Name: 청각 통로의 Optogenetic 자극에 대한 쥐의 등쪽 달팽이 핵의 직접 시각화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: 배우세요 쥐의 등쪽 달팽이 핵(DCN)에 대한 후두개 접근법을 통한 optogenetic 자극 기술을. 이 수술적 방법은 중추 청각계의 바이러스 매개 유전자 전달 및 신경생리학 실험을 가능하게 합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

자금 조달 :이 작품은 재단 Bertarelli 보조금 (DJL), MED-EL 부여 (DJL), 보건 보조금 DC01089의 국립 연구소 (MCB)에 의해 지원되었다.

참고 : 모든 실험 절차는 보건 서비스 동물 애호 관리에 대한 정책 및 실험 동물의 사용을 포함하여 국가 동물 관리 지침을 따르 매사추세츠 눈의 동물 관리 및 사용위원회와 귀 의무실과 하버드 의과 대학,에 따라 수행된다 ILAR 가이드 및 동물 복지 법. 실험 절차는 왼쪽 DCN의 세부 노출 아래에 나열된. 생존 수술을 수행하는 동안 멸균 악기를 사용합니다. 1 차 개두술 등쪽 달팽이 핵 노출 <ol><li> 마취 <ol><li> 복강 내 투여를 통해 자일 라진 (xylazine) 20 ㎎ / ㎏과 케타민 100 ㎎ / ㎏ 18-24 g의 무게 8~12주, 세 마우스를, 마취. 모니터링 심박수, 호흡 수,뿐만 아니라 발가락 핀치 철수 반사에 의한 적절한 마취를 확인합니다. 눈에 장소 수의사 연고 마취 동안 건조를 방지합니다. 일단 적절하게 마취, 면도 머리 위에 놓인 t그는 수술 부위에 접근이 수월를 제공하기 위해 두피. </li></ol></li><li> 외과 위치 <ol><li> 주둥이 클램프로 고정 작은 동물 정위 홀더에 안전하게 마우스를 놓습니다. </li><li> 주둥이 클램프가 완전히 마우스의 머리를 고정하는 적절한 호흡하지만 꽉 충분히 허용 할 정도로 느슨한 있는지 확인하십시오. 마우스 머리가 느슨한 경우, 동물 절차의 개두술 부분에서 헤드 홀더에서 떨어질 가능성이있다. </li><li> 심장 박동 모니터링 할 수 표준 방식에서 청성 뇌간 이​​식 전극을 배치합니다. 호흡 비율은 시각화하여 모니터링해야합니다. 정상적인 심장 박동과 호흡이 마우스의 연령에 따라 달라질 수 있습니다. </li><li> homeothermic 가열 담요에 배치를 통해 온도계는 배치되고 euthermia이 보장된다. </li></ol></li><li> 피부 절개하고 두개골의 interparietal과 뒤통수 뼈의 노출 <ol><li> microsc에서OPE, 피부를 통해 수직 절개가 직접 날개 사이의 중간 선에서 시작하고, 후두부의 꼬리 부분까지 연장합니다. 정중선 피부 절개를 따라 횡 방향으로 피부를 변위. 두개골의 왼쪽 후방 측면을 덮고있는 근육을 시각화. </li><li> 메스 홍채 가위와 각각의 뼈에 근육 첨부 파일의 이단에 의해 근육 왼쪽 정수리, interparietal 위에 놓인, 두개골의 후두 뼈를 제거합니다. 컷 근육의 가장자리를 따라 출혈의 작은 정도를 관찰한다. 10 ~ 15 초 동안 면봉으로 부드럽게 압력이 최소화. </li></ol></li><li> 개두술을 덮는 인공 와우 핵 <ol><li> 시상 및 람다 봉합 라인 (그림 1, 왼쪽 패널)을 포함하여 관련 봉합 라인을 확인합니다. </li><li> rongeurs를 사용하여 람다 봉합 라인에 중간 선 왼쪽 interparietal 뼈를 통해 개두술, ~ 2mm의 꼬리를합니다. 이 지역은 DCN 위에 놓인다. </li><li> 따라와g의 개두술은 소뇌 위에 놓여 두라의 얇은 층을 관찰합니다. 메스 블레이드를 사용하여 경질을 제거합니다. (그림 1, 가운데 패널). 참고 : 경질의 제거는 약간의 출혈이 발생할 수 있습니다. 경질을 제거 메스 블레이드를 사용하는이 프로세스는 뇌간 표면 및 DCN 모호한 식별 할 풀, 소뇌 흡입 동안 혈액 손실의 양을 감소시키기위한 것이다. 마우스의 총 혈액량은 15 %보다&gt; ~ 1.5 ml를 초과하지 않아야합니다. 출혈이 금액을 초과하면, 마우스는 유체 보충과 함께 제공되어야한다. </li><li> 면 팁 어플리케이터 소뇌를 오버레이 응고 된 혈액을 제거합니다. 선택적으로, 부드럽게 혈액을 혈액을 멀리 취소 소뇌에 치과 지점을 사용하여 식염수 물방울. </li></ol></li><li> 소뇌 포부 <ol><li> DCN이 힘을 될 때까지 5 프랑스어 흡입을 사용하면, DCN 위에 놓인 왼쪽 소뇌의 측면 - 대부분의 부분을 대기음연간 (그림 1, 오른쪽 패널). 