Name: 물고기 먹이 실험 생물 검정은 해양 생물의 조직에서 이차 대사 산물의 Antipredatory 활동을 평가하기 위해 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 3 s
Description: 학습하세요 해양 생물 조직에서 이차 대사 산물의 포식 방어 활성을 평가하는 물고기 먹이 실험 생물 검정법을. 이 방법은 화학 생태학 연구에 생태학적 관련성을 제공합니다.

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이 비디오의 촬영 및 편집에 도움을 주신 James Maeda와 Aaron Cooke에게 감사드립니다. 기금은 국립과학재단(National Science Foundation, OCE-0550468, 1029515)에서 제공했습니다.

참고 :이 프로토콜의 3 단계는 척추 동물의 과목을 포함한다. 절차는 동물이 가능한 가장 인도적인 치료를받을 수 있도록 설계되었으며, 노스 캐롤라이나 윌 밍턴 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다. 1) 조직 추출 <ol><li> 이 이차 대사 산물의 체적 농도를 변경하므로 수화가 아닌 압착, 건조 아웃 또는 지나치게 젖은의 자연 상태에있는 조직을 사용합니다. 리거나 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 삽입 할 수있는 부분 또는 슬라이스로 조직 들어온다. 참고 : 신선한 조직은 경우에 따라 사용될 수 있지만,자를 때 압착 적용​​되지 않는 고정 된 조직을 잘게 자르거나하는 것이 낫다. </li><li> (1) 30 ㎖에 조직편을 추가 40 ㎖의 최종 부피까지 졸업 원심 분리 튜브에서 한 혼합물을 디클로로 메탄 (DCM)과 메탄올 (MeOH 중하는)에 도달한다. 의 전송을 포함하는 모든 단계를 수행해야합니다적절한 환기와 흄 후드에서 용매. </li><li> 튜브를 씌우고 그것을 여러 번 반전 한 후 4 시간 추출 기간 동안 반복적으로 선동. 주 :이 기간 동안 물을 MeOH와 결합하고, 생성 된 메탄올 : 물상은 DCM 상으로부터 분리한다. 조직 교대 DCM 및 메탄올에 노출되어 물을 에멀젼으로서 튜브 교반 된 바와 같다. </li><li> 둥근 바닥 플라스크에 DCM 추출물을 전송 및 낮은 열을 이용 회전 증발기에서 증발 건고 (&lt;40 ° C). 최소한의 용매를 사용하여, 20 ㎖의 섬광 바이알에 건조 된 추출물을 전송. 회전 증발기 어댑터 바이알 맞고 다시 낮은 열을 이용 회전 증발기에서 증발 건고 (&lt;40 ° C). 주 : (1) 너트 (2) 와셔, 및 (3) 도토리 너트 : 다음 단계는 나사산로드의 단부 상에 순차적으로 다음 항목을 나사 결합에 의해 조립 될 수있는 제 압축 장비의 사용을 요구한다. 세탁기 중 하나를 천공해야 또는그것은 50 ㎖ 원심 분리 튜브의 내부 지름보다 작도록 끼워. </li><li> 조직 및 메탄올이 포함 졸업 원심 관으로 되돌아 : 물 추출물을 통해 압축 조직에서 추출 매질을 짠다. 메탄올로 이동 : 같은 둥근 바닥 플라스크에 물 추출물을 냉장 보관 (&lt;10 ° C). </li><li> 물 추출물 : 다음 새 메탄올은 메탄올이 들어있는 냉장 둥근 바닥 플라스크에 압축 전송, 지금은 탈수 조직이 2 ~ 6 시​​간 지속 시간의 두 번째 추출에 빠져들 때까지 졸업 원심 분리기 튜브에 메탄올을 추가합니다. 조직이 충분히 추출되지 않았다고 임의 우려가있는 경우, 2 시간 내지 6의 MeOH 추출을 반복한다. </li><li> 낮은 열을 사용하여 회전식 증발기에서 메탄올을 건조시키고 (&lt;40 ° C). 둥근 바닥 플라스크를 헹구어의 MeOH를 사용하여 최소한의 볼륨, 건조 비극성 추출물을 함유하는 섬광 바이알로 둥근 바닥 플라스크에서 남은 수용성 추출물을 전송. </li><li> E진공 농축기에 낮은 열 (&lt;40 ° C)를 사용하여 건조시켜 수용성 추출물을 vaporate. 섬광 유리 병은 이제 조직 10 ㎖의 총 건조 원유 유기 추출물이 포함되어 있습니다. , 산화를 방지하기 위해 N 2 가스로 유리 병의 헤드 공간을 대피 단단히 밀봉 및 저장 냉동 (-20 ° C). </li></ol> 2) 음식 준비 <ol><li> 동결 건조 오징어 맨틀 분말을 준비합니다. 주 : 오징어 맨틀 다른 저생 무척추 동물에 필적하고, 2.2의 하위 단계에 성분으로 사용될 영양의 공급원을 제공한다. <ol><li> 따뜻한 탈 (DI) 물 오징어 맨틀의 해동 냉동 반지, 다음 고속 믹서기에서 그들을 퓌 레. </li><li> 얕은 쿠키 시트 및 동결 (-20 ° C)에 퓌레 오징어 맨틀의 얇은 층을 붓고, 그 다음 작은 조각으로 동결 건조 할을 냉동 오징어 퓌레의 시트를 휴식. </li><li> FR의 운영 절차에 따라 냉동 오징어 맨틀 퓌레를 동결 건조eeze 건조기. </li><li> 분말을 형성 고속 블렌더 오징어 맨틀 퓌레의 동결 건조 된 조각을 분쇄. </li><li> 흄 후드에서 회전 밀가루를 체로 치는으로 분말 오징어 맨틀을 부어 미세 분말로 조직의 큰 덩어리를 분리하는 선별. </li><li> 밀봉 용기에 미세 분말 오징어 맨틀을 전송합니다. 산화를 방지하고 냉동 저장하는 N 2 가스로 용기 헤드 공간을 대피 (-20 ° C). </li></ol></li><li> 식품 혼합물을 준비합니다. 