Name: 엔테로 바이러스 및 문화 RT-qPCR에 의해 물에서 노로 바이러스의 발생의 EPA 방법 1615 측정. II. 총 배양 가능한 바이러스 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: 학습하세요 물 샘플에서 감염성 바이러스 입자를 측정하는 EPA 방법 1615의 총 배양 가능한 바이러스 분석 기법을 Buffalo Green Monkey 신장 세포를 이용하여 바이러스 복제를 검출하고 MPN 계산기로 정량화하는 방법입니다.

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저자는 이 연구에 사용된 사빈 폴리오바이러스 혈청형 3호를 공급해 준 위스콘신주 마쉬필드에 소재한 미국 농무부의 마크 보차르트(Mark Borchardt) 박사에게 감사를 표한다. BGM 문화 준비를 위한 Dynamac Corporation의 Mary Jean See, Nancy Schable 및 Jenifer Jones; USEPA Method 1615의 전반적인 평가에 기여한 Nichole E. Brinkman, Shannon M. Griffin, Brian R. McMinn, Eric R. Rhodes, Eunice A. Varughese, Ann C. Grimm, Sandhya U. Parshionikar 및 Larry Wymer; 기술 지원을 위한 Gretchen Sullivan; 그리고 우리가 물 샘플을 수집할 수 있도록 허용해 준 지역 개인 우물 소유자 및 유틸리티. 이 작업은 USEPA의 검토를 거쳐 출판 승인을 받았지만 반드시 공식 기관 정책을 반영하는 것은 아닙니다. 상표명 또는 상용 제품에 대한 언급은 사용에 대한 보증 또는 권장 사항으로 간주되지 않습니다.