왼쪽 소뇌의 약 1/4 ~ 1/3를 제거합니다. DCN에 인접한 주요 랜드 마크는 우수한 반규관의 팽대부입니다. 참고 : 소뇌의 포부는 프로토콜의 핵심 단계이다. 이 출혈의 원인이됩니다이 같은 흡입의 다중 패스와 함께 하나의 시도에서 발생하지 않을 경우 소뇌의 감독 흡입은 가장 성공적으로 수행된다. 흡입을 돕기 위해, 소뇌의 표면에 약간 원위 것이다 CN의 예상 깊이 현미경의 초점면을 설정한다. CN에 초점면을 설정하면 시각화를 개선하고 선명한 이미지를 보장합니다. </li><li> DCN에 따라 흡입, 더 출혈, 뇌척수액 (CSF) 빌드 업, 그리고 소뇌 변위가 예상된다. 혈액 응고를 방지하기 위해 신속 개두술에 멸균 생리 식염수를 주입 시키 0.5 CC. 치과 점과 흡입과 부드러운 dabbing의 조합은 할 수있다DCN의 직접 시각화를위한 경로를 멀리 취소하는 데 사용됩니다. 직접 DCN의 표면에 접촉하지 마십시오. </li></ol></li></ol> 바이러스 매개 유전자 전달 및 외과 복구를위한 2. 압력 미세 주입 <ol><li> DCN은 상부의 혈액과 뇌척수액의 무료이며 명확하게 볼 수 있습니다 후 2 분 동안 10 μL 해밀턴 주사기를 사용하여 DCN에 압력 microinjections을합니다. </li><li> 팁은 더 이상 DCN의 표면 아래에 보일 때까지 미세 조작기로 바늘을 도입하지 않는다. </li><li> 최적의 성능을 위해, 외상을 최소화하고 얇은 DCN 내 주입 볼륨을, 지역화, 45 °로, 얕은 경사와 등을 33 또는 34 게이지 바늘 (34 게이지 바늘 기밀 주사기를 사용)을 사용하는 얕은 뇌간 구조 (&lt;300 μm의 두께). 참고 : 다른 미세 주입 장비가 활용 기초 할 수있다. 이상적으로, 주사 기기는 약간의 벤 있도록 유연해야D는 경우 직접 D​​CN을 대상으로 할 필요가 있었다. 마우스 인해 호흡에 절차 전반에 걸쳐 약간 이동하면서 또한, 악기는 운동의 소량을 견딜 수 있도록 충분히 견고해야한다. </li></ol> 3. 수술 복구 <ol><li> 주사 직후 피부를 다시 근사 및 마우스 표준 복구 절차 당 복구 할 수있다. 남은 소뇌와 흉터 조직은 소뇌의 흡인에 의한 공동으로 채울 것입니다. 충분한 의식이 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 회복 될 때까지 지속적으로 동물을 모니터링 할 수 있습니다. 심박수, 호흡 수,뿐만 아니라 공급하는 능력을 모니터한다. 참고 : 완전히 회복 될 때까지 아니 동물 수술을 한 다른 동물 케이지에 반환됩니다. </li><li> 마우스는 수술 후 원에서 도보로 시작하는 경우가 가능성이 힘든 시간 공급을하는 것처럼 (&lt;사례 5 %), 피부 절개의 폐쇄 후 일반적으로 2-4 시간은, 바로, 마우스를 희생. 티그의 부작용으로 인해 소뇌 흡인하기 쉽다. 동물은 수술 후 통증에 대해 모니터링되어야하고, 적절한 마약 제도적 표준을 기반으로 동물의 편안함을 보장하기 위해 부여해야합니다. 항생제는 필요 감염의 경우 증거 할 수 있습니다. </li></ol> 4. 차 개두술 달팽이 핵 노출 <ol><li> 치유와 바이러스 매개 유전자 전달 배양 2-4 주 후, 이전에 주입 마우스 단계를 반복 1.1-1.5 최적의 배양 시간이 전송 유전자의 종류에 따라 다릅니다 다시 마취. </li><li> 핀셋, 메스 및 rongeurs의 조합에 의해 개두술 사이트를 통해 흉터 조직을 제거합니다. </li><li> 개두술을 시각화 한 후, DCN을 덮는 소뇌 및 흉터 조직을 나머지의 조합을 식별한다. 위에있는 소뇌 / (이전 소뇌의 열망과 유사) 흉터 조직을 흡인하기 위해 5 프랑스어 흡입을 사용합니다. </li><li> 흡인 후, 추가 출혈, 뇌척수액 B 기대uild 업 및 소뇌의 나머지 비트. 빠르게 혈액 응고를 방지하기 위해 식염수에 개두술을 소개한다. DCN의 직접 시각화에 대한 경로를 취소 부드러운 치과 점 dabbing 및 흡입의 조합을 사용합니다. </li><li> DCN의 표면을 관찰한다. DCN 이제 액세스 가능한 optogenetics 기반 생리학 실험을 수행합니다. optogenetics 기반 실험을 구동하기 위해, 광섬유 (도 2)와, 예를 들면 광 자극을 소개. </li></ol> 5. 조직학 <ol><li> 실험의 결론에 따라, 마취제의 과다 복용으로 마우스를 안락사. 4 % 파라 포름 알데히드이어서 생리 식염수로 마우스를 관류. </li><li> 2 시간의 두개골 및 사후 수정에서 뇌간의 압축을 풉니 다. 24 ~ 48 시간 동안 30 % 자당의 뇌간을 Cryoprotect. 제 60 ㎛의 섹션을 사용하여 표준 저온 유지 장치를 이용 뇌간. </li></ol>