참고 : 필요한 경우 연속 된 여러 분석을 실행할 때, 그것은 ~ 음식을 혼합 100 ㎖를 준비하는 것이 실용적이다, 그러나이 조리법은 작은 볼륨을 확장 할 수 있습니다. <ol><li> 150 ㎖ 비이커에 3g 알긴산 DI 물 100㎖로 5g을 동결 건조 오징어 맨틀 분말 혼합물을 결합. 분말이 완전히 수화하고, 혼합물이 균질해질 때까지 몇 분 동안 격렬히 교반하여 microspatula. 원하는 경우, 식용 색소는 본 보안 목표 명세서에 추가 할 수 있습니다 참고EP : 오히려 첨가하여 추출 처리 혼합물의 색상을 일치하려고하기보다는 (추출물 처리 혼합물 추출물의 천연 색소 마​​스킹) 모두 처리 및 제어의 혼합물을 생성 식품 혼합물에 염료를 추가하는 것이 더 쉽다 제어 염료 혼합물. 녹색을 띤 갈색 또는 식품 색상 조 추출물에서 어떠한 안료를 마스크하는 것이 바람직하다. </li><li> 졸업 주사기로 음식을 혼합 10 mL를 정확하게 넣습니다. 이 과정에서 기포의 혼입을 방지하기 위해주의한다. </li><li> 냉동 건조 원유 유기 추출물 20 ㎖ 섬광 유리 병을 제거합니다. 드롭을 추가 또는 메탄올의 두 사람은 다음 microspatula와 균일 한 혼합물에 추출물을 저어. </li><li> 20 ㎖ 섬광 유리 병에 음식 행렬의로드 10 ML의 주사기를 꺼내 추출물 처리 된 음식 혼합물을 균질화 microspatula 저어. R 다음, 그것은 작은 단위 (예에서 주사기를 배출하는 데 도움이 될 수 2 ml의 배출 및 균질화 :. 참고모든 10 ml의 때까지 EPEAT)의 균질화되고있다. </li></ol></li><li> 분석 알약을 준비합니다. <ol><li> 주사기로 추출 혼합물 (~ 1 ㎖)의 매우 작은 체적을로드하고, 0.25 M의 CaCl2를 용액에 주사기 팁 잠수함. 긴 형상 스파게티 스트랜드를 형성하도록 주사기의 내용물을 꺼내기. </li><li> 몇 분 후, 다음, 면도날 유리 커팅 보드에 4mm 긴 펠릿으로 들어온다, 경화 가닥을 제거 해수를 세정한다. </li><li> 반복 제어 알약을 만들기 위해 조직 추출물을 포함하지 않고 2.3.1와 2.3.2 단계를 반복합니다. 용매의 동등한 볼륨 제어 알약을 치료해야 용매 추가 할 제어 (단계 2.2.3에서 처리 혼합물에 메탄올을 첨가 참조). 음성 대조군, 즉 분석 물고기가 먹이 단념 할 수 확인이 MG ml의 농도에서 denatonium 벤조 에이트를 추가 -1 원시 음식 혼합물 (27)로하는 것이 바람직합니다. </li></ol></li></ol> 3) 기호성생물 검정 <ol><li> 자연산 노란색 상 bluehead 놀래기과의 바닷물 고기, Thalassoma의 bifasciatum와 공급 분석을 수행, 실험실 수조의 불투명 양면 구획의 세 그룹으로 유지했다. </li><li> 고무 전구 유리 피펫을 사용하여 해수의 비이커에서 식품 알약을 제공합니다. 참고 :이 방법으로 음식을받을 물고기를 양성하는 몇 일이 걸릴 수 있습니다. 음식의 전달을 앞에 조절 자극 (수족관 유리 피펫의 예를 몇 가지 탭은) 음식 펠릿의 추가를 기대하는 물고기를 훈련하는 것이 도움이 될 수있다. </li><li> 알약을 채점. 쉽게 물고기에 의해 소비되는 경우 펠릿 허용 고려하십시오. 자신의 구강에 걸릴 하나 이상의 물고기에 의해 세 번 최소 후에 먹게하지 않을 경우 펠릿이 거부 고려, 펠릿 접근하고 하나의 시도 후 무시 된 경우에는. </li><li> 점수 샘플. 참고 : 분석 절차는 그림 1에서 플로우 차트로 묘사된다 식사를 거부 물고기의 그룹.프로토콜의 모든 단계에서 제어 펠렛을 추가로 간주되지 않습니다. 분석의 단일 실행의 두 가지 잠재적 인 결과가 있습니다 샘플 허용 또는 거부 중 하나. <ol><li> 물고기의 그룹이 협력 여부를 확인하기 위해서 제어 펠렛과 함께 시작합니다. 처리 된 펠렛을 제공합니다. 물고기가 처리 된 펠렛을 수락하면 수락으로, 샘플 점수. 물고기가 처리 된 펠렛을 거부 할 경우, 물고기가 먹이를 중단 여부를 결정하기 위해 후속 제어 펠렛을 제공합니다. 물고기가 후속 제어 펠렛을 적용하는 경우 거부로, 샘플 점수. </li></ol></li><li> 복제. 각 추출물에 대한 물고기의 열 독립적 인 그룹과 분석 절차를 반복합니다. </li></ol> 4) 평가 의의 <ol><li> 피셔의 정확한 시험 (26)의 수정 된 버전으로 처리 펠릿 VS 제어 소비의 차이의 중요성을 평가한다. 컨트롤에 대한 한계 합계 및 치료 펠릿 고정되도록 테스트를 수정그들에게 모두 무작위 샘플을 치료. 참고 :이 페이지 제공 = 0.057 7 펠렛을 먹을 때; 7 이상의 펠릿을 먹을 경우 따라서, 어떤 추출물을 6 개 이하의 펠릿을 먹을 경우 억지력으로 간주하고 맛이있다. </li><li> 추출물의 집단 간의 상대적 기호성을 비교하기 위해, 각 그룹 내에서 먹을 펠릿의 평균 수를 계산합니다. 펠릿의 평균 수는 + 먹을 경우 너무 복제 추출물의 그룹이 억지력으로 간주됩니다 6 펠릿 임계 값을 유지 표준 오차 (SE) ≤6. 주 : 대표적인 결과, 그룹 할당은 종이므로 복제 추출물을 구별 개체로부터 와서 상대 기호성 종간 비교 될 수있다. </li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

