인간 백신 닭 계란에 인플루엔자 바이러스 전파

이 절차의 전반적인 목표는 비용 효율적인 시스템에서 고역가 인플루엔자 바이러스를 대량으로 생산하는 것입니다. 이것은 먼저 혈청 병원균이 없고 갓 수정된 닭고기 달걀을 얻음으로써 달성됩니다. 두 번째 단계에서 난자는 Alan Toic 뿌리를 통해 인플루엔자 바이러스에 감염됩니다.

그런 다음 48시간 동안 바이러스가 포함된 Alan Toic 액체를 채취하여 바이러스를 액체 질소로 스냅 냉동합니다. 궁극적으로 플라크 및 헤마글루티닌 분석을 수행하여 수집된 Alan Toic의 바이러스 역가의 영향을 결정할 수 있습니다. 이 방법의 유체 시각적 시연은 수확 단계가 매우 민감하고 알을 조심스럽게 다루고 해부학에 대한 충분한 지식이 필요하기 때문에 매우 중요합니다.

절차를 시작하기 전에 적절한 공급업체로부터 혈청 병원균이 없고 갓 수정된 다비안 난자를 얻었습니다. 도착하자마자 자동 계란 터너가 있는 가습 계란 부화기에 계란을 넣어 10-11일 동안 섭씨 37도, 습도 55-60%에서 정기적으로 계란을 회전시킵니다. 7-8일의 배양 후 70% 에탄올 소독 장갑을 착용합니다.

에탄올로 계란 캔들러를 닦고 인큐베이터의 계란을 빈 계란 상자로 옮깁니다. 그런 다음 불을 끄고 달걀의 큰 끝을 한 번에 하나씩 캔들러에 대고 잡습니다. 난자가 수정력이 있는 경우, 콩 모양의 배아로 이어지는 얇은 혈관이 명확하게 보여야 합니다.

난자가 수정되지 않은 경우 눈에 보이는 달걀 노른자가 있는 작은 혈액 반점이 관찰됩니다. 그런 다음 수정되지 않은 난자를 버리고 생존 가능한 난자를 인큐베이터에 다시 넣습니다. 난자의 상태를 확인할 수 없는 경우, 수정 후 10일 또는 11일째에 관찰할 수 있도록 표시하고, 사용 직전에 인플루엔자 A 바이러스 스톡을 히피가 보충된 멸균 PBS에 10배, 3배, 10배, 4밀리리터당 PFU로 희석한 후 얼음 위에 올려 놓습니다.

그런 다음 각 난자에 다시 촛불을 켜고 움직이지 않는 죽은 배아를 제거합니다. 다음으로 인큐베이터에서 알 3개를 꺼내 별도의 홀더에 정리합니다. 공기 자루가 위로 향하게 한 상태에서 알의 공간을 영구 마커로 표시하십시오.

그런 다음 영공 위 영역을 70% 에탄올로 세척하고 계란 영공을 BSL 2 생물 안전 후드 내의 계란 상자로 옮깁니다. 이제 멸균 18 게이지 바늘을 사용하여 각 달걀의 공기 주머니 위 껍질에 작은 구멍을 뚫습니다. 배아나 노른자를 찌르지 않도록 바늘을 너무 깊게 삽입하지 않도록 주의하십시오.

그런 다음 희석된 인플루엔자 바이러스를 멸균된 1밀리리터 주사기에 넣습니다. 22 게이지 바늘을 부착하고 바늘을 45도 각도로 조심스럽게 첫 번째 난자의 Alan Toic 구멍으로 밀어 넣습니다. 희석된 바이러스 0.2ml를 난자에 주입한 후 다른 2개의 난자를 주입한 후 주사기를 버리고 글루건의 접착제 한 방울로 각 구멍을 바늘로 밀봉합니다.

접착제를 관리하면 계란 내부에서 누출되지 않고 계란을 인큐베이터에 다시 넣으십시오. 모든 난자를 접종한 후 감염된 난자를 섭씨 37도, 습도 60%에서 뒤집지 않고 최적의 부화 시간을 위해 부화합니다. 인플루엔자 바이러스 유형에 따라 다릅니다.

잠복기가 끝나면 배아를 죽이고 혈관을 수축시키기 위해 섭씨 4도에서 최소 4시간 동안 난자를 식힙니다. 계란이 충분히 식었을 때. 생물 안전 후드와 단단한 홀더로 옮기고 70% 에탄올로 계란 표면을 청소하십시오.

그런 다음 멸균 가위를 사용하여 첫 번째 달걀의 공기 주머니 위의 달걀 껍질을 엽니다. 에어 자루 주변의 껍질을 제거합니다. chorio Alan Toic 멤브레인이 손상되지 않도록 주의합니다.

그런 다음 멸균 무딘 집게를 사용하여 chorio Alan Toic 막을 열고 난황이 파열되지 않도록 주의하면서 작은 주걱이나 숟가락으로 배아와 난황 자루를 부드럽게 옆으로 이동합니다. 다음으로, 1밀리리터 에이노르 피펫을 사용하여 Alan Toic 액체를 조심스럽게 수집하고 계란을 옆으로 기울여 필요한 만큼 가능한 한 많은 액체를 수집합니다. 각 난자는 각 난자를 수확할 때 5-10밀리리터의 약간 황색을 띤 액체를 생성해야 합니다.

Alan Toic 유체를 50ml 플라스틱 원뿔형 튜브에 얼음 위에 모읍니다. 모든 액체가 수집되면 바이러스를 회전시키고 투명한 액체를 얼음 위의 새 50ml 튜브로 옮깁니다. 마지막으로 BSL 두 개의 폐기물 용기에 계란을 버리고 즉시 Eloqua를 정화한 LAN 토익 플루이드에 넣습니다.

그런 다음 스냅하고 액체 질소에 바이러스를 얼린 다음 얼린 줄기를 섭씨 80도의 냉동고에 넣습니다. 장기 보관을 위해 인플루엔자 바이러스 감염은 세포의 단층에 형성되는 엮인 세포 또는 플라크의 원형 영역을 초래하는 세포 병성 효과를 일으킵니다. 본 실험에서는 세포를 크리스탈바이올렛(crystal violet)으로 염색하여 플라크를 시각화하고, 500마이크로리터의 바이러스 스톡을 세포에 배양하여 바이러스의 10배에서 마이너스 12로 희석한 웰에서 65개의 플라크를 계수하였다.

이 실험에서 최종 역가는 밀리리터당 14번째 PFU의 1.3 곱하기 10이었습니다. Hemagglutinin nation assay는 바이러스가 적혈구 표면에 부착하는 능력에 따라 인플루엔자 바이러스를 적정하는 방법입니다. 관찰된 바와 같이, 바이러스 현탁액은 적혈구를 응집시켜 적혈구가 현탁액에서 벗어나는 것을 방지합니다.

50마이크로리터에서 바이러스의 희석이 2에서 영하 10도까지 명백히 음성인 결과가 관찰되었습니다. 따라서 최종 역가는 2.1 곱하기 10의 밀리리터당 네 번째 HAU입니다. 이 비디오를 시청한 후에는 닭고기 달걀을 접종하고 바이러스가 포함된 대서양 액체를 수확하여 인플루엔자 바이러스를 전파하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.