단백질 공동 식의 다각적 인 장점에 대장균
February 5th, 2015
단백질 동시 발현은 단백질 복합체의 in vitro 재구성에 대한 강력한 대안이며 in vivo에서 생화학 및 유전자 검사를 수행하는 데 도움이 됩니다. 여기에서 우리는 단백질 복합체를 얻고 세포의 돌연변이 빈도를 조정하기 위해 대장균에서 단백질 공동 발현을 사용하는 것에 대해 보고합니다.
다음 실험의 전반적인 목표는 esia coli에서 다양한 단백질을 coex로 발현하고 in vivo에서 이들의 조립을 평가하는 것입니다. 이는 두 개의 호환 가능한 플라스미드, P bad 및 P good을 사용하여 e coli top 10을 공동 변형함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, co 형질전환된 균주를 섭씨 30도에서 배양한 다음 단백질을 과발현하도록 유도합니다.
다음으로, 용해성 단백질을 추출하고 과발현된 단백질의 연관성을 분석하기 위해 겔 여과를 실시합니다. 결과는 대장균의 공동 발현이 생체 내에서 조립된 단백질 복합체의 생산을 위한 효율적인 도구이며 유리 소단위 단백질의 낮은 용해도를 우회하는 데 편리하다는 것을 보여줍니다. Coex 발현은 생화학에서 강력한 도구로, 다른 단백질의 단일 세포에서 과발현을 거꾸로 만듭니다.
단일 유전자의 과발현이 로피 수 단백질의 연구에 필수적이었다는 것을 인식할 수 있습니다. 그러나 단백질 복합체에 대한 연구가 과제였을 때 시험관 내에서 단일 개별 단백질을 과발현, 분리 및 재구성해야 했습니다. 이것은 실험실 집약적인 접근 방식이며, 이는 또한 관심 단백질 복합체의 수율이 단백질 복합체에 조립된 개별 단백질의 수율보다 낮다는 것을 의미합니다.
또한, 단백질 상호작용 인자 중 하나가 낮은 용해도를 특징으로 하는 문제에 직면할 수 있습니다. 이 방법은 다수의 서로 다른 소단위로 구성된 단백질 복합체의 특성화와 같은 생화학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 실험을 시작하려면 상위 10개 대장균 균주의 전기 적혈 세포를 준비합니다.
단일 콜로니를 1ml의 LB 매체로 옮깁니다. 180RPM으로 흔들면서 섭씨 37도에서 튜브를 배양합니다. 전 배양 1개에서 500까지 신선한 LB 매체의 25 밀리리터에 있는 묽게 하고 대나무 단계 0.6 OD를 도달할 때까지 섭씨 37 도에 배양물을 배양하고, 5, 원심 분리 후에 20 분 동안 000 분당 회전수에 세포 현탁액을 원심 분리하십시오.
Resus, 펠릿을 25 밀리리터의 10 부피 당 볼륨, 얼음, 차갑고, 멸균, 글리세롤 물에 현탁. 그리고 이 단계를 네 번 반복합니다. 1.5밀리리터에 도달할 때까지 매번 Resus 서스펜션 부피를 갖습니다.
다음으로, 펠릿을 10%글리세롤에 재현탁시키고 세포 현탁액을 50마이크로리터 분취액으로 나눕니다. 부분 표본을 섭씨 영하 80도에서 최대 6개월 동안 보관하십시오. 실험을 계속하려면 원하는 플라스미드를 0.5 millimolar EDTA가 보충된 멸균수에 용해시키고 전기 적격 세포의 분취액을 얼음에서 해동합니다.
2.5-5 나노그램의 벡터를 추가하고 해동된 세포를 혼합합니다. 세포를 0.1cm 수의사에게 분배합니다. 셀에 1.8킬로볼트 펄스를 적용하고 전기천공된 셀을 즉시 1밀리리터의 SOC 매체로 전송합니다.
1시간 동안 흔들면서 세포를 배양하고 100마이크로리터의 분취액을 LB 오거와 항생제가 들어 있는 페트리 접시에 옮기고 섭씨 37도에서 밤새 세포를 배양합니다. 멸균 루프로 페트리 접시에 단일 식민지를 줄무늬로 만들어 T를 정화합니다. 소량의 글리세롤 스톡과 co 형질전환체를 LB 배지 및 항생제를 함유하는 페트리 접시로 옮깁니다.