본원에 기술 된 절차에 antipredatory 해양 생물 화학적 방어를 평가하기위한 상대적으로 간단하고, 생태 학적으로 중요한 실험 프로토콜을 제공한다. 여기에서 우리는 방법이 세트에 만족하는 중요한 기준을 검토 : (1) 적절한 육식 동물.이 공급 분석은 bluehead 놀래기과의 바닷물 고기, Thalassoma의 bifasciatum, 카리브해 전역의 산호초에 가장 풍부한 물고기 중 하나를 사용합니다. bluehead 저서 성 무척추 동물 (19)의 넓은 구색을 샘플링 알려진 제너럴 육식 동물이다. 포식자가 암초에 약탈하는 물고기의 대부분은 제너럴 때문에 이러한 초기 분석을위한 최선의 선택이며, 그것은 방어를 우회하는 메커니즘을 진화 할 수 있습니다 전문 포식자에 반대 antipredatory 방어가 광범위하게, 그들에 대항 할 것으로 예상된다. 하나의 잠재적 인 포식자를 사용하여 화학 방어 연구소의 설문 조사의 아르...

화학 생태학 화학자 및 생태 학자의 협력을 통해 개발했다. 지상파 화학 생태학의 subdiscipline 몇 시간 동안 주변되었습니다 있지만, 해양 화학 생태학의는 몇 십 년 오래지만 해양 생물 1-8의 진화 생태학과 사회 구조에 중요한 통찰력을 제공하고 있습니다. 스쿠버 다이빙과 NMR 분광법의 응급 기술을 활용, 유기 화학자들은 빠르게 1970 년대와 1980 년대 9 저서 무척추 동물과 조류의 소설 대사를 설명하는 출판물의 큰 숫자를 생성합니다. 이차 대사 산물 경험적 증거도없이 새로운 화합물에 생태 학적으로 중요한 특성을 관찰 작용이 책의 많은 어떤 목적을 봉사해야한다는 것을 가정. 약 동시에, 생태도 분포 이전에 이리저리 알려진 저서 동물과 식물의 풍부함을 스쿠버 다이빙의 출현을 활용하고 설명했다준설 상대적으로 비효율적 인 샘플링 방법을 해요. 이러한 연구자의 ​​가정은 고착 아무것도 부드러운 바디 화학적 육식 동물 (10)에 의해 소비를 방지하기 위해 방어해야이었다. 종 중 농도에 달리 설명 작업 사용했던 경험주의를 소개하는 노력의 일환으로, 일부 생태 독성 분석 (11)에서 화학 방어를 외삽하기 시작했다. 대부분의 독성 분석은 절반 분석 유기체를 죽이는에 대한 책임 추출물의 건조 질량 농도의 후속 결정으로, 전체 물고기 나 무척추 동물 조직의 원유 유기 추출물의 수성 현탁액에 다른 생물의 노출을하고있었습니다. 그러나 독성 분석은 잠재적 인 포식자가 자연 상태에서 먹이를 인식하는 방식을 모방하지 않으며, 후속 연구는 독성과 기호성 12 ~ 13 사이의 관계를 발견했다. 그것은 권위있는 저널에 출판이 거의 또는 전혀 ecologica을 가진 기술을 사용하는 것은 놀라운 일이다L 관련성 14-15 것을이 연구가 아직 널리 인용된다 오늘. 그것은 독성 데이터를 기반으로 연구 16-18을 게시 할 계속주의하는 것이 더욱 놀랍다. 여기에 설명 된 생물 검정 방법은 antipredatory 화학 방어를 평가하기 위해 해양 화학 생태에 대한 생태 학적으로 중요한 접근 방법을 제공하기 위해 1980 년대 후반에 개발되었다. 방법은 생태 학적으로 의미있는 독성 데이터보다 기호성 데이터를 제공, 식품 영양 학적으로 유사한 매트릭스 천연 농도 대상 유기체로부터 조 유기 추출물을 샘플링 포식자 모델을 필요로한다. (1) 적절한 제너럴 육식 동물이 먹이 분석에 사용되어야한다, (2) 모든 극성 유기 대사가 철저의 조직에서 추출해야합니다 해양 생물의 조직의 antipredatory 활동을 평가하는 일반적인 방법은 네 가지 중요한 기준을 포함 생물체를 대상으로, (3) 대사 ㄴ해야같은 체적 농도 영양 적절한 실험 음식에 혼합 전자는 그들이 추출하고, (4) 실험 설계 및 통계 방법은 의미있는 메트릭이 상대 distastefulness을 표시하기 위해 제공해야하는 유기체에서 발견. 아래에 설명 된 절차는 카리브해 해양 무척추 동물에 antipredatory 화학 방어를 평가하기 위해 설계되었습니다. 이 종은 카리브해 산호초에 공통이며, 저서 무척추 동물 (19)의 넓은 구색을 샘플링 알려져 있기 때문에 우리는 모델 육식 물고기 bluehead 놀래기과의 바닷물 고기, Thalassoma의 bifasciatum을 사용합니다. 표적 조직은 유기체로부터 먼저 추출 식품 혼합물과 결합하고, 마지막 T. 그룹에 제공되며 bifasciatum은 추출물 처리 된 음식을 거부 여부를 관찰합니다. 이 방법을 사용하여 분석 데이터는 해양 생물 12,20-21, L의 수비 화학에 중요한 통찰력을 제공하고 있습니다IFE의 역사 절충 22-24, 지역 사회 생태 25-26.

<table><tbody><tr><td>디클로로메탄</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>D37-20</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>A41220</td><td></td></tr><tr><td>무수 염화칼슘</td><td>피셔 사이언티픽 피셔 사이언티픽</td><td>C614-500</td><td></td></tr><tr><td>크라이오쿨 열전달 유체</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>20-548-146</td><td>진공 농축기용</td></tr><tr><td>알긴산 나트륨 염 고점도</td><td>MP Biomedicals</td><td></td><td></td>154723</tr><tr><td>오징어 맨틀 링</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>식료품점에서 구입할 수 있습니다</td></tr><tr><td>Denatonium benzoate</td><td>Aldrich</td><td>D5765</td><td></td></tr><tr><td>50ml 눈금 원심분리기 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>20ml 섬광 바이알</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-7</td><td></td></tr><tr><td>일회용 파스퇴르 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫용 고무 전구</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-448-24</td><td></td></tr><tr><td>펠릿 전달용 빨간색 전구</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-448-27</td><td></td></tr><tr><td>250ml 둥근 바닥 플라스크</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-067E</td><td></td></tr><tr><td>로타밥용 섬광 바이알 어댑터</td><td>Fisher Scientific</td><td>K747130-1324</td><td></td></tr><tr><td>웨이트보트</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-202B</td><td></td></tr><tr><td>마이크로주걱</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-401-10</td><td></td></tr><tr><td>5ml 눈금 주사기</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-53</td><td></td></tr><tr><td>10ml 눈금 주사기</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-54</td><td></td></tr><tr><td>면도날</td><td>Fisher Scientific</td><td>S17302</td><td></td></tr></tbody></table>

물고기 먹이 실험 생물 검정은 해양 생물의 조직에서 이차 대사 산물의 antipredatory 활동을 평가하기 위해

A Fish-feeding Laboratory Bioassay to Assess the Antipredatory Activity of Secondary Metabolites from the Tissues of Marine Organisms

