폴드를 웰 위로 밀어 넣어 매니폴드 끝의 갈고리가 슬라이드 바닥에 닿게 합니다.

배지가 매니폴드 채널에 보이는지 확인하십시오. 그런 다음 부착되지 않은 세포 수를 측정하고, 배지 내 세포 농도가 1~2 × 10⁵ cells/µL가 되도록 현탁하십시오.

세포 침강을 방해할 수 있는 세포 응집물을 제거하기 위해 세포를 부드럽게 분산시킵니다. 세포 현탁액 1 µL를 각 웰의 매니폴드 채널로 천천히 피펫팅합니다. 그 후, 채널 내의 세포가 단층 위에 가라앉을 수 있도록 장치를 실온에서 20~30분 동안 배양합니다.

세포가 가라앉은 후, 슬라이드에 닿지 않게 매니폴드를 수직으로 천천히 들어 올립니다. 세포 펠렛이 매니폴드 채널의 둘레 내에 잘 안착되었는지 확인하십시오. 현미경으로 관찰했을 때, 안착된 세포들이 단일층에 살짝 부착되어 슬라이드를 가볍게 움직여도 펠렛이 흩어지지 않아야 합니다.

세포가 침전되었음을 확인한 후, 이산화탄소 및 습도 챔버가 장착된 도립 현미경으로 슬라이드를 옮깁니다. 4배 x 대물렌즈를 사용하여 세포의 명시야 및 다채널 형광 이미지를 촬영합니다. 특정 영역의 명시야 및 형광 채널 이미지를 획득한 다음, 이미지 캡처 소프트웨어를 사용하여 마이크론 바를 추가합니다.

모든 시점의 이미지를 획득한 후, 각 시점 사이에 슬라이드를 가습 인큐베이터에 보관하십시오. 이미지 파일들을 이미지 편집 프로그램으로 드래그 앤 드롭한 다음, 레이어 추가 옵션을 선택하여 다중 레이어 이미지 파일을 생성하십시오. 명시야 이미지와 형광 이미지를 하나의 레이어로 병합하십시오.

획득 소프트웨어를 사용하여 8 mm x 8 mm 영역의 이미지를 촬영합니다. 소프트웨어는 웰 전체에서 가장 잘 표현되는 채널을 사용하여 캡처된 이미지들을 자동으로 병합(stitch)하도록 설정해야 합니다. 형광 채널만 촬영하는 경우, 부착 세포를 촬영하는 채널을 선택해야 합니다.

또는 이미지 편집 소프트웨어를 사용하여 이미지를 스티칭할 수 있습니다. 이는 이미지 간에 공통으로 나타나는 영역을 정렬하고, 전체 이미지가 생성될 때까지 이미지들을 서로 겹쳐서 수행합니다. 이미지 소프트웨어를 사용하여 이미지들을 함께 스티칭하십시오.

Image J 소프트웨어를 사용하여 결합된 이미지로 표면 강도 형광 맵을 제작함으로써 T-세포의 응집 또는 시간에 따른 확산을 시각화합니다. 에메랄드 녹색 형광 단백질 발현 유전자를 인코딩하는 복제 가능 레트로바이러스 벡터로 형질전환된 인간 동종 반응 세포독성 T 림프구(Allo CTL)를 신경교종 세포 단일층의 중심에 배치했습니다. 4시간 후, 모든 Allo CTL은 24시간까지 가시적인 응집체를 형성했습니다.

부착 세포 단층에 빈 공간이 나타난 것은 종양 세포의 용해를 나타내며, 일부 동종 CTL이 선단 너머로 이동했음을 보여주었습니다. 형광 표지된 마우스 동종 CTL을 형광 표지된 신경교종 세포 단층의 중앙에 배치했습니다. 1시간 후, 동종 CTL은 신경교종 세포와 밀접하게 결합했으며, 48시간 후에는 동동 CTL이 단층의 중앙에서 멀리 이동했습니다. Image J 소프트웨어를 사용하여 이 이미지들로부터 형광 맵을 생성하였으며, 48시간 후 중앙에서 상당한 거리가 떨어진 곳으로 이동했음을 보여줍니다.

종양 세포 단층의 건강한 배양 조건을 유지하기 위해 배양액을 매일 교체하는 것이 중요합니다. 또한, 숙련된 경우 이 절차에 따른 비부착 세포의 침강은 약 20분 정도 소요됩니다. Allo CTL이 단층을 가로질러 이동하는 속도나 세포독성 기능을 수행하며 종양 세포와 접촉하는 시간에 관한 의문을 해결하기 위해 세포 경로 추적과 같은 다른 방법들을 사용할 수 있습니다.

본 프로토콜은 면역 유전자 치료 분야의 연구자들이 종양 세포와의 공동 배양 환경에서 유전자 변형 T 림프구의 이동을 탐구하는 데 도움을 줄 것입니다. 이 영상을 시청하고 나면, 공동 배양을 위한 비부착성 세포와 부착성 세포의 준비 방법 및 세포 침강 매니폴드를 사용하여 종양 세포 단일층 위에서 비부착성 세포의 수평 방사형 이동을 연구하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.