주 : 정의 목록에 대한 보충 자료 섹션 S1을 참조하십시오. USEPA 방법 1615과 관련된 품질 보증 절​​차는 보충 자료 섹션 S2에 설명되어 있습니다. 1. 필터 용출 절차 <ol><li> 먼저 용출 <ol><li> 버퍼 1.5 % 쇠고기 추출물의 pH 9.0 500ml의 배치, 메스 실린더 내에 실온으로 가온. 필터 카트리지 하우징을 열고 완전히 전기 양성 필터를 덮도록 쇠고기 추출물 충분한 양을 추가한다. 필터 하우징 덮개를 교체하고 멸균 비이커에 남아있는 쇠고기 추출물을 붓는다. </li><li> 접촉 시간이 1 분 후, 그 압력 용기 또는 연동 펌프를 이용하여 서서히 상기 필터를 통해 무균 비이커에 나머지와 함께 하우징의 비프 엑기스 용액을 전달한다. 2 L의 유리 비커에 용출액을 수집합니다. </li></ol></li><li> 두 번째 용출 <ol><li> 반복 버퍼 1.5 % 쇠고기 추출물의 추가 500 mL로하여 1.1 단계하지만, 15 분에 단계 1.1.2의 접촉 시간을 증가시킨다. </li><li> 제 1 용출에서이 포함 된 2 L 비커에 두 번째 용출에서 쇠고기 추출물을 추가합니다. 비커에 멸균 교반 막대를 추가합니다. </li></ol></li></ol> 2. 유기 응집 농도 절차 <ol><li> 적어도 5 분 동안 0.525 %의 차아 염소산 나트륨 결합 형 pH 전극을 소독. 멸균 DH 2 O와 전극을 씻어 후 0.05 M 티오 황산나트륨으로 탈염 소화. pH가 4와 7 표준을 사용하여 pH 미터를 보정. </li><li> 저어 접시에 용출액을 포함하는 비커를 놓습니다. 접시에 돌려 와류가 형성 될 때까지 교반 속도를 향상시킬 수 있습니다. </li><li> 천천히 용출액을 1.2 M HCl을 적가하여 3.5 ± 0.1 용출액의 pH를 조정합니다. 빠른 또한이 바이러스를 불 활성화 것이기 때문에 염산 드롭 현명 추가합니다. 침전물이 형성되기 시작으로이 시간 동안 용출액은 흐린 될 것입니다. </li><li> 혼합 SPE를 감소다음, 천천히 교반 ED 및 30 분 동안 실온에서 3.5 ± 0.1에서 용출액의 pH를 모니터링하고 유지하는 것을 계속한다. </li><li> 4 ° C에서 2,500 XG에서 15 분 동안 침전 된 쇠고기 추출물의 하나 또는 그 이상의 원심 분리기 병에 서스펜션과 원심 분리기를 따르십시오. 원심 분리기와 두 흡로부터 병을 제거하거나 천천히 펠릿 석출물의 손실을 방지하기 위해 상등액을 가만히 따르다. 상층 액을 버린다. 참고 : 침전물의 양과 질에 쇠고기 추출물 많이들 사이에 상당한 변화가있을 수 있습니다. 다른 로트에서 그 어려움 용해하는 동안 일부 많이에서 생성 된 침전물을 빠르게 용해됩니다. </li><li> 침전물을 함유하는 원심 분리 병에 0.15 M 인산 나트륨 30 ㎖를 추가한다. <ol><li> 0.15 M 인산 나트륨, 5 분 이내에 용해 쇠고기 추출물 많이에서 침전을위한 pH가 9.0을 사용합니다. 침전물이 완전히 용해 된 후 10 분 동안 교반 한 다음 270 단계로 바로 간다. </li><li> 다른 모든 침전물을 위해 0.15 M 인산 나트륨, pH가 7.0-7.5을 사용합니다. , 또는 더 어려운 침전물에 대한 용해 10 ~ 15 분 동안 교반 궤도 통에 160 rpm에서 침전물을 흔들어는 피펫으로 교반하는 동안 반복적으로 상하 솔루션을 그려, 멸균 주걱으로 그들을 파괴, 이들 절차의 조합에 의해. 주 : 하나 이상의 원심 분리 용기를 사용하는 경우, 인산 나트륨 미만 30 ㎖를 사용하여 침전물을 결합하고 하나의 병 또는 비이커에 침전물을 조합 한 후 병을 린스하기 위해 30 ㎖의 나머지 부분을 사용한다. </li><li> 결합 된 침전물은 평평한 바닥 원심 분리기 병에있는 경우, 병에 교반 막대를 추가합니다. 2.6.5 단계로 이동합니다. </li><li> 합한 침전물 원추형 바닥 원심 분리 병에있는 경우 작은 유리 비이커로 옮기고 비이커에 교반 막대를 추가한다. </li><li> 자석 교반기 위에 병이나 비커를 놓고 홍보 할 때까지 저어ecipitate 완전히 해산했다. </li><li> 0.525 %의 차아 염소산 나트륨 결합 형 pH 전극을 다시 소독 단계 2.1에 기재된 바와 같이 0.05 M 황산나트륨으로 탈염 소화. pH를 7 ~ 10 표준을 사용하여 pH 미터를 보정. 천천히 1 M NaOH로 9.0로 완전히 용해 침전물의 pH를 조정 한 다음 10 분 동안 교반한다. </li></ol></li><li> 스터 막대를 제거하고 4,000-10,000 XG, 4 ° C에서 10 분 동안 용해 된 침전물을 원심 분리. </li><li> 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않고 유리 비커에 상층 액을 붓는다. 비커에 교반 막대를 추가하고 펠렛을 폐기합니다. </li><li> 자석 교반기에 비커를 놓고 솔루션을 저어. 7.0-7.5로 pH를 조정하는 것이 현명 1.2 M 염산 드롭을 추가합니다. </li><li> 필터는 1.5 % 소고기 추출물 15 ㎖, 0.05 M 글리신, pH를 7.0-7.5로 전처리 된 프리 필터를 포함하는 살균 필터를 통과하여 상층 액을 멸균. </li><li> 분석 샘플 있습니다 volum전자 (S) 계산 : <ol><li> 사용 식 1은 실험실 요새는 빈과 빈 실험실 시약을 제외한 모든 테스트 샘플 S를 계산하는 <img alt="식 (1)" src="/files/ftp_upload/52437/52437eq1.jpg" width="100" /> 식 (1) D는 (있는 분석 원수 샘플 볼륨) 지하수 500 L이고, TSV (총 샘플 량)은 실험에 의해 수신 된 5 인치 전기 양성 카트리지 필터에 통과 필드 샘플의 부피이고, FCSV (최종 농축 샘플 볼륨) 단계 2.10 여과 다음 볼륨이다. 