Name: 녹화 패치 클램프 기술을 사용하여 어두운 적응 마우스 망막 슬라이스 준비에 신경 세포의 시냅스 응답 빛-유발 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: 배우세요 어두운 적응 마우스 망막 슬라이스에서 패치 클램프 기술을 이용한 빛-유발 시냅스 응답 기록 방법을. 이 기술은 신경 세포의 형태학적 식별과 고감도 전기생리학 기록을 가능하게 합니다.

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이 작업은 NIH R01 EY020533, WSU 스타트업 펀드 및 RPB 보조금의 지원을 받았습니다.

윤리 문 : 동물 과목을 포함하는 절차는 웨인 주립 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다. 실험 솔루션 1. 준비 <ol><li> 실제 실험 전에 해부 솔루션을 일일 1 주를 준비합니다. 때문에 낮은 온도 (16)에서 강력한 완충 능력 망막 박리에 대한 HEPES 완충 용액을 사용합니다. (mm 단위)으로는 다음과 모든 화학 물질을 혼합 : 115의 NaCl, 2.5의 KCl, 2.5 CaCl2를, 1.0의 MgCl 2, 10 HEPES, 28 포도당을. NaOH로 pH 7.4까지를 조정합니다. 일주에 냉장고까지의 솔루션을 유지합니다. </li><li> 기록 액 망막 17 제제 용으로 설계된 인공 뇌척수액 (ACSF)이다 에임스 &#39;매체이다. 실험의 날에 의해, 튜브에 복귀 돌연변이 분말 (500 ml의 용액 4.4 g)을 달아. 또한,의 NaHCO3 (500 ml의 솔루션을위한 0.95 g)을 달아 및 혼합MES &#39;분말. </li><li> 실험의 날에 의해 패치 클램프 레코딩을위한 세포 내 피펫 솔루션을 준비합니다. (mm 단위)으로는 다음과 모든 화학 물질을 혼합 : 111 K 글루코 네이트, 1.0 CaCl2를, 10 HEPES, 1.1 EGTA, 10의 NaCl, 1.0의 MgCl 2, 5 ATP-㎎, 1.0 GTP - 나. KOH으로 pH를 7.2로 조정합니다. 기존의 주사​​기 필터 피펫 솔루션을 필터링합니다. ~ 500 μL 씩을 확인하고 냉장고 나 냉동고에 보관합니다. </li></ol> 실험의 날 2. 준비 <ol><li> O / N 어두운 적응 어두운 공간에서 - (남, 8 주 오래 된 4, C57BL / 6J 또는 유사한 배경) 밤은 실험 전에, 새장에 마우스를 놓습니다. </li><li> 해부를위한 준비 : <ol><li> 적어도 10 분 동안 산소, 유리 비커에 - (200 ml의 100) 얼음에 배치, 거품 솔루션을 해부 입력합니다. </li><li> 망막 준비 저장 어둠 상자의 산소를 시작합니다. </li><li> 재에 대한 그리스 레일 플라스틱 커버 슬립을 준비tinal 슬라이스 제제는 35mm 플라스틱 접시에 이들 각각을 놓고. </li><li> 헬기 (조직 슬라이서)에 새로운 면도날을 연결합니다. </li><li> 두 반으로 여과막을 잘라. 이것은 망막 슬라이스입니다. </li><li> 해부 현미경 근처 해부 도구 및 전송 피펫을 맞 춥니 다. 각 도구를 쉽게 어두운 액세스 할 수 있도록 작업 영역은 잘 조직되어야한다. </li></ol></li><li> 패치 클램프 레코딩을위한 준비 : <ol><li> 에임스 &#39;가루와 증류수의 NaHCO3 (에임스 4.4 g 및 NaHCO3을 0.95g / 500㎖의 DDH 2 O)를 용해. 혼합 산소 버블 에임스 중형 (95 % O 2 및 5 % CO 2) 적어도 30 분 동안 기록 온도 레벨로 가열 (~ 35 ° C). 아직 버블 링 동안의 NaHCO3와 7.4 pH를 조정합니다. </li><li> 해부하는 동안 내부 피펫 솔루션을 녹여. 해동 후 세포 내 염색 0.01 %의 sulforhodamine의 B를 추가합니다. </li></ol></li></ol> 3. 망막 해부 <ol><li> 어두운 방에서, 이산화탄소를 이용하여 양측 기흉 마우스를 안락사. 2 - 후 이산화탄소를 사용하여 3 분간, 마우스가 의식을 잃게 될 것이다. </li><li> 마우스가 더 이상 꼬리 핀치에 응답 할 때, 신속하게 눈을 명백히하다 없으며 플라스틱 접시에 차가운 해부 솔루션에 배치합니다. 