해양 화학 생태학은 1980년대 천연 제품 화학자와 해양 생태학자의 협력으로 등장한 새로운 학문으로, 해양 생물의 조직에서 2차 대사 산물의 생태학적 기능을 조사하는 것을 목표로 합니다. 그 결과 실험적 접근 방식의 생태학적 관련성을 점점 더 구체화하는 프로토콜이 발전해 왔습니다. 여기에서 우리는 조사자가 해양 생물의 조직에서 2차 대사 산물의 항포식 활성을 평가할 수 있도록 하는 물고기 먹이 실험실 생물 검정의 최신 버전을 제시합니다. 모든 극성의 유기 대사 산물은 표적 유기체의 조직에서 철저하게 추출되어 영양학적으로 적합한 식품 매트릭스에서 자연 농도로 재구성됩니다. 실험용 식품 펠릿은 추출물의 항포식 활성을 평가하기 위해 실험실 사료 분석에서 일반 포식자에게 제공됩니다. 본원에 설명된 절차는 블루헤드, Thalassoma bifasciatum을 사용하여 카리브해 해양 무척추동물의 기호성을 테스트합니다. 그러나, 설계는 다른 시스템에 쉽게 적용될 수 있다. 이 실험실 분석을 사용하여 얻은 결과는 잠재적인 포식자의 완전한 보충물의 섭식 반응에 의존하는 현장 실험의 중요한 서곡입니다. 또한 이 생물학적 분석은 생물학적 분석 유도 분획을 통해 섭식 억제 대사 산물의 분리를 지시하는 데 사용할 수 있습니다. 이 섭식 생물 검정은 카리브해 산호초에서 해양 무척추 동물의 분포와 풍부함을 제어하는 요인에 대한 우리의 이해를 발전시켰으며 약리학, 생명 공학 및 진화 생태학을 포함한 다양한 연구 분야의 조사에 정보를 제공할 수 있습니다.

여기에 우리가 일반적으로 카리브해 스폰지의 여섯 종 (그림 2)이 생물 검정의 결과를보고합니다. 이러한 데이터는 처음 Pawlik 등. (12)에 의해 1995 년에 출판 및 공동 발생하는 분류군 중 화학 방어 전략의 차이를 조사하기 위해이 방식의 힘을 보여되었다. 결과는 표준 오차 (SE) 각 종 + 먹은 음식 펠릿의 평균 숫자로보고되었다. 거의 펠릿 Agelas의 clathrodes, Amphimedon compressa 및 Aplysina의 cauliformis에서 원유 유기 추출물과 분석에서 먹게되지 않았다. 반면, Callyspongia vaginalis에, Geodia의 gibberosa 및 Mycale laevis의 추출물로 만든 펠릿을 쉽게 분석 (12)에서 소비되었다. 6 개 이하 펠릿은 처음 세 종 먹게되었다, 그래서 그들은 크게 고려 제지했다. 대조적으로, 제...

이러한 생물학적 검정은 식품 영양 학적으로 유사한 매트릭스를 이용 농도 천연 해양 생물의 조직 유기 추출물로부터 병입 억지 대사의 존재를 평가하기위한 모델 육 물고기를 이용한다.

물고기 먹이 실험 생물 검정은 해양 생물의 조직에서 이차 대사 산물의 Antipredatory 활동을 평가하기 위해

Marine chemical ecology is a young discipline, having emerged from the collaboration of natural products chemists and marine ecologists in the 1980s with ...