예 보충 자료 섹션 S4.1에 도시된다. </li><li> 그리고 빈 실험실 시약 (LRB, 즉, 시약 등급의 물을 사용하여 음의 품질 관리) 0.3에 의해 FCSV를 곱하여, 빈 실험실 요새 (즉, 시드 시약 등급의 물을 사용하여 긍정적 인 품질 관리 LFB)에 대한 S를 계산합니다. </li></ol></li><li> THRE에 FCSV 나눈다전자 부 표본. <ol><li> 1.04 배를 분석 된 샘플 부피와 동일한 부피의 서브 샘플 1 및 2를 제조 하였다. ; 이하에서 -70 ° C가 총 바이러스 배양 분석 (표본 1, 단계 4)를 이용하여 분석 또는 24 시간 내에 (도시되지 않음), 분자 분석을 처리 할 수​​없는 경우, 이러한 서브 샘플을 동결 그렇지 않으면, 4 ° C에서 개최합니다. </li><li> 이하에서 나머지 볼륨 (표본 3) 고정 -70 ° C ~. </li></ol></li><li> (10)에 의해 S를 나누어 접종 볼륨을 계산합니다. </li></ol> 3. 총 배양 가능한 바이러스 계량 적 분석 참고 : 모든 단계가 항상 세포 단층을 방해하지 않도록주의 솔루션을 추가하십시오. <ol><li> 경사 분리 또는 3-6일 포스트 분할에서 BGM 세포의 단층을 함유하는 시험 용기로부터 흡 미디어 다음 제거 매체와 동일한 평형 염 용액의 부피를 추가한다. </li><li> 경사 분리 또는 세포 배양 TE에서 평형 염 용액 대기음성 용기를 사용하고 세포 배양 시험 용기에 접종되고 <ol><li> 총 배양 바이러스 계량 적 분석 컨트롤 (보충 자료 섹션 S2.4)과 함께 접종 볼륨과 동일한 표본 1의 부피와 각 시험 샘플 (10) 테스트 혈관을 접종한다. </li><li> (LFSM, 즉, 시드 물 매트릭스 샘플)을 LFB와 랩 강화 샘플 매트릭스를 들어, 희석제로 표본 3 0.15 M 인산 나트륨, pH가 7.0-7.5을 사용하여 5-, 25-, 125 배 희석액을 준비합니다. 희석 물을 만들기위한 방법의 일례는 보충 자료 섹션 S3에서 주어진다. 단계 3.2.1로 희석 한 표본 접종 혈관 외에 각 시험 용기에 접종 볼륨을 사용하여 각 희석 계열 열 세척하고 세포 배양 시험 용기에 접종. </li><li> 부화 14 일 후 10 개의 복제에 CPE가 (단계 3.2.2에서 접종 이외의) 단계 3.2.1에서 어떤 시료의 경우, 사전 (단계 3.3 참조)표본 (3)의 5-, 25- 및 125-, 625 배 희석 깎다 접종 10은 전체 배양 바이러스 계량 적의 새로운 세트와 함께 각 시험 용기에 접종 볼륨을 사용하여 각 희석 계열의 세포 배양 시험 용기 세정 분석 컨트롤 (보충 자료 섹션 S2.4). </li><li> 전후로 용기를 기울여서 세포 단층의 표면 위에 접종 배포. 1-5 진동 / 분 또는 본 바이러스는 세포에 흡수 할 수 있도록 용기마다 15 ~ 20 분으로 요동 기계적 요동 플랫폼에서 80-120 분 동안 실온에서 시험 용기 부화. </li><li> 데워진 유지 보수 매체를 추가 한 후 36.5 ± 1 ° C에서 테스트 혈관을 품어. </li></ol></li><li> 설정 냉동실에 ≥75 %의 CPE를 표시하는 테스트 선박 하루 14 전송까지 그들에게 2-3 일마다 검사 후 처음 3 일 동안 매일 현미경을 사용하여 각 시험 용기의 CPE의 모습을 찾아 나-70 이하 C °. 또는 아래에 남아있는 모든 문화와 총 배양 바이러스 계량 적 분석 컨트롤을 고정 -70 ° C의 마지막 날에 혈관을 검사 한 후. </li><li> 모든 문화를 해동하고 0.2 μm의 살균 필터를 통해 모든 CPE 양성 시험 용기에서 매체의 ≥15 %를 필터링 할 수 있습니다. 지정된 볼륨 1,500-18,000 XG에서 10 분 동안 의한 막힘, 원심 분리기, 필터를 통해 매질을 통과시키고, 여과 4 ° C 이전 할 수없는 경우. </li><li> 세척 BGM 시험 용기를 사용하는 모든 1 차 통과 시험 용기의 제 2 통로를 수행합니다. <ol><li> 모든 부정적인 테스트 선박에서 긍정적 인 혈관에서 여과 매체로부터 해동 매체의 10 %를 나타내는 접종 볼륨과 새로운 테스트 혈관을 접종한다. </li><li> 반복 3.2.4-3.4.3 단계하지만, 단계 3.3에 설명 된대로 2 차에서 1 차 통과에 부정과 긍정적 모든 시험 용기를 동결. 3 번째 패스를 수행단지 음의 분석 제어와 2 차 통과에서 1 차 통과시 음성 및 양성이었다 세포 배양 물을 사용하여 2 차 통과에서 기술 한 바와 같이 세. </li></ol></li><li> 그들은 1 차 및 2 차 단락 또는 모두에서 CPE를 표시 할 때 CPE는 2 차 통로까지의 모두 2 차 및 3 차 통로를 발생하지 않는 경우, 바이러스 긍정적 인 개별 테스트 선박을 식별합니다. </li><li> 모든 테스트 샘플의 바이러스 역가를 계산하는 표 S2와 같이 설정 한 기본 프로그램 설정으로 USEPA의 가장 가능성있는 번호 계산기를 사용합니다. <ol><li> 입력 MPN / ㎖ 값 (M mL) 및 상부 (CL UML) 및 하부 (CL 1 ㎖) 95 % 신뢰 한계 / ml의 값을 결정하기 위해 계산기에 각각의 테스트 샘플에 대한 단계 3.6에서 바이러스 양 복제에 시험 용기의 개수 . </li><li> 영형수학 식 2를 사용하여 상응하는 시료의 MPN / L 값 (M의 L) btain. <img alt="식 (2)" src="/files/ftp_upload/52437/52437eq2.jpg" width="100" /> 식 (2) M mL의 단계 3.7에서 MPN / ㎖ 값이고, S는 분석 샘플 볼륨이고, D는있는 분석 원래 물 샘플의 볼륨입니다. </li><li> M 개의 mL의 값의 CL UML 값을 대입하여 상부 신뢰 한계 / L을 계산한다. M 개의 mL의 값의 1 ㎖ CL 값을 대입하여 낮은 신뢰 한계 / L을 계산한다. 계산 예는 보충 자료 섹션 S4.2에 도시된다. </li><li> 0 / D 1 ≤ 등의 보고서 M mL의 값. 예를 들어, 지하수 샘플 0.002 MPN / L (≤ 1/500 L) ≤. </li><li> 강화 각 연구소의 MPN 95 % 신뢰 한계 값을 계산 빈과 랩 다시제 S에 의해 계산에서 얻어진 값 / ㎖를 승산하고 0.3 결과를 나눔으로써 빈 에이전트. </li></ol></li></ol>