세포 현탁액을 페트리 접시에서 건조시키고 세포 방울을 줄무늬로 만듭니다. 접시를 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. 배양 후 멸균 이쑤시개를 사용하여 단일 콜로니를 1ml의 LB 항생제 배지로 옮깁니다.
섭씨 37도에서 8시간 동안 배양합니다. 사전 배양을 신선한 배지에 1에서 500까지 희석하고 섭씨 30도에서 15시간 동안 배양합니다. 다음으로 1밀리몰을 추가합니다.
Aosse와 IPTG는 각각 섭씨 30도에서 2시간 30분 동안 배양합니다. 세포를 수집하고 펠릿을 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 펠릿을 얼음 위에서 해동하고 용해 완충액에 다시 현탁시킵니다.
그런 다음 차가운 유리 도공으로 셀 서스펜션을 부드럽게 균질화합니다. 다음으로, 15 와트에서 15 초 동안 셀을 초음파 처리 한 다음 15 초의 냉각 간격을 둡니다. 그리고 이 과정을 원심분리기를 4회 반복합니다.
총 단백질은 10, 섭씨 4도에서 20분 동안 000G로 추출합니다. 용해성 분획을 회수합니다. 각 녹는 단백질 추출물의 20 마이크로리터를 선적 완충액의 80 마이크로리터를 포함하는 마이크로 분리기 관으로 옮기고 12.5%Acrylamide SDS 페이지에 의하여 각 녹는 단백질 추출물을 분석하기 위하여 5 분 동안 해결책을 끓이고, 각 표본의 18 마이크로리터를 적재하고 1 시간 30분 동안 140 볼트에 전기 이동법을 달립니다.
원심분리 후, 3겹의 종이 필터가 장착된 부커 깔때기에 상층액을 넣고 부드럽게 진공 청소기로 청소합니다. 과도한 거품을 피하기 위해 펠릿을 버리십시오. 여과하는 동안 진공 삼각 플라스크를 얼음 위에 두십시오.
여과 후 Bradford 분석을 수행하여 pH 8에서 50 밀리몰 트리스, HCL 150 밀리몰, NACL 1 밀리몰 EDTA로 워터 재킷 16 x 70 겔 여과 컬럼과 평형을 이루는 단백질 농도를 측정합니다. 1mL 샘플 루프를 사용하여 용해성 단백질 추출물을 컬럼에 로드합니다. 분당 0.6ml의 속도로 크로마토그래피를 수행하고 컬럼 온도를 섭씨 4도로 유지합니다.
다음으로 0.9 밀리리터 분획을 수집하여 SDS 페이지별로 분석합니다. 각 관련 분획 20마이크로리터를 80마이크로리터의 로딩 버퍼가 들어 있는 마이크로 원심분리 튜브에 옮기고 튜브를 5분 동안 끓입니다. 각 샘플에 18마이크로리터를 로드하고 140볼트에서 1.5시간 동안 전기영동을 수행합니다.
분석에 의한 SDS 페이지를 따르십시오, 96에서 각 분획의 3 프라임 5 프라임 엑소뉴클레아제 활성. P-N-P-T-M-P 기질을 사용하는 웰 마이크로플레이트는 PPX 효소 결합 분석 및 INT를 전자 셉터 전달로 사용하여 DNA 중합효소 활성을 추정합니다. PBA 엡실론과 P 양호한 엡실론을 포함하는 대장균 상위 10 개의 단일 콜로니, D, 12, A, 11 벡터, 1 밀리리터의 LB 배지를 항생제로 처리했습니다.
섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양을 배양하십시오. 다음날 아침, 10ml의 신선한 배지가 들어있는 3 개의 플라스크에 사전 배양을 1에서 250까지 희석합니다. 유도제에 아라비노스 IPTG 또는 AOSE 및 IPTG를 각각 1밀리몰씩 첨가하고 유도된 배양액을 섭씨 37도에서 8시간 동안 배양합니다.