이 실험 절차의 전반적인 목적은 해양 생물 조직에서 추출한 2차 대사산물의 포식 방어 활성을 평가하는 것입니다. 안녕하세요, 저는 노스캐롤라이나 대학교 윌밍턴 캠퍼스의 Joseph Pollock 박사이며, 해양 생물 조직의 화학적 방어 기제를 테스트하기 위한 생물 분석법 수행 영상을 제작하는 데 팀장을 맡은 대학원생 Michael Marty와 함께하겠습니다. 저희는 1980년대 후반부터 이제 여러분이 보시게 될 이 방법들을 개발하기 시작했습니다.당시 천연물 화학자들은 실험적 근거 없이 이차 대사산물에 생태학적 역할을 부여하고 있었습니다. 한편, 생태학자들은 생태학적 관련성이 없는 독성 분석 결과로부터 방어적 역할을 추론하고 있었습니다. 본 연구에서는 해양 생물 조직의 이차 대사산물이 가진 항포식 활성을 평가하기 위해 설계된 접근 방식을 제시합니다.이 접근 방식은 섭식 생물 분석(feeding bioassays)의 네 가지 중요한 기준을 충족합니다. 첫째, 적절한 일반주의 포식자를 사용합니다. 둘째, 조직으로부터 모든 극성의 유기 대사물을 철저히 추출합니다.셋째, 해당 대사산물들을 생물체에서 발견된 것과 동일한 부피 농도로 실험 사료에 첨가했습니다. 넷째, 본 실험 설계와 통계적 접근 방식은 상대적 혐오감을 나타내는 유의미한 지표를 제공합니다. 이러한 섭식 실험에서는 *Thalassoma bifasciatum*을 사용하는데, 이 어종은 카리브해 산호초에서 흔히 발견되며 광범위한 저서 무척추동물을 섭식하는 것으로 알려져 있어 카리브해 해양 무척추동물 조직을 이용한 분석에 적합한 모델 포식어종입니다.이제 Michael이 프로토콜을 상세히 설명하겠습니다. 먼저, 조직을 추출해야 합니다. 메스그라듀에이트 원심분리 튜브에 디클로로메탄과 메탄올의 1:1 혼합물을 최종 부피 30 milliliters가 되도록 넣습니다.그런 다음 표적 생물체에서 조직 덩어리를 절단합니다. 이는 신선한 조직 또는 냉동 조직 모두 가능합니다. 본 연구팀은 해면을 연구하므로, 이 영상 시연에서는 오렌지 엘리펀트 이어 해면인 *Aplysina cauliformis*를 사용하겠습니다.정확한 부피를 맞추기 위해 조직을 매우 작은 조각으로 절단해야 할 수도 있습니다. 부피 배제법을 사용하여 정확히 10 mL의 조직을 추출한 후, 튜브의 캡을 닫고 뒤집은 다음 4시간 동안 흔들어 줍니다. 이 과정 동안 물이 메탄올과 결합하며, 생성된 메탄올-물 상이 디클로로메탄 상과 분리됩니다. 튜브가 흔들림에 따라 조직은 각 추출 용매에 번갈아 노출됩니다.이 추출 기간이 지나면 두 개의 뚜렷한 층이 나타납니다. 메탄올과 물의 극성 층이 클로로포름의 비극성 층 위에 위치하게 되며, 파스퇴르 피펫을 사용하여 전이시킵니다. 메스실린더 원심분리 튜브에 담긴 디클로로메탄 추출물을 둥근 바닥 플라스크로 옮기고, 해당 메스실린더 원심분리 튜브는 냉장고에 보관해야 합니다.다음 몇 단계 동안, 회전 증발기를 사용하는 모든 단계에서 둥근 바닥 플라스크를 회전 증발기에 연결하십시오. 워터 배스의 온도가 40 °C 미만으로 유지되는지 확인하십시오. 회전 증발기의 기본 작동 절차에 따라 둥근 바닥 플라스크 내의 di chloro methane을 건조시킨 후, 매우 적은 양의 di chloro methane을 사용하여 건조된 비극성 추출물을 재현탁하십시오.둥근 바닥 플라스크 벽면에 붙은 건조물을 제거하기 위해 가볍게 흔들거나 소용돌이치게 하는 것이 도움이 될 수 있습니다. 그런 다음, 둥근 바닥 플라스크에서 클로로메탄 추출물을 20 milliliter 신틸레이션 바이알로 옮깁니다. 신틸레이션 바이알에 캡을 닫는 대신, 회전 증발기 어댑터를 장착하고 회전 증발기를 사용하여 다시 완전히 증발시켜 건조합니다. 