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USEPA 방법 1615은 규제되지 오염 물질 모니터링 규정의 세 번째 모니터링주기 (UCMR3) 17시 사용하기 위해 개발 주로 지하수에서 바이러스 발생을 측정하기 위해 설계되었다. 그것은 정보 수집 규칙 (ICR) 방법, 15,18와 일반적인 단계의 번호를 공유하지만이 약간의 차이가 있습니다. 모두 가장 가능성이 수 (MPN) 계산에 기초하는 정량와 BGM 세포 단일 층에 CPE를 생산하는 바이러스를 측정하는 계량 적 분석을 사용합니다. 방법 1615은 다양한 물 행렬로부터 바이러스를 농축하는 새로운 전기 양성 필터의 사용을 허용하고 세포 배양 시험 용기의 개수는 20 내지 모두 작은 변화가 전체에있어서 비용 절감 (10)에 희석 당 복제 감소시킨다. 복제 횟수의 감소는 노동력을 줄일 수 있지만, 약간 낮은 검출 한계 초래한다. 지하수는 지표수보다 바이러스의 낮은 농도를 가질 것으로 예상되지만, 19, 20 일분석 시료의 전자 량의 차이에 대한 일부 보상 지표수의 다섯 배이다. 적은 복제의 사용은 대부분의 지표수에 적합 수 있지만 일부는 샘플 희석이 필요합니다. 방법 1615 여러 가지 중요한 단계 및 제한 사항이 있습니다. 쇠고기 추출물은 많은에서 많이 다릅니다. 설명이 보충 자료 섹션 S2.3와 같이 각 많은 바이러스 용출의 효율성과 보조 농도 단계를 통해 바이러스 농도의 용량을 테스트해야합니다. 상기 방법은 BGM 세포 배양에 접종하고, 바이러스 역가를 결정하는 시료의 양을 계산하기위한 정확한 식을 사용한다. 이러한 수식을 엄격하게 준수하지 않을 경우 부정확 한 결과가 생성됩니다. 적절한 무균 기술은 세포 배양을 유지하기 위해 사용되어야한다. 14 일의 배양 기간 동안 곤란을 표시 BGM 비감염 세포 배양 제어 가능성 세포 배양 정비 문제를 나타낸다. 큰 관심은 따해야합니다현의 접종 및 교차 오염을 방지하기 위해 세포 배양 플라스크에 매체 추가와 관련된 단계를 피펫 팅시. 보충 자료 섹션 S2에 기술 된 품질 관리가 엄격하게 따라야합니다. 제 S2는 품질 문제에 대한 문제 해결 조언을 제공합니다. 필터를 전기 양성하는 바이러스 흡착 기본 메커니즘은 필터의 양전하의 강도 및 등전점 관련 바이러스 &#39;음전하의 강도와 21 테스트되는 물의 pH 관련된 전하의 상호 작용이다. 필터로부터 용출은 이러한 상호 작용의 강도에 의해 영향을 받는다. 그들은 바이러스 유형 사이에도 동일한 타입 내 균주 중에서 다르기 때문에 필터로부터 용출이 균일하지 않다. 이 모든 결과는 환경 물에 존재하는 바이러스의 실제 수준을 과소 평가 수 있다는 것을 의미한다. 단일 BGM 세포주의 사용은 바이러스 발생을 과소. 범위주로 polioviruses 및 엔테로 바이러스 B 종의 혈청 형뿐만 아니라 일부 reoviruses 14,15,22에 제한이 셀 라인에서 CPE를 생성 할 수 있습니다 장내 바이러스. 기타 감염성 바이러스 유형이 검출 될 수 없다. 지상 및 시약 등급의 물에서 폴리오 바이러스 복구는 모두 성과 평가 (PE에 대한 USEPA 방법 1615 성능 판정 기준을 충족, 즉, 시작하기 전에 분석의 성능을 평가하는 데 사용됩니다 애널리스트 알 수없는 역가와 시드 시약 등급의 물 샘플 연구) 및 LFB 샘플 (보충 자료 표 S1)의. 배양 절차에 지하수 중 58 % 회수 수돗물 (23, 24)를 사용하여 다른 사용자에 의해보고 된 것과 유사하다. 변동 계수가 100 % (CV) 111 %로 LFB 샘플의 평균 회복도가 PE 샘플에 대해 관찰 된 것보다 더 높은 경우에도있어서 성능 판정 기준을 충족 DURICR을 보내고. ICR은 평균 intralaboratory 회수율이 85 % (상기 ICR PE 데이터베이스에서 게시되지 않은 데이터 이력서 58 131 %)로 36까지 변화하면서 실험실 간 복구는 92 %의 편차 (CV)의 계수가 56 %이었다 의미한다. 높은 회수율 높은 종자 샘플 (1백22퍼센트 42 대)보다 낮은 시드 LFB 샘플에 대한 본 연구에서 관찰되었다. ICR가 계획 될 당시에, 그것은 낮은 시드 값을 수신 PE 샘플은 그 높은 종자를 수용하는 것이 낮은 회복했을 것으로 예상되었다. LFB 샘플 여기 관찰 된 것과 유사한, ICR PE 샘플에 대한 폴리오 복구 시드 값 (CV, 100 %), 54 % (CV 69 %) 및 ​​44 % (CV 71 %) 71 %였다 ≤300 MPN, 300- 각각 1,500 MPN, 및&gt; 1500 MPN. 물 샘플 25 전염성 바이러스를 측정하기위한 많은 방법이있다. 이 방법은 표준화의 정도에 다른 방법에 관하여 중요하다. 표준화, 품질 및 성능 컨트롤이 포함뿐만 아니라,뿐만 아니라 모든 분석 실험실은 동일 방법을 수행하도록 정의 된 볼륨과 수식을 사용합니다. 표준화 없이는 실험실에 걸쳐 결과를 비교하는 것은 곤란하고, 복수의 분석 실험실에서 대규모 연구를 수행 할 때, 따라서 표준화가 필수적이다. 내장 표준화이 방법은 추가로 바이러스 유형 및 세포주를 포함하는 미래에 확장 할 수있다. 연구 방법에 아데노 바이러스를 포함하기 위해 데이터를 제공하는 것.

