녹화 패치 클램프 기술을 사용하여 어두운 적응 마우스 망막 슬라이스 준비에 신경 세포의 시냅스 응답 빛-유발

이 실험의 전반적인 목표는 어둡게 적응된 망막 뉴런에서 광 반응 기록을 얻는 것입니다. 이것은 먼저 쥐의 눈을 채취하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 망막을 분리하고 슬라이스 준비를 위해 절단하는 것입니다.

다음으로, 망막 제제를 장착하고 현미경에서 관찰하여 패치 클램프 기록을 위한 표적 세포를 찾습니다. 전체 세포 패치 클램프 구성을 설정한 후 세포 부근에 광 자극이 가해집니다. 마지막으로, 수집 소프트웨어를 통해 동시 전기 생리학적 반응을 관찰할 수 있습니다.

KRC 이미징과 같은 기존 방법의 이 기술의 주요 장점은 기록 감도가 높고 기록 세포를 형태학적으로 식별할 수 있다는 것입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 완전한 어둠 속에서 작업하는 것이 어렵고 익숙하지 않은 사람들에게는 방향 감각을 잃을 수 있기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 범위를 시작하려면 해부 도구와 전사 피펫을 해부 현미경 근처로 이동합니다.

작업 영역은 어둠 속에서도 각 도구에 쉽게 접근할 수 있도록 잘 구성되어 있습니다. 준비가 되면 적외선 뷰어를 사용하여 어둠 속에서 절차를 수행합니다. 안락사 후 신속하게 눈에 핵을 주입하고 차가운 해부 용액이 담긴 접시에 담아 어두운 상자에 넣어 현미경으로 작업합니다.

시원한 해부 용액으로 접시에 눈을 옮깁니다. 지속적으로 산소로 거품을 일으킵니다. 각막과 수정체를 제거하려면 안구의 다른 쪽 끝에 있는 시신경을 잡고 움직이지 않도록 하고 미세 수술용 칼로 각막 위쪽을 절개합니다.

수술용 가위를 사용하여 절개 부위를 연장하고 각막을 제거하여 주변에 공막을 남겨둡니다. 그런 다음 가는 집게로 렌즈를 잡고 천천히 당겨 빼냅니다. 아이컵이 만들어지면 작은 전사 피펫으로 차가운 산소 해부 용액을 아이컵에 부드럽게 붓습니다.

망막의 모양을 유지하기 위해 빠르게 작업하고 부드러운 압력을 사용하여 망막의 등쪽과 복부를 식별합니다. 적외선 뷰어를 사용하여 망막 안구컵을 가로질러 시신경두 근처를 통과하는 선을 식별합니다. 이 선은 주로 시신경의 복부 쪽을 가로지르며 시신경을 포함한 쪽은 등쪽 쪽입니다.

실험에 따라 복부 또는 등쪽 쪽을 자릅니다. 이것은 불필요한 면을 표시하고 앞으로 나아가는 데 유용한 마커입니다. 그런 다음 망막을 건드리지 않고 매우 미세한 집게로 유리체를 부드럽게 제거합니다.

유리체는 주로 아이컵의 바닥과 바깥쪽 가장자리에 부착됩니다. 유리체가 안구컵에 단단히 부착될 수 있으므로 망막 박리를 부드럽게 제거합니다. 장력이 느껴지지 않을 때까지 계속 당깁니다.

망막이 분리되면 공막을 잡고 망막을 부드럽게 떼어냅니다. 집게 뒷면을 사용하여 망막을 다듬고 불필요한 반쪽을 같은 플라스틱 접시에 버립니다. 나머지 망막을 각 조각마다 두 조각으로 자릅니다.

가장자리를 잘라 망막 슬래브를 만들고 접히는 가장자리를 다듬습니다. 다음으로, 대형 전사 피펫을 사용하여 망막 슬래브를 유리판에 옮깁니다. 작은 피펫으로 여분의 용액을 빨아들이고 여과지 조각을 사용하여 슬래브를 평평하게 만듭니다.

작은 전사 피펫을 사용하여 필터 멤브레인 조각을 조직 위에 부드럽게 놓습니다. 필터 멤브레인에 박부 용액 한 방울을 떨어뜨립니다. 용액이 퍼지고 망막 조직이 필터 멤브레인에 달라붙는 동안 약 15초 동안 기다립니다.

서로 붙으면 멤브레인이 뜨게 될 때까지 필터 아래와 주위에 더 많은 차가운 해부 용액을 붓습니다. 다음으로, 필터 멤브레인을 슬라이싱 챔버에 놓고 해부 용액으로 덮습니다. 멤브레인이 건조되지 않도록 신속하게 작업하고 헬리콥터를 사용하여 망막 조직을 조각으로 자릅니다.