건조된 비극성 추출물이 담긴 신틸레이션 바이알은 다음 단계들을 진행하는 동안 냉장고에 보관할 수 있습니다.조직과 메탄올 수성 추출물이 들어 있는 눈금 원심분리 튜브로 돌아가, 압착을 통해 조직에서 추출 매질을 짜내는 수제 기구를 사용하여 조직을 압착합니다. 그 후 메탄올 수성 추출물을 둥근 바닥 플라스크로 옮겨 냉장고에 차갑게 보관합니다. 2~6시간 동안 2차 추출을 진행하기 위해 조직이 잠길 때까지 눈금 원심분리 튜브에 메탄올을 추가합니다.두 번째 메탄올 추출이 완료되면, 냉장고에서 냉각된 둥근 바닥 플라스크를 꺼내고, 눈금 원심분리 튜브의 내용물을 압착하여 이 새로운 메탄올 추출물을 이전의 메탄올 수성 추출물이 들어 있는 원래의 둥근 바닥 플라스크로 옮깁니다. 이 시점에서 조직이 충분히 추출되지 않았을 우려가 있다면, 2~6시간의 메탄올 추출 단계를 반복할 수 있습니다. 둥근 바닥 플라스크를 회전 증발기에 연결하고 이전과 동일하게 메탄올을 건조시킵니다.워터배스의 온도를 40 °C 미만으로 유지하십시오. 둥근 바닥 플라스크에는 수성 추출물이 포함되어 있으며, 이를 20 mL 신틸레이션 바이알에 들어 있는 건조된 비극성 추출물과 혼합해야 합니다. 따라서 둥근 바닥 플라스크의 내용물을 20 mL 신틸레이션 바이알로 옮기십시오.필요한 경우, 둥근 바닥 플라스크를 소량의 메탄올로 헹구어 남은 추출물을 모두 수집합니다. 이제 신틸레이션 바이알에는 건조된 비극성 추출물과 극성 추출물이 들어있습니다. 다만, 극성 추출물은 소량의 액체에 현탁된 상태입니다.낮은 온도에서 진공 농축기를 사용하여 수성 추출물을 완전히 증발시키십시오. 이제 신틸레이션 바이알에는 조직 10 milliliters의 건조된 조유기 추출물이 포함되어 있습니다. 바이알 내부를 질소 가스로 불어 건조시킨 후 영하 20 °C의 냉동고에 보관하십시오. 이러한 조직 추출물의 기호성을 테스트하려면, 먼저 표적 생물과 영양학적으로 유사한 식품 매트릭스에 재구성해야 합니다.오징어 외투막 링은 무척추동물 조직의 바이오어세이를 위한 적절한 단백질원이며, 쉽게 동결건조 분말로 준비할 수 있습니다. 이 바이오어세이를 시작하려면 냉동된 오징어 외투막 링을 따뜻한 탈이온수에 넣으십시오. 해동되면 물의 일부를 따라내고 링을 블렌더에 붓습니다.오징어 외투막이 점성 액체가 될 때까지 고속으로 충분히 혼합합니다. 재료가 너무 걸쭉하여 혼합이 어려울 경우 물을 추가하십시오. 액상화된 오징어 외투막을 얕은 쿠키 시트 위에 얇게 붓고 고르게 폅니다.쿠키 시트를 -20°C의 냉동고에 넣습니다. 동결 건조 과정을 용이하게 하기 위해 냉동된 오징어 시트를 더 작은 조각으로 나누어야 합니다. 조각이 작을수록 더 빠르게 건조되므로 더 효율적입니다.동결 건조기에 넣습니다. 냉동된 오징어 조각들을 챔버에 넣고 동결 건조기의 작동 절차를 따릅니다. 동결 건조가 완료되면, 오징어 조각들을 분쇄해야 합니다.이 과정은 블렌더를 사용하여 수행할 수 있습니다. 건조된 오징어 조각들을 블렌더에 넣고, 재료가 균일한 분말 형태가 될 때까지 고속으로 작동시킵니다. 다음 단계는 미세한 오징어 가루의 흡입을 줄이기 위해 흄 후드 내에서 진행해야 합니다.동결 건조된 오징어 가루를 회전식 밀가루 체에 붓습니다. 체를 통과하는 가루를 받기 위해 체 아래에 용기를 둡니다. 핸들을 돌려 동결 건조된 오징어 재료를 체 칩니다.이전 단계에서 충분히 혼합되지 않은 커다란 결합 조직 가닥들은 체에 걸러지게 되며, 이를 통해 더 고운 분말을 얻을 수 있습니다. 필요에 따라 깔때기를 사용하여 동결 건조된 오징어 분말을 밀폐 용기에 옮기고, 염료 질소 가스로 퍼지한 후 -20°C에서 냉동 보관하십시오. 