<ol><li>Lalwani, A., Mhatre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Ear+Hear%22%5BJournal%5D)">Cochlear gene therapy.</a> Ear Hear. 24 (4), 342-348 (2003).</li>
<li>Lalwani, A., Jero, J., Mhatre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+issues+in+cochlear+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Audiol+Neurootol%22%5BJournal%5D)">Current issues in cochlear gene transfer.</a> Audiol Neurootol. 7 (3), 146-151 (2002).</li>
<li>Jero, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+gene+delivery+through+an+intact+round+window+membrane+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Cochlear gene delivery through an intact round window membrane in mouse.</a> Hum Gene Ther. 12 (5), 539-548 (2001).</li>
<li>Koh, S., Pettis, R., Mhatre, A., Lalwani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+microinjection+and+its+effects+upon+auditory+function+in+the+guinea+pig%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Arch+Otorhinolaryngol%22%5BJournal%5D)">Cochlear microinjection and its effects upon auditory function in the guinea pig.</a> Eur Arch Otorhinolaryngol. 257 (9), 469-472 (2000).</li>
<li>Lalwani, A., Walsh, B., Reilly, P., Muzyczka, N., Mhatre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+in+vivo+gene+therapy+for+hearing+disorders%3A+introduction+of+adeno-associated+virus+into+the+cochlea+of+the+guinea+pig%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Development of in vivo gene therapy for hearing disorders: introduction of adeno-associated virus into the cochlea of the guinea pig.</a> Gene Ther. 3 (7), 588-592 (1996).</li>
<li>Wareing, M., Lalwani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+gene+therapy%3A+current+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Pediatr+Otorhinolaryngol%22%5BJournal%5D)">Cochlear gene therapy: current perspectives.</a> Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 5 Suppl 1. (49), 27-30 (1999).</li>
<li>Han, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgene+expression+in+the+guinea+pig+cochlea+mediated+by+a+lentivirus-derived+gene+transfer+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Transgene expression in the guinea pig cochlea mediated by a lentivirus-derived gene transfer vector.</a> Hum Gene Ther. 10 (11), 1867-1873 (1999).</li>
<li>Akil, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+hearing+in+the+VGLUT3+knockout+mouse+using+virally+mediated+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy.</a> Neuron. 75 (2), 283-293 (2012).</li>
<li>Hernandez, V. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+stimulation+of+the+auditory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Optogenetic stimulation of the auditory pathway.</a> J Clin Invest. 124 (3), 1114-1129 (2014).</li>
<li>Adamantidis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+interrogation+of+dopaminergic+modulation+of+the+multiple+phases+of+reward-seeking+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optogenetic interrogation of dopaminergic modulation of the multiple phases of reward-seeking behavior.</a> J Neurosci. 30 (31), 10829-10835 (2011).</li>
<li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+mimicry+of+the+transient+activation+of+dopamine+neurons+by+natural+reward+is+sufficient+for+operant+reinforcement%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Optogenetic mimicry of the transient activation of dopamine neurons by natural reward is sufficient for operant reinforcement.</a> PloS One. 7 (4), e33612(2012).</li>
<li>Britt, J., Bonci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+interrogations+of+the+neural+circuits+underlying+addiction%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Optogenetic interrogations of the neural circuits underlying addiction.</a> Curr Opin Neurobiol. 23 (4), 539-545 (2013).</li>
<li>Abbott, S., Coates, M., Stornetta, R., Guyenet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+stimulation+of+c1+and+retrotrapezoid+nucleus+neurons+causes+sleep+state-dependent+cardiorespiratory+stimulation+and+arousal+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Optogenetic stimulation of c1 and retrotrapezoid nucleus neurons causes sleep state-dependent cardiorespiratory stimulation and arousal in rats.</a> Hypertension. 61 (4), 835-841 (2013).</li>
<li>Carter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+arousal+with+optogenetic+modulation+of+locus+coeruleus+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Tuning arousal with optogenetic modulation of locus coeruleus neurons.</a> Nat Neurosci. 13 (12), 1526-1533 (2010).</li>
<li>Darrow, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+central+auditory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Assoc.+Res.+Otolaryngol.+Abstr%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of central auditory neurons.</a> Assoc. Res. Otolaryngol. Abstr. (695), (2012).</li>
<li>Shimano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+AAV-mediated+expression+of+channelrhodopsin-2+and+halorhodopsin+in+brainstem+neurons+mediating+auditory+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Assessment of the AAV-mediated expression of channelrhodopsin-2 and halorhodopsin in brainstem neurons mediating auditory signaling.</a> Brain Res. 1511, 138-152 (2013).</li>
<li>Doucet, J., Ryugo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+from+the+ventral+cochlear+nucleus+to+the+dorsal+cochlear+nucleus+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Projections from the ventral cochlear nucleus to the dorsal cochlear nucleus in rats.</a> J Comp Neurol. 385, 245-264 (1997).</li>
<li>Brown, M., Drottar, M., Benson, T., Darrow, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commissural+axons+of+the+mouse+cochlear+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Commissural axons of the mouse cochlear nucleus.</a> J Comp Neurol. 521, 1683-1696 (2013).</li>
<li>Verma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auditory+responses+to+electric+and+infrared+neural+stimulation+of+the+rat+cochlear+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Auditory responses to electric and infrared neural stimulation of the rat cochlear nucleus.</a> Hear Res. 310, 69-75 (2014).</li>
<li>Taberner, A. M., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+properties+of+single+auditory+nerve+fibers+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Response properties of single auditory nerve fibers in the mouse.</a> J Neurophysiol. 93 (1), 557-569 (2005).</li>
<li>Rolls, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+disruption+of+sleep+continuity+impairs+memory+consolidation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Optogenetic disruption of sleep continuity impairs memory consolidation.</a> Proc Natl Acad Sci. 108 (32), 13305-13310 (2011).</li>
<li>Huff, M., Miller, R., Deisseroth, K., Moorman, D., LaLumiere, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttraining+optogenetic+manipulations+of+basolateral+amygdala+activity+modulate+consolidation+of+inhibitory+avoidance+memory+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Posttraining optogenetic manipulations of basolateral amygdala activity modulate consolidation of inhibitory avoidance memory in rats.</a> Proc Natl Acad Sci. 110 (9), 3597-3602 (2013).</li>
<li>Stortkuhl, K., Fiala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Smell+of+Blue+Light%3A+A+New+Approach+toward+Understanding+an+Olfactory+Neuronal+Network%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Smell of Blue Light: A New Approach toward Understanding an Olfactory Neuronal Network.</a> Front Neurosci. 5 (72), (2011).</li>
<li>Hira, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+optogenetic+stimulation+for+functional+mapping+of+the+motor+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Transcranial optogenetic stimulation for functional mapping of the motor cortex.</a> J Neurosci Methods. 179 (2), 258-263 (2009).</li>
<li>Ayling, O., Harrison, T., Boyd, J., Foroshkov, A., Murphy, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+light-based+mapping+of+motor+cortex+by+photoactivation+of+channelrhodopsin-2+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated light-based mapping of motor cortex by photoactivation of channelrhodopsin-2 transgenic mice.</a> Nat Methods. 6 (3), 219-224 (2009).</li>
<li>Boyden, E., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale%2C+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat. Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li>
</ol>