동물의 죽음을 확인하기 위해 양측 기흉을 수행합니다. 빨리 어둠 상자에 접시에 눈을 저장합니다. 어둠의 절차를 수행하기 위해 적외선 뷰어를 사용합니다. 참고 : 또는 이소 플루 란, 참수, 또는 자궁 경부 전위는 안락사에 사용할 수 있습니다. 안락사의 방법은 국립 보건 연구소 (NIH) 및 / 또는 기관 동물 관리 및 사용위원회의 지침을 따라야합니다. </li><li> 어두운 방에서, 해부 현미경 및 적외선 조명을 조정합니다. 현미경, 10cm 플라스틱 접시 w로 그 접시에서 눈을 전송냉각 해부 솔루션 i 번째. 지속적으로 튜브를 통해 거품 산소는 플라스틱 접시의 바닥에 배치. 너무 부족하지 않도록 유량을 조절하지만 절개를 방해 충분하지 있는지 확인합니다. </li><li> 각막과 렌즈 제거 : <ol><li> 마이크로 수술 칼 각막의 상단에 절개를합니다. 안구의 다른 쪽 끝에서 시신경을 잡고 이동하는 현상을 방지 할 수 있습니다. 수술 가위를 사용하여 절단을 확장합니다. 주위 몇 공막과 각막을 잘라. </li><li> 미세 집게로 렌즈를 잡고 천천히 렌즈를 빼냅니다. 유리체가 렌즈를 분리하기에 너무 끈적 경우 가위로 절단 유리체. </li><li> 눈 컵이 이루어지면, 부드럽게 작은 전송 피펫과 아이 컵에 차가운, 산소 해부 솔루션을 붓는다. 참고 : 절개가 각막을 한 후 안구가 빠르게 움 추러 들게합니다. 그것은이 프로시 변형 눈으로 눈의 형상을 유지하는 것이 중요시저는 망막이 손상되어 망막 박리의 원인이됩니다. </li></ol></li><li> 망막의 지느러미와 복부 측면을 확인 : 참고 : 녹색 및 자외선 (UV)의 불균일 한 분포가 특정 망막 영역을 식별, 18 콘 때문에 빛 응답 레코딩을위한 중요합니다. <ol><li> 시신경 유두 근처에 전달하는 망막 아이 컵을 가로 질러가는 라인을 확인합니다. 이 라인은 주로 시신경의 복부 측면을 가로 질러 통과; 다른 19 복부 동안 시신경 포함 측은 등쪽이다. 적외선 뷰어에서 명확 랜드 마크를 참조하십시오. </li><li> 실험의 목적에 따라, 불필요한 측을 잘라. 이것은 아이 컵으로부터 망막을 분리 후 유용 할 것이다. </li></ol></li><li> 유리체 제거 : <ol><li> 선택적으로, 15 분 동안 히알루로니다 제 (0.5 ㎎ / ㎖)와 눈 컵을 배양한다. </li><li> 여분의 미세 집게로 유리체를 제거합니다. 유리체는 주로바닥과 눈 컵의 바깥 쪽 가장자리에 연결합니다. 조심스럽게 만지거나 망막을 파고하지 않고 제거합니다. 유리체가 단단히 아이 컵에 부착 할 수 있듯이, 눈 컵에서 망막 박리를 방지하기 위해 조심스럽게 제거합니다. 더 긴장 느낌되지 않을 때까지 당겨 계속합니다. 주 :이 단계는 마우스를 해부 망막 특히 중요하다; 그러나, 이러한 쥐 또는 도마뱀 같은 다른 종의 망막에 대한 문제가 아니다. </li></ol></li><li> 눈 컵에서 망막을 분리합니다. 공막을 잡고 부드럽게 집게의 뒷면을 사용하여 망막을 벗겨. 참고 : 망막 준비를 전체 마운트는 분리 된 망막에서 할 수있다. 가장자리에서 3-4 컷을 확인하고 망막을 평평하게, 또는 여러 조각으로 망막을 잘라. </li><li> 망막 트림 및 망막의 불필요한 절반을 버리고 (단계 3.5). 같은 플라스틱 접시에 두 조각으로 남아있는 망막을 잘라. 망막의 각 부분의 경우, 수 있도록 가장자리를 잘라망막 슬래브 및 접는 자리를 떼어. </li><li> 큰 전송 피펫 (~ 2 ㎖)를 사용하여 유리 접시에 망막 슬래브를 전송합니다. 작은 피펫으로 용액을 과량 빨아 슬래브를 평탄화 여과지를 사용하고 빠르게 조직 위에 여과막의 조각을 배치. <ol><li> 작은 전송 피펫을 사용하여 필터 멤브레인 솔루션을 해부 한 방울을 배치합니다. 이 솔루션은 막 퍼져 때까지 ~ 15 초를 기다립니다. 이 시간 동안, 망막 조직 여과막 고집한다. </li><li> 아래의 필터 주위에 더 차가운 해부 솔루션을 붓는다. 여과막과 망막 조직이 뜬다. 