비유도 배양을 준비합니다. 병렬로. 1ml의 부분 표본을 모아 10ml의 신선한 배지(유도제를 보충하거나 보충하지 않음)가 들어 있는 새 플라스크에 1에서 500까지 희석합니다.
그런 다음 섭씨 37도에서 밤새 혼합물을 배양합니다. 다음 날. 사전 배양을 희석하는 것부터 시작하는 단계를 반복하고 1mL 분취량을 수집합니다.
그런 다음 부분 표본을 냉동실에 넣습니다. 다음으로, 각 문화권에서 발생한 세대 수를 확인합니다. 100마이크로리터의 적절한 곡물, 접종물 희석 및 배양액을 LB 플레이트에 옮깁니다.
다음날 아침 섭씨 37도에서 밤새 플레이트를 배양합니다. lb 플레이트의 식민지를 세십시오. 접종물 또는 로그 I에 존재하는 세포 수와 성장 종료 시 배양 또는 로그 C에 존재하는 세포 수의 로그를 계산하고 세대 수를 결정합니다.
그런 다음 5, 000 Gs에서 20 분 동안 배양물을 원심 분리하고 50 밀리 몰 트리스, H-C-L-P-H 7.6 50 밀리 몰, NACL에서 perme의 1 밀리리터에 세포를 재현 탁시킵니다. 세포는 20초 동안 2-3방울의 클로로포름과 소용돌이를 추가합니다. 마지막으로, 96에서 각 부분 표본의 포도당 활성을 측정합니다.
웰 마이크로플레이트는 100마이크로리터의 투과성 세포와 100마이크로리터의 p 니트로 페놀 d 글루코시드 기질을 각 웰에 추가하면서 웰에 기포가 생성되는 것을 방지합니다. 420나노미터에서 마이크로플레이트 리더와 필터를 사용하여 흡광도를 판독합니다. 그리고 SDS 페이지는 알파, Dr.Epsilon 또는 알파 Dr.And 엡실론을 과발현하도록 유도되거나 유도되지 않은 세포로부터 분리된 총 단백질 추출물로부터 수행되었다.
이 겔은 IPTG와 ARABINOSE를 배양 배지에 동시에 첨가하면 알파 DR의 동시 발현을 유발한다는 것을 보여줍니다. 그리고 엡실론 용해성 단백질을 세포에서 추출했습니다. 이러한 단백질을 발현하는 Coex. 겔 여과 및 효소 분석은 알파, DR을 입증했습니다. 그리고 엡실론은 단백질을 연관시키지 않으며, 공동 발현을 사용하여 돌연변이 균주를 더 잘 제어할 수 있습니다.
베타 글루코시다아제 활성은 엡실론의 효과를 결정하기 위해 표현형 테스트에서 측정되었습니다. 디 12. 돌연변이 유발 변이체 발현 베타 글루코시다아제 활성은 야생형 엡실론 서브유닛이 단독으로 또는 D 12와 함께 유도되었을 때 약 20 세대에서 획득되었습니다.
변이체 베타 글루크 활성은 중간 수준의 대장균에 의해 획득되었습니다. 이 절차를 수행하는 동안 동시 발현 조건을 테스트하는 것이 중요합니다. 특히 주의를 기울여야 할 몇 가지 주요 매개변수가 있다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.
첫째, 인덕션 온도입니다. 둘째, 유도제의 농도, 셋째, 유도 길이. 마지막으로, 서로 다른 호스트 균주를 병렬로 테스트하는 것도 중요할 수 있습니다.
이것은 관심있는 단백질 복합체의 최종 수율에 막대한 영향을 미칠 수 있기 때문입니다.
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개요
이 연구는 대장균에서 단백질 복합체의 생체 내 조립을 용이하게 하기 위해 단백질의 공동 발현을 탐구합니다. 연구자들은 호환 가능한 플라스미드를 사용하여 용해성 단백질 복합체를 생산하는 효율적인 방법을 보여주며, 단백질 용해도와 관련된 도전을 극복합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 영역
- 생화학
- 단백질 공학
- 미생물학
배경
- 단백질 공동 발현은 단백질 복합체의 시험관 내 재구성의 대안입니다.
- 이 방법은 생체 내 생화학 및 유전자 검사를 돕습니다.