저자가 공개하는 게 없다.

이 논문은 중앙 청각 시스템의 조작 생쥐 모델에서 DCN의 직접 시각화 기술을 설명합니다. 직접 시각화의 설명 방식은 정위 적 방법을 주요 대안에 비해 상당한 장점을 제공합니다. 정위 방법은 직접 시각화 여유가없는 반면, 주로, DCN의 직접 시각화, 뇌간의 사이트를 즉시 확인 할 수 있습니다. 바이러스 - 매개 유전자 전달의 경우에서와 같이, 인큐베이션 기간을 필요로 장기간 실험에서, 주입 대상 위치를 &quot;그리워&quot;저 IF 감염 효율에 대한 가능성이있다. 또한, 직접적인 시각화 방법은 다양한 동물 연령 주입을 허용한다. 유사한 접근 방식은 수술 래트 및 모르모트 등의 다른 동물 모델과 생존 실험에 사용될 수있다. 이 프로토콜에 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 우선,마우스가 정위 홀더에 제대로 위치해야합니다. 머리의 움직임은 어려움 개두술을 발생합니다. 둘째, 개두술의 위치는 매우 중요하다. 개두술이 적절한 위치에 만든되지 않으면 불가능하지 않을 경우, 소뇌의...

난청을 역전시키기 위한 바이러스 매개 유전자 전달은 주로 말초 청각 시스템에 집중되어 있습니다. 1 달팽이관을 표적으로 삼아 연구자들은 삼투압 미니 펌프 주입2, 벡터-전이 유전자 복합체에 적신 젤폼®2 또는 젤라틴 스폰지3, 직접 마이크로 주입4을 포함한 다양한 전달 경로를 조사했습니다. 아데노 관련 바이러스 벡터5,6, 렌티바이러스 벡터7 및 양이온 리포좀을 포함한 수많은 유전자 전달벡터; 및 표적 조직2를 넘어서는 유전자 전달 벡터의 보급. 가장 최근에는 수포성 글루타메이트 수송체-3의 소실로 인한 생쥐의 난청을 치료하기 위해 달팽이관에 아데노 관련 바이러스(AAV)-1이 도입되었습니다. 8 또한, 말초 청각 시스템에서의 광유전학의 적용이 최근에 설명되었습니다. 9 개
그러나 중추 청각 시스템으로의 유전자 전달을 조사한 연구는 거의 없습니다. 뇌간의 등쪽 달팽이관 핵(DCN)에는 청각 경로의 2차 뉴런이 포함되어 있습니다. 달팽이관 핵(CN)의 유전자 전달 기술은 다양한 조사에 활용될 수 있지만, 빛에 민감한 단백질인 옵신(opsin)의 DCN으로의 유전자 전달은 광유전학 기반 실험 기술을 가능하게 하는 데 활용될 수도 있습니다. 채널로돕신-2(ChR2)와 같은 옵신의 바이러스 매개 유전자 전달 전달 후 DCN의 뉴런은 빛 자극에 민감해집니다. 광유전학적 유전자 전달은 이전에 쥐 레트로사다리꼴 핵(rat retrotrapezoid nucleus), 마우스 좌위 세포핵(mouse locus coeruleus), 원숭이 상구(monkey superior colliculus) 및 마우스 복부 피개(mouse ventral tegmental area)를 포함한 여러 뇌간 영역에서 시도되었습니다. 재질 보기 10-14일
최근 조사관들은 DCN에서 광유전학의 사용을 조사했습니다. 15,16 DCN은 인간의 청각 뇌간 임플란트가 배치되는 위치로, 청각 신경 보철물에 대한 중개 연구를 위해 연구하기에 청각 시스템의 매력적인 부분입니다. 그러나 DCN의 위치를 감안할 때 수술 노출은 쉽지 않습니다. 본 명세서에 기술된 기술은 쥐 모델에서 바이러스 벡터 유전자 전달 및 광유전학 기반 실험을 가능하게 하기 위해 후방 포사(posterior fossa) 접근법을 통해 DCN을 최대한 노출시키기 위한 프로토콜을 제공한다. 이전 연구에서는 채널로돕신-2와 함께 DCN에 정위 미세주입을 사용했습니다. 16 그러나 입위 주사는 특히 DCN과 같이 뇌간을 따라 작고 깊은 핵에서 직접 시각화에 의한 주사보다 잠재적으로 덜 정확합니다. CN에서 조직 특이적 단백질을 발현하는 형질전환 마우스도 매력적인 옵션이며 유전자 전달의 필요성을 없애줍니다. DCN 노출에 대한 당사의 프로토콜은 DCN이 광학 자극을 위해 직접 노출되어야 하기 때문에 형질전환 마우스에서도 작동합니다. DCN의 외과적 노출을 위한 이 기술은 마우스와 랫트 모델의 청각 신경 및 달팽이관 핵의 녹음을 포함하는 이전 프로토콜에서 채택되었습니다. 15,17-20호
프로토콜의 전반적인 목표는 유전자 전달 기술을 허용하기 위해 CN에 직접 노출을 제공하는 것입니다. 보다 구체적으로 말하면, 이 접근법은 급성 및 생존 수술 모두와 호환되며 후속 신경 생리학적 검사를 위해 동일한 동물에서 준비를 반복할 수 있습니다. DCN 프로토콜의 직접 노출은 뇌간의 다른 핵에서 광유전학 및 바이러스 매개 유전자 전달 기반 실험에 영향을 미칩니다.

<table><tbody><tr><td>입체 택시 홀더</td><td>스톨팅</td><td>51500</td><td></td></tr><tr><td>동종 담요</td><td>하버드</td><td>507214</td><td></td></tr><tr><td>메스 블레이드 # 11</td><td>미세 수술 도구</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>아이리스 가위</td><td>미세 수술 도구</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>5 프랑스어 흡입</td><td>대칭 외과 2777914</td><td></td><td></td></tr><tr><td>치과 포인트</td><td>헨리 Schein</td><td>100-8170</td><td></td></tr><tr><td>Bone rongeur</td><td>Fine Surgical Tools</td><td>16020-14</td><td></td></tr><tr><td>10 &마이크로; l 해밀턴 주사기</td><td>해밀턴&nbsp;</td><td>7633-01</td><td></td></tr><tr><td>34 게이지, 바늘</td><td>해밀턴&nbsp;</td><td></td><td></td>207434</tr><tr><td>Rongeurs</td><td>미세 수술 도구</td><td>16021-14</td><td></td></tr></tbody></table>

청각 통로의 optogenetic 자극에 대한 쥐의 등쪽 달팽이 핵의 직접 시각화

Direct Visualization of the Murine Dorsal Cochlear Nucleus for Optogenetic Stimulation of the Auditory Pathway