집게로 필터 멤브레인을 잡고 슬라이스 챔버에 배치합니다. 조직을 통해 솔루션을 해부 붓고, 어두운 상자에 준비를 저장합니다. 참고 : 여기에 설명 된 절차는 매우 중요하다. 그것은 보장하기 위해 신속하게 다음 단계를 수행하는 것이 중요하다 필터 (MEM)에 망막 조직 스틱파괴 현상과 건조하지 않습니다. </li></ol></li><li> 헬기를 사용하여 조각으로 망막 조직을 잘라. 약 200 μm의 두께는 패치 클램프 연구 가능하다. </li><li> 슬라이스 챔버 그리스 레일 플라스틱 커버 슬립을 놓습니다. 플라스틱 커버 슬립에 그리스 레일 위에 망막 슬라이스를 전송합니다. 횡단면 볼 수 있도록 슬라이스를 90 ° 회전합니다. 다음, 커버 슬립에 내려 여과막을 눌러 그리스 여과지의 측면을 커버. <ol><li> 슬라이스가 플라스틱 커버 슬립 상에 고정화 된 후, 커버 슬립을 잡아 35mm 플라스틱 접시에 옮긴다. 망막 준비 위에 차가운 해부 솔루션을 붓고 준비 잠수함. 지속적으로 산소해야 어두운 상자에 각각의 접시를 저장합니다. 주 : 전체 절차는 여과막이 변형되지 않도록 조심스럽게 수행되어야한다. 그렇지 않으면, 슬라이스 망막 용이 여과막으로부터 분리한다. </li></ol></li></ol><ol><li> 준비 기록 : <ol><li> 에임스 &#39;매체와 총리는 관류 튜브. 튜브를 채울 때 모든 거품이 통과하도록 허용합니다. </li><li> 풀러와 패치 클램프 녹음 피펫을 확인합니다. 피펫 팁이 채워 때까지 1 분 동안 피펫의 뒷면에있는 피펫 솔루션, 딥 피펫을 작성합니다. 다음에, 마이크로 피펫을 이용하여 필러의 피펫 ~ 1 / 3의 채우기. 촉촉한 피펫 상자에 각각의 펫을 저장합니다. </li><li> 패치 클램프 녹음을위한 장비를 켜십시오; 컴퓨터, 앰프, CCD 카메라와 현미경을 포함. </li></ol></li><li> 실내 조명을 차단합니다. 적외선 뷰어를 사용하여 현미경 스테이지 챔버 상 망막 슬라이스 준비를 놓습니다. 이 고정화 된 후, 연속 관류를 시작한다. 33-37 ° C에서 재관류 온도를 설정합니다. </li><li> CCD 카메라로 슬라이스 표면을 볼 수 있습니다. 대상 위치에 초점 위치를 목표 CELL 유형이 존재합니다. 패치 클램프 녹음을위한 건강한 보이는 셀 선택 (즉, 그것의 자연스러운 표면과 좋은 세포 모양이 있어야합니다). </li><li> 피펫 홀더에 기록 피펫을 놓습니다. 슬라이스 준비에 피펫을 사전. 그것이 슬라이스 제제 (~ 2mm 위)에 가까운 경우에는, 현미경 피펫 팁을 찾기. 피펫 팁은 현미경으로 볼되면, 타겟 셀을 향해 끝이 아래로 이동. </li><li> 앰프를 설정합니다. (제로) 0 MV / 0 펜실베니아 피펫을 조정하고 10 Hz에서 ~에 ~ 5 MV의 연속 전기 펄스를 시작합니다. 피펫 저항을 확인; 이상적인 저항은 대부분의 망막 신경 세포에 대한 5 ~ 10 MΩ입니다. </li><li> 끝에서 불고 시작합니다. 마우스 피스를 사용하거나 피펫은 목욕 솔루션으로 떨어지면 긍정적 인 압력을 적용, 주사기를 사용합니다. 끝이 표적 세포의 표면에있는 동안 연속으로 내부 솔루션을 날려. <ol><li> 양압 차에 작은 딤플을하면전자의 세포 표면, 약간의 팁을 발전 불고 중지합니다. 증가 할 전망 피펫 저항을 확인합니다. 그림 계속 증가하면두고 그것을&gt; 1 GΩ (기가 시일)에 도달 할 때까지 저항을 모니터링한다. 저항이 자발적으로 증가하지 않는 경우가 될 때까지 기가 시일 부드럽게 부압을 적용한다. </li></ol></li><li> 기가 시일이 달성 된 후, MV를 -70 잡고 잠재력을 변경합니다. 그런 다음, 간헐적으로 피펫 팁 내부의 막을 파열 부정적인 압력을 적용합니다. 전체 셀 구성이 이루어지면, 피펫 저항이 500 MΩ 1 GΩ 및 용량 성 전류가 볼 사이 일 수있다. 때로는 자발적인 시냅스 후 전류를 관찰 할 수있다. </li><li> -80에서 +40 MV에 IV 관계를 기록한다. 전압 게이트 된 채널의 종류는 세포 종류에 따라 활성화된다. </li><li> 기록 시냅스 전류 또는 전압을 빛-유발. </li></ol>