동결 건조 오징어 외투막 분말이 준비되었으므로, 이제 분석용 먹이 혼합물을 한 배치(batch) 만들 준비가 되었습니다. 같은 날 여러 번의 분석을 연속적으로 수행할 때는 먹이 혼합물을 대량으로 만들어 두는 것이 실용적입니다.여기서 100 mL 부피의 혼합물 제조 과정을 시연합니다. 깨끗한 웨잉 보트(whey boat)를 사용하여 알긴산 3 g과 동결 건조된 오징어 외투막 분말 5 g을 정량합니다. 물을 추가하기 전, 이 건조 성분들을 150 mL 비커에 넣습니다. 마이크로 스패튤라로 건조 성분들을 부드럽게 저어 함께 섞이도록 합니다.탈이온수 100 milliliters를 넣고 격렬하게 교반합니다. 분말이 완전히 수화되는 데 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다. 다음 단계로 넘어가기 전에 혼합물이 균질해졌는지 확인하십시오.식품 매트릭스를 하나의 일관된 색상으로 염색하기로 결정했다면, 이 단계에서 색소 염료를 추가하십시오. 눈금이 있는 주사기에 식품 혼합물 10 milliliters를 정확하게 채웁니다. 이 단계에서는 부피 정밀도가 매우 중요하므로, 기포가 포함되지 않도록 각별히 주의하십시오.냉동고에서 건조된 조 유기 추출물이 들어있는 20 milliliter 신틸레이션 바이알을 꺼내어 메탄올을 한두 방울 첨가합니다. 메탄올을 너무 많이 넣지 마십시오. 이는 식품 매트릭스가 굳는 것을 방지하기 위함입니다.마이크로 스파출러와 최소량의 용매를 사용하여 추출물을 균질한 혼합물로 재현탁합니다. 전체 추출물이 완전히 재현탁될 수 있도록 바이알의 벽면을 긁어내십시오. 10 milliliters의 식품 매트릭스가 담긴 시린지를 재현탁된 균질 추출물이 들어 있는 20 milliliter 신틸레이션 바이알에 분사합니다.혼합물이 균질해질 때까지 마이크로 스패튤라로 저어줍니다. 추출 혼합물을 매우 적은 양만 주입합니다. 시린지에는 1 mL면 충분합니다.주사기 팁을 0.25 molar 염화 칼슘 용액에 담그고 주사기 내부의 내용물을 밀어내어 긴 스파게티 형태의 가닥을 형성합니다. 이 가닥은 용액 내에서 경화됩니다. 몇 분 후, 경화된 가닥을 꺼내어 유리 절단판 위에 놓습니다.면도날을 사용하여 가닥을 4 mm 길이의 펠릿으로 자릅니다. 추출물 처리된 펠릿을 수집하고 해수로 헹굽니다. 대조군 펠릿을 준비합니다.조직 추출물을 추가하지 않고 동일한 절차를 따르십시오. 대조군 및 처리된 펠릿의 색상을 맞추기 위해 식용 색소의 추가가 필요할 수 있습니다. 이는 물고기가 확실히 먹지 않을 음성 대조군을 준비하기 위함입니다.Miller와 Pollock(2013)이 설명한 바에 따라, raw food 혼합물에 deton 및 benzoate 분말을 2 mg/mL 농도로 첨가합니다. 야생에서 채집한 yellow phase blue head RAs thala를 사용하여 급이 시험을 수행하며, 물고기는 실험실 수족관의 불투명한 측면 구획에 3마리씩 그룹지어 보관합니다. 먹이 펠릿을 급여하기 위한 적절한 도구는 고무 벌브가 달린 유리 피펫입니다.펠렛을 물고기가 즉시 섭취하는 경우, 수용된 것으로 간주합니다. 하나 이상의 물고기가 펠렛을 입안으로 넣으려는 시도를 최소 3회 이상 했음에도 먹지 않거나, 한 차례 시도 후 펠렛에 접근했으나 무시하는 경우에는 거부된 것으로 간주합니다.대조군 펠릿의 섭취를 거부하는 비협조적인 물고기 집단은 분석에서 제외해야 합니다. 이 흐름도는 모든 경우에 대조군 펠릿으로 시작하여 물고기 집단의 협조 여부를 확인하는 분석 절차를 보여줍니다. 그 후 처리된 펠릿을 제공합니다.물고기가 처리된 펠렛을 받아먹으면, 이 샘플은 '수용'으로 기록합니다. 