체포 또는 청력 손실을 반대하는 바이러스 매개 유전자 전달의 사용에 대한 조사는 크게 말초 청각 시스템에 이관되었다. 연구는 거의 중앙 청각 시스템에 유전자 전달을 조사 하였다. 청각 경로의 2 차 뉴런을 포함 뇌간의 등쪽 달팽이관 핵 (DCN)를, 유전자 전달을위한 잠재적 인 위치이다. 이 프로토콜에서 후두와 접근법을 통해 쥐의 DCN의 직접적이고 최대 노출에 대한 기술은 증명된다. 이 방법은 하나 급성 또는 생존 수술을 할 수 있습니다. DCN의 직접적인 시각화에 이어, 실험 호스트는 청색 레이저에 연결된 광 파이버에 의한 인공 핵 및 후속 자극으로 opsins의 주입을 포함 할 수있다. 이러한 전기 자극과 신경 인젝터 트레이싱과 같은 다른 신경 생리학 실험도 가능하다. visualiza의 수준기 및 자극 지속 기간은 달성 실험 광범위한 적용이 접근법 만든다.

부분 소뇌 흡입은 코 클리어 핵에 대한 액세스를 보여줍니다 두개골을 덮는 피부와 근육이 같은 관상과 람다 봉합 선으로, 두개골 표면 랜드 마크를 제거한 후, 개두술의 대략적인 현지화를 보여줍니다. rongeurs와 개두술에 따라, 소뇌가 보여집니다. 소뇌의 작은 부분을주의 깊게 흡입 후 주입 할 수있는 CN, (그림 1)의 시각화를 보여줍니다. 블루 라이트 레이저로 자극에 대한 보조 인공 와우 핵 노출 DCN, 옵신과 유전자 전달 및 잠복기의 초기 노출 후, DCN이어서 청색 레이저 광에 의해 자극 될 수있다. 광 자극에 대한 DCN의 표면을 노출 차 개두술은 기본 개두술 (SUPP. 동영상 1) 기술적 접근 방식과 유사하다. DCN은, 인두께 미만 300 μm의 인 표면 구조. 실험 쥐의 준비는 6 시간까지에 ...

이 프로토콜의 목표는 쥐 모델에서 배측 달팽이관 핵에 직접 접근할 수 있도록 하는 수술적 접근 방식을 설명하는 것입니다.

청각 통로의 Optogenetic 자극에 대한 쥐의 등쪽 달팽이 핵의 직접 시각화

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. ...