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좋은 녹음은 좋은 망막 준비와 잘 설계된 패치 클램프 설정을 통해서만 달성할 수 있습니다. 위에서 설명한 모든 단계가 중요하지만 이 토론에서는 해부와 녹음 모두에 대한 몇 가지 중요한 단계를 강조합니다. 
해부의 경우 냉각과 산소 공급이라는 두 가지가 특히 중요합니다. 눈을 적출한 후 산소 기포가 있고 냉각된 해부액이 있는 해부실에서 눈의 앞부분을 빠르게 제거하고 차가운 용액을 아이컵에 붓습니다. 망막 조직이 해부실에 있을 때 10분마다 차가운 용액을 조직에 부어야 합니다. 조직은 해부 중에 망막 조직을 당기거나 찌르지 않고 신속하게 절단해야 하므로 구조가 쉽게 손상될 수 있습니다. 좋은 해부 도구(날카로운 집게와 가위)를 사용하는 것도 중요합니다. 헬기는 빠른 조종이 가능하기 때문에 진동술만큼 효과적입니다. 조직을 절단할 때 잔여 유리체가 망막 구조를 손상시키기 때문에 가능한 한 효율적으로 유리체를 제거하려면 극세 겸자를 사용해야 합니다.
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망막은 신경계의 독특한 부분 중 하나입니다. 뇌의 접근 가능한 부분으로서, 시냅스 구조는 잘 특성화되어 있습니다. 또한 이 신경망의 기능은 생리학적 자극인 빛으로 검사할 수 있습니다. 망막 조직이 적절한 절차를 거쳐 어두운 방에서 격리되면 조직의 뉴런이 빛에 반응합니다. 이 제제는 시각 신호 처리를 연구하고 다양한 시냅스 메커니즘과 신경망 기능, 질병 메커니즘을 밝히는 데 사용되었습니다. 
망막 뉴런의 광 반응은 수십 년 동안 기록되어 왔습니다. 초기 연구에서는 날카로운 전극을 사용하여 머드퍼피 망막 뉴런의 세포 내 기록을 만들었습니다1. 1980년대에는 패치 클램프 기법이 발명되었고2 곧 시각 연구자들 사이에서 인기 있는 방법이 되었습니다3,4. 머드퍼피(mudpuppy)와 물고기 망막 뉴런(fish retinal neuron)을 포함한 하등 척추동물의 단세포 기록은 시각 신호 처리 메커니즘의 해명에 기여한 인기 있는 방법이었다5,6. 
유전적 돌연변이 기술이 개발된 후, 쥐의 망막은 시력 연구자들에게 더 인기 있는 모델이 되었습니다7-9. 포유류의 망막은 인간의 망막에 진화적으로 더 가깝기 때문에 하등 척추 동물보다 더 매력적이며, 질병 모델을 사용할 수 있는 기회가 있습니다. 그러나 쥐의 망막 세포는 작고 연약하기 때문에10 어두운 방에서 망막 준비를 하고 패치 클램프 기록을 수행하는 것은 어려운 일입니다. 기술이 향상됨에 따라 영상 연구11 및 망막전위도(ERG)12와 같은 시각 신호 메커니즘을 연구하기 위한 다양한 접근 방식을 사용할 수 있게 되었습니다. 그럼에도 불구하고 패치 클램프 방법을 사용한 단일 세포 기록은 다른 방법에 비해 시간적으로나 공간적으로 매우 민감하기 때문에 여전히 중요합니다. 따라서 우리는 지속적으로 패치 클램프 기록을 수행하고 마우스 망막 절편 제제13-15에서 시각적 신호 처리를 조사하는 방법을 개선했습니다.
이 비디오 자습서에서는 프로토콜에 중요한 팁이 제공됩니다. 좋은 녹음은 잘 준비해야만 얻을 수 있습니다. 동물 해부를 연습하고 견고한 패치 클램프 리그를 구축하면 대부분의 연구자가 성공적인 기록을 달성할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>생쥐 (28-60 일, 수컷)</td><td>잭슨 연구소</td><td>C57BL/6J 균주</td><td></td></tr><tr><td>에임스 '중간 분말</td><td>시그마</td><td>A1420</td><td>우수한</td></tr><tr><td>실체 현미경</td><td>니콘</td><td>SMZ745</td><td>우수한</td></tr><tr><td>해부 도구 : 겸자</td><td>Dumont</td> <td># 4, # 5, # 55</td><td>우수한</td></tr><tr><td>해부 도구 : 가위</td><td>Roboz</td><td>RS-5605</td><td></td></tr><tr><td>해부 도구 : 수술 칼</td><td>Surgistar</td><td>7514</td><td>우수한</td></tr><tr><td>면도날 (헬기 용)</td><td>EMS</td><td>71970</td><td>우수한</td></tr><tr><td>헬기</td><td>핸드메이드</td><td></td><td></td></tr><tr><td>적외선 뷰어</td><td>Night Owl Optics</td><td>NOBG1</td><td>밝은 시야를 보여줍니다. 작은 물체의 초점을 맞추는 것이 문제입니다.</td></tr><tr><td>Puller</td><td>Sutter</td><td>P-1000 (풀러 셔터 P-1000</td>)<td>은 우수하며 일관된 크기의 피펫을 만듭니다.</td></tr><tr><td>다크 박스</td><td>펠리칸</td><td>다크 박스</td><td>우수한</td></tr><tr><td>패치 클램프 시스템</td><td>Scientifica</td><td>슬라이스 스코프 2000</td><td>우수한 설정. 대부분의 주요 구성 요소가 하나의 패키지에 포함되어 있습니다. 미세 조작기는 훌륭합니다.</td></tr><tr><td>증폭기</td><td>분자 장치</td><td>multiclamp 700B</td><td>우수하고 쉬운 제어.</td></tr><tr><td>소프트웨어</td><td>Molecular Devices</td><td>pClamp 소프트웨어</td> 획득 <td>우수하고 쉬운 제어.</td></tr><tr><td>광원 (LED)</td> <td>쿨 LED</td><td>pE-2 4 채널 시스템</td><td>우수한</td></tr><tr><td>CCD 카메라</td><td>Q-이미징</td><td>Retiga 2000</td><td>우수한</td></tr><tr><td>패러데이 케이지</td><td>수제</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