A correction was made to: <a href="www.jove.com/video/52437">EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay</a>. The values for Reagent Grade Water shown in Figure 2 were changed from a mean value of 111% with a standard error of 8% to a mean value of 82% with a standard error of 26%.
The penultimate sentence of the last paragraph of the Representative Results section was changed from:
 These controls performed similarly with a mean recovery of 111% and a coefficient of variation of 100% (Figure 2), 
 
 to: 
 
 These controls had a mean recovery of 82% and a coefficient of variation of 110% (Figure 2).
 
The third sentence of the fourth paragraph of the Discussion section was changed from:
 The mean recovery from the LFB samples of 111% with a coefficient of variation (CV) of 100% also met the method performance acceptance criteria even though they are higher than that observed for PE samples during the ICR, 
 
 to: 
 
 The mean recovery from the LFB samples of 82% with a coefficient of variation (CV) of 110% also met the method performance acceptance criteria even though they are higher than that observed for PE samples during the ICR.

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Erratum: EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay

장 바이러스는 인간의 장 시스템을 감염 및 분변 - 경구 경로를 통해 전송되는 바이러스의 다양한 그룹입니다. 이 바이러스는 하수 처리장 및 오수 정화조 폐수, 잘못 설계되거나 깨진 정화조, 깨진 하수도, 결합 하수 오버 플로우 및 기타 점과 비점 원 1-4을 통해 표면 및 지상 물을 입력합니다. 수 인성 바이러스의 인간 감염과 질병은 오염 또는 부적절하게 소독 물 소비를 통해 또는 레크리에이션 물 접촉을 통해 발생합니다. 질병 증상이 심한 위장염에 가벼운 포함 할 수있다; 결막염; 열; 상부 호흡 곤란; 수족구 병; 심근염; 무균 성 뇌막염; 뇌염; 마비; 패혈증 5-8, 죽음 9,10. USEPA 방법 1615 환경 마시는 물에서 감염 장내 바이러스 입자를 측정하는 절차를 제공합니다. 이 물은 포함 할 수 있습니다감염성 및 비 감염성 비리의 혼합물,하지만 전염성 입자는 잠재적 인 건강 위험을 포즈. 감염성 바이러스 입자로 인해 11 ~ 13 존재할 수있는 소독제로 단백질 캡시드의 무결성 인해 자외선 광선 방사선 손상에 핵산 손상의 손실, 환경, 마시는 물에서 시간이 지남에 감염을 잃게됩니다. 상기 방법에서 제공되는 전체 바이러스 배양 절차는 버팔로 녹색 원숭이 신장 (BGM) 세포주에서 세포 변성 효과 (CPE)의 제조에 기초한다. 이 세포주는 검출 된 감염성 바이러스 유형의 범위가 특정 엔테로 15 주로 제한 되더라도 때문에 환경 바이러스학 분야 14,15에서의 광범위한 사용으로 선택되었다. 이 논문의 목적은 다섯 인치 전기 양성 카트리지 필터의 용출, 보조 농도, 총 배양 바이러스의 측정 방법 1615의 절차를 설명하는 것입니다. 의 평가전체적인 방법은 Cashdollar 외. (16)에 대하여 설명한다.

<table><tbody><tr><td>쇠고기 추출물, 건조 분말</td><td>BD Bacto</td><td>211520</td><td></td></tr><tr><td>극저온 튜브</td><td>Thermo Fisher</td><td>3775/945373</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s 균형 잡힌 염 용액</td><td>Invitrogen</td><td>14170-112</td><td></td></tr><tr><td>기계식 잠금 플랫폼</td><td>Daigger</td><td>EF4907G</td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-285-729</td><td></td></tr><tr><td>프리필터가 있는 살균 필터</td><td>VWR</td><td>28143-295</td><td></td></tr><tr><td>살균 주사기 필터</td><td>Corning</td><td>431219</td><td></td></tr><tr><td>pH 표준물질</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33643, 33646, 33648</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1018 또는 M4642</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz L-15</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4386</td><td></td></tr><tr><td>중탄산나트륨, 7.5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8761</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Invitrogen</td><td>10082-139</td><td></td></tr><tr><td>항생제-항진균</td><td>생명 기술</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>트립신, EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200072</td><td></td></tr></tbody></table>

엔테로 바이러스 및 문화 rt-qpcr에 의해 물에서 노로 바이러스의 발생의 epa 방법 1615 측정. ii. 총 배양 가능한 바이러스 분석

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay

환경 및 음용수에서의 바이러스 발생에 대한 국가 연구가 여러 분석 실험실을 활용할 때 표준화된 방법이 필요합니다. 미국 환경보호국(USEPA)의 Method 1615는 이러한 수역에서 엔테로바이러스와 노로바이러스를 측정하기 위한 표준을 제공하는 것을 목표로 개발되었습니다. 바이러스는 전기 양성 필터를 사용하여 물에서 농축되고 쇠고기 추출물로 필터 표면에서 용출된 다음 유기 응집을 사용하여 더 농축됩니다. 여기에서는 필터 용출, 2차 농도 및 총 배양 가능한 바이러스의 측정을 위한 Method 1615의 프로토콜을 제시합니다. 각 샘플의 농축된 용리액 일부를 Buffalo Green Monkey 신장 세포의 복제 플라스크 10개에 접종합니다. 세포병성 효과를 나타내는 플라스크의 수는 리터당 감염 단위의 가장 가능성 있는 수(MPN)를 정량화하는 데 사용됩니다. 이 방법은 여러 가지 품질 관리를 사용하여 데이터 품질을 높이고 실험실 간 및 실험실 내 변동을 줄입니다. 실험실은 정의된 성능 표준을 충족해야 합니다. 방법 1615는 사빈 소아마비 바이러스 3형이 파종된 시약 등급 및 지하수에서 바이러스 회수를 검사하여 평가되었습니다. 총 배양 가능한 분석법에서 소아마비 바이러스가 회수된 평균 비율은 시약 등급의 물에서 111%, 지하수에서 58%였다.