본 절차의 전체적인 목표는 광유전학 기반 실험을 가능하게 하기 위해 마우스 모델의 와우핵(cochlear nucleus)에 외과적으로 접근하는 것입니다. 이는 먼저 두개골 절개술을 위해 마우스를 준비하고, 두피 위를 덮고 있는 피부 연조직과 근육을 측면으로 젖힘으로써 수행됩니다. 두 번째 단계로, 람다 봉합선(lambda suture line)에서 약 2mm 측면의 왼쪽 두정간골(inter parietal bone)에 두개골 절개술을 실시합니다.이 영역은 와우핵(cochlear nucleus) 위에 위치합니다. 다음으로, 5 French 흡입관을 사용하여 DCN 위에 있는 왼쪽 소뇌의 가장 바깥쪽 부분을 흡입하십시오. 그 결과 DCN이 가려짐 없이 보이게 됩니다.정위 가이드와 같은 보조 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 와우핵을 직접 시각화할 수 있을 뿐만 아니라 광원이나 전극 어레이와 같은 신경 시뮬레이터를 뇌줄기 표면에 배치할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 광유전학 및 청각 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 유전자 전달과 같은 보조 장치 없이도 충분한 공간 및 시간 해상도로 빛을 통해 청각 뇌줄기를 자극할 수 있습니다.케타민과 자일라진을 복강 내 투여하여 마우스를 마취시킨 후, 발가락 꼬집기 회피 반응을 확인하고 심박수와 호흡수를 모니터링하여 적절한 마취 상태인지 확인합니다. 그다음, 안구 건조를 방지하기 위해 양쪽 눈에 안연고를 도포합니다. 이어서, 수술 부위가 잘 확보되도록 두피 위의 털을 면도합니다.그 후, 마우스를 소동물용 정위 고정대에 배치합니다. 코 클램프를 조절하여 적절한 호흡이 가능할 정도로 느슨하게 하되, 마우스의 머리가 완전히 고정될 수 있을 만큼 충분히 조입니다. 현미경 하에서, 귓바퀴(pinna) 사이의 정중선에서 시작하여 후두부의 소마디(coddle) 부분까지 피부를 수직으로 절개합니다.그 다음 피부를 외측으로 젖힙니다. 메스나 아이리스 가위를 사용하여 두개골의 좌측 두정골, 두정간 및 후두골 위에 덮여 있는 근육을 제거합니다. 이때 면봉으로 10~15초 동안 가볍게 압박하여 출혈을 최소화합니다.다음으로, 시상봉합(sagittal suture)과 람다봉합(lambda suture) 선을 확인합니다. Ron jewel 두 개를 사용하여 람다봉합 선에서 약 2mm 떨어진 왼쪽 두정골(parietal bone) 사이에 개두술을 실시합니다.이 부위는 개두술 후 DCN 위에 위치합니다. 소뇌를 덮고 있는 얇은 경막 층을 주의 깊게 관찰하고, 메스 날을 사용하여 이를 제거하십시오. 응고된 혈액은 면봉으로 제거하거나, 소뇌 위에 식염수를 부드럽게 떨어뜨려 혈액을 씻어내십시오.그다음, 5 French 흡입관을 사용하여 DCN 상단에 위치한 왼쪽 소뇌의 가장 가측 부분을 흡입하여 제거합니다. 흡입 시, 시각화를 개선하고 선명한 이미지를 확보하기 위해 현미경의 초점 평면을 와우핵의 예상 깊이에 맞춥니다. 왼쪽 소뇌의 약 1/4에서 1/3 정도를 제거합니다.DCN 인접한 주요 지표는 상반고리관의 AM입니다. 흡입 후 추가 출혈, 뇌척수액 축적 및 소뇌 변위가 DCN 상에 나타나면, 혈액 응고를 방지하기 위해 개두술 부위에 식염수를 빠르게 주입하십시오. 