녹화 패치 클램프 기술을 사용하여 어두운 적응 마우스 망막 슬라이스 준비에 신경 세포의 시냅스 응답 빛-유발

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

망막은 시각 체계의 관문이다. 영상 신호 처리 메커니즘을 이해하기 위해 망막 신경 네트워크 기능을 조사. 네트워크의 망막 신경 세포는 다양한 아형 포함한다. 양극성 세포, 신경절 세포 및 무 축삭 세포의 10 개 이상의 아형은 형태 학적 연구에 의해 확인되었다. 망막 뉴런의 여러 아형 모션 및 컬러 같은 시각적 신호의 뚜렷한 기능을 인코딩 및 다중 신경 경로를 형성하는 것으로 생각된다. 그러나, 영상 신호 처리의 각 신경 세포의 기능적 역할은 완전히 이해되지 않습니다. 패치 클램프 방법이 근본적인 문제를 해결하는 데 유용합니다. 여기에, 프로토콜을 제공한다 어두운 적응 조건에서 패치 클램프 녹음을 사용하여 마우스 망막 신경 세포에서 빛 유발 시냅스 응답을 기록합니다. 마우스 눈 O / N 암순응이며, 망막 슬라이스 제제는 적외선 조명을 이용하여 시청자 암실에서 해부. 적외선하지 않습니다마우스의 광 수용체를 활성화하고, 따라서 그들의 빛 응답 성을 유지합니다. 패치 클램프 망막 뉴런의 광 유발 된 응답을 기록하는데 사용된다. 형광 염료는 신경 학적 아형의 특성을 기록하는 동안 분사된다. 이 절차는 마우스 망막에 각각의 신경 세포의 생리 학적 기능을 결정하기 위해 우리가 할 수 있습니다.

대표적인 제제는 슬라이스 슬라이스 제제 평면에서 신경절 세포를 나타내는 감광체, 직선 위치에있다.도 1에 도시하지 않고, 여과지로부터 박리된다. 슬라이스가 기울어 진 경우, 제제의 일부만 어려운 패치 클램프 적절한 셀을 식별 할 수있는 초점이다. 레코딩을위한, 일반적으로 빛나는 표면을 갖는 좋은 소마, 심지어 둥근 형상 및 가시적 어두운 플라크를 선택하는 것이 중요하다. 전체 셀 구성이 이루어진 후, 슬라이스는 스텝 - 광 (도 2) 다음에 배경 광에 노출시켰다. 빛 유발 흥분성 시냅스 후 전위 (L-EPSPS)는 (타이밍이 노란색으로 표시된다) 단계 빛에 반응 유발했다. 피크 진폭과 세포 유형 및 하위 유형에 따라 변할 감쇠 시간. 신경절 세포는 밝은 자극 (그림 2 D &amp; E)에 대한 응답으로 활동 전위를 생성합니다. CELL 형과 형태 학적 아형 생리 학적 기록 (오른쪽 그림 2) 후 sulfo...