바이러스는 세 식수 처리장 전용 잘 이용한 전기 양성 필터의 소스 지하수에서 농축시켰다. 필드 샘플 LFSM 제어 이루어진 두 개의 샘플 세트는, 차례에 처리장에서 수집하고, 하나의 샘플 세트는 전용 웰로부터 수집 하였다. 각 샘플에 사용되는 종자의 MPN 값이 정확하게 때문에 판단 할 수 없기 때문에 전체 바이러스 복구는 계산에서 제외 된 식물과 민간 아니라 (한 식물과 서로 하나의 샘플에서 두 샘플의 두에서 LFSM 샘플을 사용하여 측정 하였다 복제 플라스크 중 이상 CPE 결과)에. 지하수 샘플에서 소아마비 바이러스의 회복을 의미한다 (그림 2) 16 79 %의 변동 계수가 58 %의 평균. 배양 가능한 바이러스 복제 시드 화 지하수 필드 표본에서 검출되지 않았다. 방법의 성능은 LFB (S)로 측정 하였다amples 두 가지 시드 수준​​을 사용하여 개질. 폴리오 바이러스의 1000 MPN은 상기 성능을 테스트하는데 사용 하였다 폴리오 300 MPN의 A &quot;LOW&quot;역가 USEPA 방법 1615 A​​ &quot;높은&quot;역가에서 사용되는 &quot;표준&quot;500 MPN LFB 레벨 미만 수준의 성능을 평가 하였다 LFSM 제어의 수준입니다. 이러한 컨트롤 111 %의 평균 복구 및 100 %의 변동 계수 (그림 2)와 유사하게 수행 하였다. 모든 LRB 샘플은 음성이었다 모든 LFB 샘플 수용 범위 (보충 자료 표 S1) 내에서 수행. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52437/52437fig1.jpg" /> 도 1 필터 용출. 카트리지 필터 용출하는 압력 용기를 사용하는 개략도가 도시되어있다. 양의 공기 압력이 카트리지 하우징 콘 통해 압력 용기 비프 엑기스 용액을 밀어 사용전기 양성 카트리지 필터 이닝. 펌프의 유입구는 쇠고기 추출액 채 컨테이너에 배치되면서 연동 펌프는, 압력 용기로 대체 될 수있다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52437/52437fig2.jpg" /> 지상에서 그림 2. 평균 폴리오 바이러스 복구 (%) 및 시약 급 물. 평균 회수율은 지상에서 소아마비 바이러스에 대해 표시됩니다 ( <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52437/52437fig3.jpg" /> ; N = 4), 시약 등급의 물 ( <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52437/52437fig4.jpg" /> ; 여기서 n은 = 12) 샘플. 열두 시약 등급의 물 샘플 여섯이 소아마비 바이러스의 1,000 MPN 시드 300 MPN 여섯 시드 포함되어 있습니다. 오차 막대는 표준 오류를 나타냅니다.

여기에서는 Buffalo Green Monkey 신장 세포주를 사용하여 총 배양 가능한 바이러스를 측정하는 절차를 제시합니다. 이 절차는 환경 및 음용수에서 감염성 바이러스의 발생을 측정하기 위한 표준화된 도구를 제공합니다.

엔테로 바이러스 및 문화 RT-qPCR에 의해 물에서 노로 바이러스의 발생의 EPA 방법 1615 측정. II. 총 배양 가능한 바이러스 분석

A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. ...