치과용 포인트로 부드럽게 닦아내는 것과 흡입을 병행하여 DCN을 직접 시각화할 수 있는 경로를 확보하십시오.DCN이 명확하게 보이고 표면의 혈액과 CSF가 제거되면, 5 µL 가스 타이트 해밀턴 시린지(Hamilton syringe)를 사용하여 벡터를 가압 미세 주입합니다. 둔성 외상을 최소화하고 주입 부피를 DCN 내로 국한시키기 위해 베벨(bevel)이 얕은 34 gauge 바늘을 사용하십시오. 그런 다음 마이크로 매니퓰레이터를 이용하여 바늘 끝이 DCN 표면 아래로 보이지 않을 때까지 천천히 삽입합니다.벡터 1.5 µL를 주입하기 시작합니다. 주입이 완료되면 바늘을 천천히 뽑고, 이어서 피부를 다시 밀착시킨 후 표준 회복 절차에 따라 마우스가 회복되도록 합니다. 치유 및 바이러스 매개 유전자 전달 배양을 위해 2~4주가 지난 후, 벡터가 주입된 마우스를 다시 마취하고 두개골 절개술 부위의 흉터 조직을 제거합니다.그 후, DCN 위에 덮여 있는 잔여 소뇌와 흉터 조직의 조합을 확인합니다. 5 French 흡입관을 사용하여 상단의 소뇌와 흉터 조직을 흡입합니다. 흡입 후,생리식염수를 개두 부위에 빠르게 도포합니다. 혈액의 울혈을 방지하기 위해 부드러운 치과용 팁으로 가볍게 닦아내고 흡입기를 함께 사용하여 DCN이 직접 보일 수 있도록 경로를 확보합니다. 이제 DCN에 접근할 수 있으며, 본 영상에서 보여주는 광유전학 기반 생리학 실험을 위해 레이저 파이버를 DCN 표면에 직접 배치합니다. 이를 통해 옵신이 감염된 DCNA의 광자극이 가능해지며, 감염된 DCN 표면에 청색광 펄스를 연속적으로 조사하면 광학적으로 유도된 청각 뇌줄기 반응이 나타납니다.마이크로 조작기를 사용하여 청반핵 표면에 청색광 레이저와 연결된 광섬유를 직접 배치하고 전원을 켭니다. 여기서 청반핵 표면에 펄스형 청색광이 조사되는 것을 확인할 수 있습니다. 이 절차 이후에 핵을 전기적으로 자극하는 것과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있으며, 이를 통해 음향으로 유발된 반응뿐만 아니라 전기적으로 유발된 신경 반응을 광자극으로 유발된 반응과 직접 비교할 수 있습니다.이 영상을 시청한 후, 여러분은 와우핵을 직접 시각화하고 접근하는 것을 최종 목표로 하는 개두술 및 소뇌 흡인술을 준비하고 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

direct-visualization-murine-dorsal-cochlear-nucleus-for-optogenetic

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

후각 망울의 성인에서 태어난 뉴런은 optogenetically Channelrhodopsin2 - 표현 이식 미니어처와 함께 주동이의 철새 스트림과 만성 photostimulation에서 lentiviral 주사를 LED를 사용하여 조절할 수 있습니다.

만성에 대한 성인 태어나 강한 뉴런의 선택 바이러스성 전달 생체내에 Optogenetic의 자극

출처: Kozin, E. D., et.al. 청각 경로의 광유전학적 자극을 위한 쥐 등쪽 달팽이관 핵의 직접 시각화. J. Vis. 경험. (2015년)이 비디오는 빛 유도 청각 자극을 가능하게 하기 위해 마우스 등쪽 달팽이관 핵(DCN)으로의 바이러스 매개 유전자 전달을 보여줍니다. 빛에 민감한 이온 채널인 옵신을 암호화하는 바이러스 벡터는 직접 접근을 위해 개두술 및 소뇌 흡인 후 DCN에 주입됩니다. 발현된 옵신은 뉴런이 빛에 의해 활성화될 수 있도록 하여 광유전학을 사용하여 청각 경로 반응을 연구하기 위한 모델을 제공합니다.