- 대장균은 단백질 조립 연구를 위한 모델 유기체로 사용됩니다.
- 도전 과제에는 자유 단백질 소단위체의 용해도가 포함됩니다.
연구 목적
- 대장균에서 다른 단백질을 공동 발현합니다.
- 생체 내에서 이들 단백질의 조립을 평가합니다.
- 단백질 복합체 생산에서 공동 발현의 효율성을 평가합니다.
사용된 방법
- 두 호환 가능한 플라스미드를 사용한 대장균의 공동 형질전환.
- 30도 섭씨에서 형질전환된 균주의 배양.
- 표적 단백질의 과발현을 유도합니다.
- 용해성 단백질을 추출하고 겔 여과를 수행하여 단백질 연관성을 분석합니다.
주요 결과
- 대장균에서 공동 발현은 효과적으로 단백질 복합체를 생산합니다.
- 이 방법은 다른 방법으로는 잘 용해되지 않는 단백질의 조립을 가능하게 합니다.
- 결과는 자유 소단위체의 용해도 문제를 성공적으로 우회함을 나타냅니다.
- 공동 발현은 생화학에서 강력한 도구로 검증됩니다.
결론
- 공동 발현은 생체 내 단백질 상호작용을 연구하는 타당한 방법입니다.
- 이 접근법은 기능적 단백질 복합체의 생산을 향상시킵니다.
- 미래 응용 분야에는 더 복잡한 단백질 조립 연구가 포함될 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Protein co-expression in Escherichia coli enables efficient in vivo assembly of multi-subunit protein complexes, directly addressing solubility and functional association challenges that limit traditional in vitro reconstitution. This approach streamlines early discovery and target validation by providing scalable access to biologically relevant complexes, supporting predictive confidence and mechanistic de-risking at critical pipeline inflection points. The method's flexibility for cross-species subunit testing and mutation frequency modulation further enhances its portfolio impact for biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of protein complex assembly and function in a cellular context.
- Facilitates mechanistic de-risking by overcoming poor solubility of individual subunits.
- Supports functional validation of target complexes, including cross-species compatibility.
- Provides a platform for modulating and quantifying mutation frequency in live cells.
Screening & Assay Development
- Generates validated, soluble protein complexes for downstream biochemical assays.
- Improves reproducibility and standardization by bypassing labor-intensive in vitro reconstitution.
- Enables quantitative assessment of protein-protein interactions and enzymatic activities.
- Supports scalable production of complexes for screening and mechanistic studies.
Translational & Preclinical Research
- Allows functional testing of subunit compatibility across bacterial species, informing translational relevance.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by enabling in vivo phenotypic modulation.
- Supports risk-adjusted advancement decisions through quantitative mutation frequency control.
Pipeline & Workflow Integration
Protein co-expression in E. coli integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling rapid assembly, validation, and functional testing of protein complexes.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling in vivo complex assembly and activity measurement.
- Screening: Delivers reproducible, soluble complexes for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative readouts of protein association, enzymatic activity, and mutation frequency.
- Translational Research: Facilitates cross-species subunit testing and phenotypic modulation relevant to disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for diverse protein complex studies across R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of protein complex production.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust functional assays early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of complex-dependent targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, protein expression, and biochemical assay development.
- Needs access to compatible plasmid systems, E. coli strains, and analytical instrumentation (e.g., gel filtration, SDS-PAGE, microplate readers).
- Demands careful optimization of induction temperature, inducer concentration, and induction length for each complex.
- May require parallel testing of different host strains to maximize yield and solubility.
- Practical limitations include host strain variability and the need for empirical optimization of co-expression conditions.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:11
Isolation of E. coli Co-transformants
4:19
Co-expression of α and ε Subunits of E. coli DNA Polymerase III
6:20
Co-expression of α Subunit of Deinococcus radiodurans DNA Polymerase III and ε Subunit of E. coli DNA Polymerase III
6:49
Gel Filtration Chromatography
8:09
Mutation Analysis of Populations Co-expressing the Wild-type ε Subunit of E. coli DNA Polymerase III and the Mutagenic εD12A Variant
10:43
Results: Effective Protein Co-expression in E. coli
11:55
Conclusion