그리스 레일이 있는 플라스틱 덮개 슬립을 슬라이싱 챔버에 넣습니다. 그리스 레일 위에 망막 슬라이스를 옮기고 가로 부분이 보이도록 슬라이스를 90도 회전합니다. 필터 용지의 측면을 그리스로 덮기 전에 필터 멤브레인을 커버 슬립 위로 누르십시오.

플라스틱 덮개 슬립에 조각을 고정한 후 33mm 플라스틱 접시에 옮깁니다. 준비물을 석탄 해부 용액에 담그고 각 접시를 지속적으로 산소가 공급되는 어두운 상자에 보관하십시오. 패치 클램프 녹음용.

profusion 튜브를 목표 매체로 프라이밍하고 모든 거품이 튜브에서 통과하도록 합니다. 유리 극성으로 피펫을 기록한 후 피펫 용액으로 팁을 다시 채웁니다. 다음으로, 마이크로 피펫 필러를 사용하여 피펫의 약 1/3을 채우고 각 피펫을 촉촉한 피펫 상자에 보관하십시오.

다음으로, 어두운 조건에서 작동하는 컴퓨터 증폭기, CCD 카메라 및 현미경을 포함하여 패치 플랜트 기록 장비를 켭니다. 적외선 뷰어의 도움으로 망막 절편 준비물을 현미경 스테이지에 놓습니다. 고정한 후 지속적인 관류를 시작하십시오.

관류 온도를 섭씨 33도에서 37도로 설정합니다. CCD 카메라로 슬라이스 표면을 봅니다. 대상 위치에 초점을 맞춥니다.

타겟 세포 유형이 있는 상태에서 패치 클랫 기록을 위해 건강해 보이는 세포를 선택합니다. 건강한 세포가 확인되면 기록 피펫을 피펫 홀더에 넣고 피펫을 절편 준비로 진행합니다. 슬라이스 준비에 가까우면 현미경으로 피펫의 끝을 찾으십시오.

현미경에서 피펫 팁이 보이면 팁을 타겟 세포 쪽으로 아래로 이동합니다. 다음으로, 앰프를 설정하고 피카 앰프에서 피펫을 조정합니다. Nana 암페어당 5볼트.

약 5mV 및 약 10Hz의 연속 전기 펄스를 시작하고 피펫 저항을 확인합니다. 이상적인 저항은 5에서 12메가옴 사이입니다. 대부분의 망막 뉴런에 사용됩니다.

준비가 되면 마우스피스 또는 주사기를 사용하여 피펫 끝이 표적 세포의 표면에 닿을 때까지 내부 용액을 불어냅니다. 양압으로 인해 세포 표면에 작은 딤플이 생기면 팁을 약간 앞으로 밀고 분출을 멈춥니다. 피펫 저항이 지속적으로 증가하는 경우 그대로 두고 1기가옴 이상에 도달할 때까지 저항을 모니터링하십시오.

저항이 저절로 증가하지 않으면 기가 씰이 될 때까지 음압을 부드럽게 가하십시오. 기가 씰이 달성된 후 유지 전위를 음의 70m볼트로 변경한 다음 간헐적으로 음압을 가하여 피펫 팁 내부의 멤브레인을 파열합니다. 전체 셀 구성이 이루어질 때 피펫 저항은 500메가옴에서 1기가옴 사이가 될 수 있으며 용량성 전류를 관찰할 수 있습니다.

IV 관계를 음의 80밀리볼트에서 40밀리볼트까지 기록합니다. 셀 유형에 따라 다양한 유형의 전압 게이트 채널이 활성화됩니다. 마지막으로, 시냅스 전류 또는 전압을 유발하는 빛을 기록합니다.

10x에서 본 이 절편 준비는 광수용체와 신경절 세포를 모두 여과지에서 분리되지 않은 상태로 보여줍니다. 이 제제를 60 x 대물렌즈로 보면 각 세포층이 명확하게 관찰됩니다. 망막 뉴런에서 유발된 흥분성 시냅스후 전위(postsynaptic potentials)를 불러일으킨 빛은 계단식 빛에 대한 반응으로 유발되었습니다.

피크 진폭과 감쇠 시간은 세포 유형과 하위 유형에 따라 다릅니다. 세포 유형과 그 형태학적 아형은 발달 후 생리학적 기록 후 황 표지에 의해 밝혀졌습니다. 이 기술은 망막 연구 분야의 과학자들이 자연적인 시각 신호의 기능과 시냅스 메커니즘의 기여를 연구할 수 있는 길을 열었습니다.