빛 유도 청각 자극을 위한 마우스 등쪽 달팽이관 핵으로의 바이러스 매개 유전자 전달

이 비디오는 실험실 환경에서 쐐기 모양의 뇌 절편을 준비하는 과정을 보여줍니다. 비브라톰을 사용하여 쥐의 뇌에서 나온 쐐기 모양의 조각을 다양한 두께로 만듭니다. 이 절편에는 청각 신경근이 두꺼운 쪽에 위치하고, 청각 관련 뉴런은 얇은 쪽에 위치합니다.

청각 뉴런을 시각화하기 위한 쐐기 뇌 슬라이스 준비하기

이 비디오는 청각 신경근을 자극하고 마우스 뇌 쐐기 슬라이스의 내측 올리보코클리 뉴런에서 시냅스후 전류를 기록하는 프로토콜을 보여줍니다.

청각신경근 자극 및 시냅스후 전류 기록(Auditory Nerve Root Stimulation and Postsynaptic Current Recordings in a Mouse Brain Wedge Slice)

우리는 시험관 내에서 신경 세포 집단을 광자극하기 위해 광유전학적 접근 방식을 사용하여 전뇌 회로의 기능적 지형 및 시냅스 특성을 특성화하는 방법을 설명합니다.

광유전학적으로 표적화된 전뇌 회로의 레이저 스캐닝 광자극

광유전학은 행동 신경과학 실험에 사용할 수 있는 강력한 도구가 되었습니다. 이 프로토콜은 레이저 시스템의 설계 및 설정에 대한 단계별 가이드를 제공하며, 대부분의 설치류 행동 테스트 패러다임과 호환되는 다중 및 동시 생체 내 광유전학적 자극을 수행하기 위한 전체 프로토콜을 제공합니다.

설치류 중추 신경계의 생체 Optogenetic 자극

여기에서는 마취된 마우스 피질에서 확인된 억제성 중간뉴런으로부터 안정적이고 잘 격리된 단일 단위 기록을 얻기 위한 전략을 설명합니다. ChR2를 발현하는 뉴런은 청색광에 대한 반응으로 식별됩니다. 이 방법은 표준 세포 외 기록 장비를 사용하며 칼슘 이미징 또는 시각적 유도 패치에 대한 저렴한 대안으로 사용됩니다.

에 가이드 생체 단일 단위 기록

인공 와우 (CI를) 청각 신경에 직접 전기 자극으로 청각 수 있습니다. 그러나 가난한 빈도와 강도 해상도의 CI와 청각의 품질을 제한합니다. 여기에서 우리는 청각 연구와 미래의 CI 개발을위한 대안 전략으로 생쥐에서 청각 신경의 optogenetic 자극을 설명합니다.

청각 신경의 자극 Optogenetic

뉴런에 다양한 시냅스 입력의 통합은 자연 타이밍과 회로 가소성을 위해 모든 사전 시냅스 핵을 보존하는 준비에서 가장 잘 측정되지만, 뇌 슬라이스는 일반적으로 많은 연결을 끊습니다. 우리는 생체 외 실험 능력을 유지하면서 생체 내 회로 활동을 모방하는 수정 된 뇌 조각을 개발했습니다.

생체 내 신경 회로 연결성 모방을 위한 체외 쐐기 슬라이스 준비

본 프로토콜은 자유롭게 움직이는 마우스에서 숙련 된 운동 거동의 성능에 관여하는 신경 회로를 특성화하기 위해 단일 펠릿 도달 - 투 - 파악 작업에서 고속 비디오 그래피와 결합 된 무선 광유전학을 사용하는 방법을 설명합니다.

생체 내 숙련 된 운동 행동의 무선 광유전학 제어

여기에서는 쥐와 생쥐의 고밀도 마이크로 전기 피질 검사(μEcoG) 기록을 위한 수술, 이식 및 기록 방법을 포함한 두 가지 프로토콜을 제시합니다. μECoG 기록은 쥐의 청각 피질에서 층류 다원(laminar polytrode) 기록 또는 쥐의 체성 감각 피질(somatosensory cortex)에서 신경 활동의 광유전학적 조작과 함께 수행됩니다.

설치류의 미세 전기 피질 조영술과 층류 폴리트로드 및 광유전학을 통합하여 피질 처리의 멀티스케일 조사

배우세요 쥐의 등쪽 달팽이 핵(DCN)에 대한 후두개 접근법을 통한 optogenetic 자극 기술을. 이 수술적 방법은 중추 청각계의 바이러스 매개 유전자 전달 및 신경생리학 실험을 가능하게 합니다.

청각 통로의 Optogenetic 자극에 대한 쥐의 등쪽 달팽이 핵의 직접 시각화

더 많은 동영상 탐색