우리는 쥐의 눈에서 망막 절편을 준비하고 망막 뉴런의 빛 반응을 기록하는 방법을 보여줄 것입니다. 전체 절차는 어두운 환경에서 수행됩니다.

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

이 실험의 전반적인 목적은 암적응된 망막 뉴런으로부터 광응답 기록을 얻는 것입니다. 이를 위해 먼저 마우스의 눈을 적출합니다. 두 번째 단계는 망막을 분리하고 슬라이스 표본 제작을 위해 절단하는 것입니다.다음으로, 패치 클램프 기록을 위한 대상 세포를 찾기 위해 망막 표본을 현미경에 장착하여 관찰합니다. 홀셀 패치 클램프(whole cell patch clamp) 구성을 설정한 후, 세포 주변에 빛 자극을 줍니다. 마지막으로, 데이터 수집 소프트웨어를 통해 전기생리학적 반응을 동시에 관찰할 수 있습니다.KRC 이미징과 같은 기존 방법 대비 이 기술의 주요 장점은 기록 감도가 높고, 기록 중인 세포를 형태학적으로 식별할 수 있다는 점입니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 사용자는 완전한 암흑 속에서 작업하는 것이 익숙하지 않아 어려움을 겪거나 방향 감각을 잃을 수 있습니다. 준비를 시작하려면, 해부 현미경 근처에 해부 도구와 전송 피펫을 배치하십시오.어둠 속에서도 각 도구에 쉽게 접근할 수 있도록 작업 공간을 잘 정리합니다. 준비가 되면 적외선 뷰어를 사용하여 암실에서 절차를 진행하십시오. 안락사 후 빠르게 안구를 적출하여 현미경 아래 암상자 안에 보관된 차가운 해부 용액이 담긴 접시에 넣습니다.안구를 차가운 해부 용액이 담긴 접시에 옮깁니다. 산소를 지속적으로 버블링합니다. 각막과 수정체를 제거하기 위해, 안구 반대편 끝의 시신경을 잡아 움직이지 않게 고정한 뒤 미세수술용 칼로 각막 상단을 절개합니다.외과용 가위로 절개 부위를 확장하고 각막을 제거하되, 각막 주변에 공막이 일부 남도록 합니다. 다음으로 미세 포셉을 사용하여 수정체를 잡고 천천히 끌어냅니다. 안구 컵이 형성되면 소형 전송 피펫을 사용하여 차가운 산소 공급 해부액을 안구 컵에 조심스럽게 붓습니다.망막의 형태를 유지하기 위해 신속하게 작업하고, 가벼운 압력을 가해 망막의 등쪽(dorsal)과 배쪽(ventral) 면을 식별합니다. 적외선 뷰어를 사용하여 시신경 유두 근처를 지나 망막 아이컵(retinal eye cup)을 가로지르는 선을 확인합니다. 이 선은 주로 시신경의 배쪽 면을 가로지르며, 시신경을 포함한 해당 측면이 등쪽 면입니다.실험에 따라 복측 또는 배측 중 한 곳에 절개선을 만듭니다. 이는 불필요한 쪽을 표시하는 것이며, 이후 과정에서 유용한 표식이 됩니다. 다음으로, 망막에 닿지 않도록 주의하며 초미세 핀셋을 사용하여 유리체를 조심스럽게 제거합니다.유리체는 주로 안구 컵의 바닥과 바깥쪽 가장자리에 부착되어 있습니다. 유리체가 안구 컵에 단단히 부착되어 있을 수 있으므로, 망막 박리를 제거할 때 조심스럽게 진행하십시오. 텐션이 느껴지지 않을 때까지 계속 당깁니다.망막을 분리한 후, 공막을 잡고 망막을 조심스럽게 벗겨냅니다. 핀셋의 뒷부분을 사용하여 망막을 다듬고, 불필요한 절반은 동일한 플라스틱 디쉬에 버립니다. 남은 망막을 두 조각으로 자릅니다.가장자리를 잘라 망막 슬랩을 만들고 접힌 가장자리를 다듬습니다. 다음으로, 대형 전송 피펫을 사용하여 망막 슬랩을 유리 플레이트로 옮깁니다. 소형 피펫으로 과잉 용액을 흡입하고 거름종이 한 조각을 사용하여 슬랩을 평평하게 폅니다.소형 전송 피펫을 사용하여 필터 막 조각을 조직 위에 조심스럽게 놓습니다. 필터 막 위에 해부 용액 한 방울을 떨어뜨립니다. 용액이 퍼지면서 망막 조직이 필터 막에 부착될 때까지 약 15초 동안 기다립니다.서로 달라붙은 후, 막이 뜰 때까지 필터 아래와 주변에 차가운 해부 용액을 더 붓습니다. 다음으로, 필터 막을 슬라이싱 챔버에 넣고 해부 용액으로 덮습니다. 