다음 프로토콜의 전반적인 목적은 수중 샘플 내의 감염성 바이러스 입자 수치를 측정하는 것입니다. 이는 알칼리성 추출 용액을 사용하여, 식수 또는 환경수에서 바이러스가 농축된 양전하 필터로부터 음전하를 띤 바이러스 입자를 용출시킴으로써 달성됩니다. 양전하 카트리지 필터로 바이러스를 수집하는 과정은 이 시리즈의 파트 1에서 다룹니다.두 번째 단계로, 용출액의 pH를 천천히 낮추면 시료 내에 존재하는 추출 단백질과 바이러스가 응집되어 플록(flock)을 형성하게 됩니다. 그 후 원심분리를 통해 이 플록을 수집하고, 인산나트륨 완충액에 용해시킨 후 여과 멸균하여 박테리아와 곰팡이를 제거합니다. 다음으로, 최종 농축된 용출액을 버팔로 그린 몽키 신장 세포에 접종하고, 바이러스 복제 여부를 검출하기 위해 14일 동안 세포병성 효과(cytopathic effect, CPE)를 관찰합니다.세포 관련 바이러스 입자를 방출시키기 위해, 14일이 종료되거나 어느 플라스크에서든 CPE가 75% 이상으로 나타나면 모든 세포 플라스크를 동결합니다. CPE가 바이러스 복제로 인한 것임을 확인하기 위해 2차 및 3차 계대를 수행한 후, 최확수(Most Probable Number) 또는 MPN 계산기 프로그램을 사용하여 분석된 각 샘플 리터당 최확수를 결정합니다. 최종적으로, EPA Method 1615의 총 배양 가능 바이러스 산 성분은 수질 샘플 내 감염성 바이러스 입자의 수준에 대한 측정값을 제공합니다.이 총 바이러스 분석법은 EPA Method 1615의 한 구성 요소입니다. 전체 분석법은 식수 및 환경수 내의 엔테로바이러스와 노로바이러스의 발생 빈도를 측정합니다. 검출된 바이러스 결과는 식수 및 레크리에이션 용수 내의 이러한 바이러스 노출에 따른 위험도를 측정하기 위한 입력 데이터로 사용될 수 있습니다.이 프로토콜의 주요 장점은 수중 바이러스 측정을 위한 단일 표준화된 접근 방식을 제공한다는 점입니다. 이 방식은 실제로 1996년에 발표된 정보 수집 규칙(Information Collection Rule) 방법을 기반으로 합니다. 이 방법을 처음 접하는 사람들이 겪는 주요 문제는 BGM 세포주를 오염 없이 유지하는 것과 CPE(세포병변효과)를 판독하는 것입니다.Shay Fout과 제가 용출 및 유기 응집 절차를 시연한 후, 세포 배양 기술에 대해 설명하겠습니다. 첫 번째 용출을 수행하려면, 실온의 pH 9.0 1.5% 소고기 추출물 완충액 500 milliliters를 메스실린더에 넣으십시오. 그런 다음, 필터 카트리지 하우징을 열고 전기 양전하 필터가 완전히 잠길 정도로 충분한 양의 소고기 추출물을 추가하십시오.남은 소고기 추출물을 비커에 넣습니다. 필터 하우징 뚜껑을 다시 닫습니다. 1분 동안 접촉시킨 후, 연동 펌프와 멸균 튜브를 사용하여 비커에 남아 있는 용액을 포함하여 하우징 내의 소고기 추출물 용액을 필터를 통해 천천히 통과시킵니다.용출액을 멸균된 2리터 유리 비커에 수집합니다. 접촉 시간을 15분으로 하여, 1.5% 완충 소고기 추출액 500밀리리터를 추가로 사용하여 이 단계들을 반복합니다. 두 번째 용출 과정에서 얻은 소고기 추출액을 첫 번째 용출액이 담긴 2리터 비커에 합치고, 비커에 멸균된 마그네틱 바를 넣습니다.용출액이 담긴 비커를 교반기 위에 놓습니다. 교반기를 켜고, 소용돌이가 형성될 때까지 교반 속도를 높입니다. 1.2 M 염산(HCl)을 한 방울씩 첨가하여 용출액의 pH를 3.5 ± 0.1로 천천히 조절합니다.산(acid)을 빠르게 첨가하면 바이러스가 불활성화되므로 한 방울씩 천천히 첨가하십시오. 이 과정에서 침전물이 형성되기 시작하면서 용출액이 탁해집니다. 혼합 속도를 느린 교반 상태로 줄이고, 실온에서 30분 동안 용출액의 pH를 3.5 ± 0.1로 모니터링하며 유지하십시오.그다음, 침전된 소고기 추출액 현탁액을 하나 이상의 원심분리 병에 붓고, 4 °C에서 2,500 ×g로 15분 동안 원심분리합니다. 원심분리기로부터 병을 꺼내고, 펠릿 형태의 침전물이 손실되지 않도록 상층액을 천천히 따라냅니다. 상층액은 폐기해도 됩니다.5분 이내에 용해되는 소고기 추출물 로트의 경우, 침전물이 포함된 원심분리 병에 30 milliliters의 0.15 molar 인산나트륨(pH 9.0)을 첨가합니다. 5분 이내에 용해되지 않는 침전물을 용해하는 방법은 텍스트 프로토콜을 참조하십시오. 침전물이 완전히 용해된 후 10분 동안 교반합니다.다음으로, 마그네틱 바를 제거하고 용해된 침전물을 4°C에서 4,000 ~ 10,000 ×g로 10분 동안 원심분리합니다. 펠릿이 섞이지 않도록 주의하며 상층액을 유리 비커에 붓습니다. 비커에 마그네틱 바를 넣고 펠릿은 폐기합니다.비커를 마그네틱 스터러 위에 놓고 용액을 교반합니다. pH가 7.0에서 7.5 사이가 되도록 1.2 molar HCl을 한 방울씩 첨가합니다. pH 7.0에서 7.5의 완충된 1.5% beef extract 15 milliliters로 전처리된 프리필터가 포함된 멸균 필터를 통과시켜 상층액을 여과 멸균합니다.모든 테스트 샘플에 대한 분석 샘플 부피(S)를 계산하려면 텍스트 프로토콜을 참조하십시오. 그런 다음 S를 10으로 나누어 접종액 부피를 계산하십시오. 이 계산 값을 사용하여, 필터 멸균 후 얻은 최종 농축 샘플 부피를 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세 개의 하위 샘플로 나누십시오.각 테스트 샘플에 대해 BGM 세포 단층이 포함된 10개의 테스트 용기에 Inoculum Volume과 동일한 양의 서브 샘플 1과 총 배양 가능 바이러스 정량 분석 대조군을 접종합니다. 실험실 강화 공시료(Lab Fortified Blank) 및 실험실 강화 샘플 매트릭스(Lab Fortified Sample Matrix)의 경우, 서브 샘플 3과 희석제인 0.15 molar 인산나트륨(pH 7.0 ~ 7.5)을 사용하여 5배, 25배 및 125배 희석액을 준비합니다. 희석되지 않은 서브 샘플 1을 접종한 용기 외에, 각 희석 시리즈당 10개의 세척된 세포 배양 테스트 용기에 각각 Inoculum Volume만큼 접종합니다.용기를 앞뒤로 기울여 세포 단층 표면에 접종물을 골고루 분산시킵니다. 분당 1~5회 진동하는 기계적 로킹 플랫폼 위에서 또는 15~20분마다 용기를 흔들어 주며 실온에서 80-120분 동안 배양하여 존재하는 바이러스가 세포에 흡착되도록 합니다. 그 후, 테스트 용기에 미리 데워둔 유지 배지를 첨가하고 36.5±1°C에서 배양합니다.처음 3일 동안은 현미경을 사용하여 각 시험 용기에서 세포병변효과(cytopathic effects)의 발현 여부를 관찰하고, 이후 14일까지 2~3일 간격으로 검사합니다. 세포병변효과가 75% 이상 나타나는 시험 용기는 -70°C 이하로 설정된 냉동고로 옮깁니다. 마지막 날에 용기 검사를 마친 후, 남은 모든 배양액과 총 배양 가능 바이러스 정량 분석 대조군을 -70°C 이하에서 냉동 보관합니다.그런 다음, 모든 배양물을 해동하고, CPE 양성 반응을 보인 모든 테스트 용기에서 배지의 15% 이상을 0.2 micron 멸균 필터로 여과합니다. 다음 단계는 세척된 BGM 신장 세포 테스트 용기를 사용하여 모든 1차 계대 테스트 용기의 2차 계대를 수행하는 것입니다. 이를 위해, 모든 음성 테스트 용기에서 해동된 배지와 양성 용기에서 여과된 배지를 각각 10%의 접종량으로 새로운 테스트 용기에 접종합니다.첫 번째 계대에서 수행한 단계를 반복하며, 첫 번째 계대에서는 음성이었으나 두 번째 계대에서 양성으로 나타난 모든 시험 용기를 냉동 보관하십시오. 그 후, 음성 분석 대조군과 첫 번째 계대에서 음성이었다가 두 번째 계대에서 양성이 된 세포 배양물만을 사용하여 두 번째 계대와 동일한 방법으로 세 번째 계대를 수행하십시오. 첫 번째와 두 번째 계대 모두에서 세포변성효과(cytopathic effects)가 나타난 개별 시험 용기, 또는 두 번째 계대까지 세포변성효과가 나타나지 않은 경우에는 두 번째와 세 번째 계대 모두에서 효과가 나타난 용기를 바이러스 양성으로 판정하십시오.텍스트 프로토콜에 설정된 기본 프로그램 설정을 사용하여 미국 환경보호청(U.S. Environmental Protection Agency)의 최확수(Most Probable Number) 계산기로 모든 테스트 샘플의 바이러스 역가를 계산하십시오. 그다음, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 밀리리터당 감염 단위의 최확수로 얻은 값과 밀리리터당 상한 및 하한 신뢰 한계를 사용하여 리터당 감염 단위의 최확수 및 해당 신뢰 한계를 계산하십시오. 분쇄 및 시약 등급 물 샘플에서 얻은 Poliovirus의 평균 회수율이 표시되어 있습니다.지하수 샘플로부터의 평균 Poliovirus 회수율은 변동 계수 79%와 함께 평균 58%였습니다. 바이러스를 접종하지 않은 중복 지하수 현장 샘플에서는 배양 가능한 바이러스가 검출되지 않았습니다. 또한, 두 가지 다른 접종 수준을 사용하여 수정된 실험실 강화 공시료(Lab Fortified Blank) 샘플을 통해 방법의 성능을 측정하였습니다. 12개의 시약 등급 수질 샘플에는 300 MPN의 감염성 단위가 접종된 샘플 6개와 1,000 MPN의 Poliovirus 감염성 단위가 접종된 샘플 6개가 포함되었습니다.이들 대조군은 평균 회수율 111%와 변동 계수 100%로 비슷하게 수행되었습니다. 이 절차를 수행할 때는 샘플의 오염을 방지하기 위해 무균 조작법과 우수 실험실 실무(GLP)를 준수하는 것이 중요합니다. 또한 바이러스성 병원체를 다룰 때는 이 절차를 수행할 때마다 장갑 착용과 같은 예방 조치를 취해야 함을 기억하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청한 후에는 바이러스 희석 및 양전하 필터 사용법, 유기 응집 및 세포 배양 분석 수행 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.이 절차 외에도, 추가적인 바이러스 유형을 식별하고 검출하기 위해 분자 분석을 수행할 수 있습니다.