물고기가 처리된 펠렛을 거부하는 경우, 물고기가 단순히 먹이 활동을 중단한 것인지 확인하기 위해 후속 대조군을 제공해야 합니다. 물고기가 후속 대조군 펠렛을 받아먹으면, 해당 샘플은 '거부'로 기록합니다.각 샘플은 10개의 독립적인 물고기 그룹으로 실행해야 합니다. 다음은 이 급이 분석의 실행 예시입니다. 먼저, 대조군 펠릿을 제공하면 물고기가 대조군 펠릿을 받아들입니다.둘째로, 처리된 펠릿을 제공합니다. 이 경우, 물고기가 처리된 펠릿을 거부합니다. 따라서 이어서 대조군 펠릿을 제공해야 합니다.물고기가 이후의 대조군을 수용하는 경우, 해당 샘플은 부적격으로 판정될 수 있습니다. 각 샘플은 10개의 독립적인 물고기 그룹으로 실험을 진행해야 합니다. 대조군 펠릿 대비 처리군 펠릿의 섭취량 차이에 대한 유의성은 Low and Pollock 2014에서 제시한 수정된 Fisher의 정확 검정(Fisher's exact test)을 통해 평가해야 합니다.대조군과 처리군 펠릿의 주변 합계가 고정된 상태에서 두 집단을 모두 무작위 표본으로 처리하도록 검정을 수정하였습니다. 이 경우 7개의 펠릿을 섭취했을 때 P 값이 0.057과 같게 산출됩니다. 따라서 6개 이하의 펠릿을 섭취한 경우에만 해당 추출물을 기피성으로 간주하고, 그 이상은 기호성이 있는 것으로 판단합니다.7개 이상의 펠렛을 섭취했을 경우입니다. 추출물 그룹 간의 기호성을 비교할 때는 대표 결과에서 보여주는 바와 같이 섭취한 펠렛의 평균 개수를 사용해야 합니다. 여기에서는 일반적인 카리브해 해면 6종에 대한 이 생물학적 분석 결과에 대해 보고합니다.이 데이터는 Pollock et al 1995에 의해 처음 발표되었으며, 공존하는 분류군 간의 화학적 방어 전략의 차이를 규명하는 이 접근법의 유용성을 보여줍니다. Y축의 각 범주는 단일 해면 종의 추출물을 나타냅니다. 각 종의 여러 개체를 샘플링하여 추출 및 테스트하였으며, 이는 종 이름 뒤의 괄호 안 숫자로 표시되었습니다.결과는 각 종별로 섭식한 먹이 펠릿의 평균 수치와 표준 오차로 보고되었습니다. alus, pleth, pheon, compressor 및 lycine called foris의 조유기 추출물을 사용한 분석에서는 펠릿이 거의 섭식되지 않았습니다. 이와 대조적으로, Vais의 Cali spongy 추출물로 만든 펠릿은Geo Osa와 Michel lavis는 분석 과정에서 빠르게 섭취되었습니다. 처음 세 종의 경우 섭취된 펠렛이 6개 미만이었으므로, 이들은 유의미한 기피 효과가 있는 것으로 간주될 수 있습니다. 반면, 나머지 세 종은 대조군과 유의미한 차이가 없었으며, 이는 기호성이 있는 것으로 간주될 수 있습니다.방금 시연한 방법들은 조작적 야외 실험 및 조사와 병행하여 포식 방지 화학적 방어 기제를 연구하는 강력한 접근 방식을 제공합니다. 이러한 생물 검정(bioassay) 결과는 저희 연구 그룹이 카리브해 산호초의 해양 무척추동물의 분포와 풍부도를 조절하는 요인들을 이해하는 데 도움이 되었습니다. 중요한 점은, 이 방법이 화학 생태학을 넘어 화학 생태학에서의 생태적 관련성에 대한 요구를 충족시킨다는 것입니다.이러한 바이오어세이의 결과는 약리학, 생명공학 및 진화 생태학을 포함한 다양한 연구 분야의 조사에 유용한 정보를 제공할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Environment

환경

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낮은 친화력 세포 수용체 - 리간드 상호 작용의 확장 가능한 감지를위한 욕망 기반의 세포 상호 작용 검사 (AVEXIS)

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