막이 마르지 않도록 빠르게 작업하며, 초퍼를 사용하여 망막 조직을 절편으로 자릅니다.그리스 레일이 있는 플라스틱 커버슬립을 슬라이싱 챔버에 넣습니다. 망막 절편을 그리스 레일 위에 옮기고, 횡단면이 보이도록 절편을 90도 회전시킵니다. 필터 페이퍼의 측면을 그리스로 덮기 전에 필터 막을 커버슬립 위로 눌러 고정합니다.플라스틱 커버 슬립에 고정된 절편을 33 mm 플라스틱 디쉬로 옮깁니다. 준비물을 콜(coal) 해부 용액에 담그고, 산소가 지속적으로 공급되는 암박스에 각 디쉬를 보관합니다. 이는 패치 클램프 기록을 위한 것입니다.profusion 튜브를 aims 배지로 프라이밍하고 튜브 내의 모든 기포를 제거하십시오. 유리 풀러(glass puller)로 기록용 피펫을 제작한 후, 피펫 팁을 피펫 용액으로 역충전하십시오. 다음으로, 마이크로 피펫 필러를 사용하여 피펫의 약 3분의 1을 채운 뒤, 채워진 각 피펫을 습식 피펫 보관함에 보관하십시오.다음으로, 컴퓨터, 앰프, CCD 카메라 및 암실 조건에서 작동하는 현미경을 포함한 패치 클램프 기록 장비를 켭니다. 적외선 뷰어를 사용하여 망막 절편 표본을 현미경 스테이지 위에 놓습니다. 표본이 고정되면 지속적인 관류를 시작합니다.관류 온도를 33에서 37°C로 설정하십시오. CCD 카메라로 슬라이스 표면을 관찰하십시오. 표적 위치에 초점을 맞추십시오.표적 세포 유형이 위치한 곳에서 패치 클램프 기록을 위해 건강해 보이는 세포를 선택합니다. 건강한 세포가 확인되면, 기록용 피펫을 피펫 홀더에 장착하고 슬라이스 표본 쪽으로 피펫을 전진시킵니다. 피펫이 슬라이스 표본에 가까워지면, 현미경으로 피펫의 팁을 찾습니다.현미경 하에서 피펫 팁이 보이면, 팁을 대상 세포 쪽으로 내립니다. 다음으로, 증폭기를 설정하고 피펫을 pika amp에서 조정합니다. Nana amp당 5V로 설정하십시오.약 5 mV의 전압과 약 10 Hz의 주파수로 연속 전기 펄스를 가하고 피펫 저항을 확인합니다. 대부분의 망막 뉴런의 경우, 이상적인 저항 범위는 5~12 MΩ 사이입니다.준비가 되면, 마우스피스나 주사기를 사용하여 피펫 팁이 표적 세포 표면에 닿을 때까지 내부 용액을 불어냅니다. 양압으로 인해 세포 표면에 작은 홈이 생기면, 팁을 약간 더 전진시킨 후 불어내는 것을 멈춥니다. 피펫 저항이 지속적으로 증가한다면 그대로 두고, 저항이 1 GΩ 이상에 도달할 때까지 모니터링하십시오.저항이 자연적으로 증가하지 않는 경우, 기가실(giga seal)이 형성될 때까지 부드럽게 음압을 가하십시오. 기가실이 형성되면 유지 전위를 -70 mV로 변경한 다음, 간헐적으로 음압을 가하여 피펫 팁 내부의 막을 파열시키십시오. 전체 세포(whole cell) 구성이 완료되면 피펫 저항은 500 MΩ에서 1 GΩ 사이가 되며, 정전 용량 전류(capacitive current)를 관찰할 수 있습니다.-80에서 40 mV까지의 IV 관계를 기록하십시오. 세포 유형에 따라 서로 다른 종류의 전압 개폐 채널이 활성화될 것입니다. 마지막으로, 빛에 의해 유도된 시냅스 전류 또는 전압을 기록하십시오.10배 배율로 관찰한 이 절편 표본은 광학 필터 페이퍼로부터 박리되지 않은 상태로 광수용체와 신경절 세포가 모두 나타납니다. 이 표본을 60배 대물렌즈로 관찰하면 각 세포층이 명확하게 보입니다. 단계적 빛 자극에 반응하여 망막 뉴런으로부터 빛 유발 흥분성 postsynaptic potential이 유도되었습니다.피크 진폭과 감쇄 시간은 세포의 유형 및 하위 유형에 따라 다릅니다. 세포 유형과 그 형태학적 하위 유형은 생리학적 기록 및 발달 이후 황(sulfur) 표지를 통해 확인되었습니다. 이 기술은 망막 연구 분야의 과학자들이 자연적인 시각 신호 전달의 기능뿐만 아니라 시냅스 메커니즘의 기여도를 연구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

recording-light-evoked-postsynaptic-responses-neurons-dark-adapted

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 동영상은 수생 호랑이 도롱뇽의 망막 통에 전체 셀 전압 클램프 레코딩 과정을 보여줍니다. 우리는뿐만 아니라 망막의 시각적인 자극하는 동안 패치 클램프 레코딩을 수행하는 방법으로 슬라이스의 준비를 보여줍니다.

라이트의 전체 세포 레코딩은 망막 통에 흥분성의 시냅틱 전류를 Evoked

여기 electrophysiological 레코딩을위한 마우스 망막의 어두운 적응 조각을 생성하는 절차를 설명합니다.

어두운 적응 슬라이스 준비에 마우스 망막 뉴런에서 패치 클램프 레코딩

이 문서는 해부하다와 마우스에서 분리된 망막 준비에서 기록하는 방법에 대한 설명을 제공합니다. 특히, 우리는 찬란 표시 신경절 세포 인구의 빛을 반응을 기록하고 이후 식별하고 그 형태를 분석하는 방법에 대해 설명합니다.

유전적으로 망막 신경절 라벨 셀에서 라이트 응답을 기록하기 위해 절연 망막 준비

우리는 그대로 마우스 망막에서 막대와 원뿔 photoresponses를위한 transretinal electroretinogram (에르그) 레코딩 비교적 간단한 방법을 설명합니다. 이 방법은 자신의 가벼운 반응을 분리하고 분리된 평면 마운트 망막에 걸쳐 배치 필드 전극을 사용하여 그들을 기록하는 photoreceptors에서 시냅스 전송 블록의 활용합니다.

마우스 망막에서 Transretinal 에르그 레코딩 :로드 및 원뿔 Photoresponses

이 비디오는 플랫 마운트 마우스 망막에서 전기 생리학적 기록을 위한 전체 세포 패치 클램프 기술을 보여줍니다. 전극이 있는 얇은 유리 피펫을 사용하여 망막 내의 별방울 무축삭 세포(SAC)에 접근합니다. 씰을 형성한 후 흡입이 가해져 멤브레인을 파열하고 전체 세포 패치 클램프 구성을 형성합니다. 마지막으로, SAC 시냅스 수용체를 통한 이온의 흐름은 구성을 사용하여 측정됩니다.

Establishing a Whole-Cell Patch Clamp for Electrophysiological Recording from a Flat-Mount Mouse Retina

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Photostimulation and Whole-Cell Patch Clamp Recordings of Neurons in Mouse Hippocampal Slices

이 비디오는 어둡게 적응된 마우스 망막 조직 절편 제제에서 빛을 유발하는 시냅스 후 반응을 기록하는 것을 보여줍니다. 망막 절편은 기록 챔버에 배치되고, 기록 피펫은 망막 신경절 세포와의 전기적 연속성을 확립하는 데 사용됩니다. 광 펄스(light pulses)는 신경절 세포(ganglion cell)에서 흥분성 시냅스후 전위(excitatory post-synaptic potentials)를 생성하기 위해 적용되며, 이는 피펫에 의해 기록됩니다.

마우스 망막 절편의 뉴런에서 빛을 유발한 시냅스후 반응(Light-Evoked Postsynaptic Responses in Neurons of Mouse Retinal Slices)

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이 프로토콜은 평면 장착 준비에서 망막 신경 세포에 전체 셀 패치 클램프 녹음을 수행하는 방법을 보여줍니다.

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이 종이 전체 셀 패치 클램프 기록 Xenopus laevis tadpoles의 retinotectal 회로 공부 하는 데 사용 하는 세 뇌 준비를 다루겠습니다. 그것의 자신의 특정 이점 각 준비 신경 회로 기능을 공부 하는 모델로 Xenopus 올챙이의 실험 추적성에 기여 한다.

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배우세요 어두운 적응 마우스 망막 슬라이스에서 패치 클램프 기술을 이용한 빛-유발 시냅스 응답 기록 방법을. 이 기술은 신경 세포의 형태학적 식별과 고감도 전기생리학 기록을 가능하게 합니다.

녹화 패치 클램프 기술을 사용하여 어두운 적응 마우스 망막 슬라이스 준비에 신경 세포의 시냅스 응답 빛-유발

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