epa-method-1615-measurement-enterovirus-norovirus-occurrence-water

Research

연구

JoVE Journal

Environment

환경

Source: Fout, G. S., Cashdollar, J. L. EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the use of a total culturable virus assay to quantify infectious viruses in water samples. It outlines host cell inoculation, observation of cytopathic effect, and statistical quantification of infectious virus concentration.

Quantifying Infectious Viruses in Water Samples Using an In Vitro Total Culturable Virus Assay

EPA Method 1615는 전기 양성 필터를 사용하여 엔테로바이러스와 노로바이러스를 환경 및 음용수에 농축합니다. 이 원고는 Method 1615 분석을 위한 샘플 수집 절차를 설명합니다.

엔테로 바이러스 및 문화 RT-qPCR에 의해 물에서 노로 바이러스의 발생의 EPA 방법 1615 측정. 바이러스 샘플의 I. 컬렉션

여기에서는 역전사-정량적 PCR을 사용하여 환경 및 음용수에서 엔테로바이러스와 노로바이러스를 정량화하는 절차를 제시합니다. EPA Method 1615의 표준화된 절차를 통해 지하수에서 바이러스가 회수되는 평균 비율은 소아마비 바이러스의 경우 20%, 쥐 노로바이러스의 경우 30%였다.

엔테로 바이러스 및 문화와 RT-qPCR에 의해 물에서 노로 바이러스의 발생의 EPA 방법 1615 측정. 파트 III. RT-qPCR에 의한 바이러스 검출

환경적으로 단단한 표면에서 노로바이러스를 검출하고 정량화하기 위해 매크로폼 기반 샘플링 방법론이 개발되고 평가되었습니다.

표면에 인간의 노로 바이러스의 검출을위한 면봉 표본 추출 방법

인간 아데노바이러스의 스파이크를 사용하여 소량의 물 샘플에 대한 최적의 바이러스 농도 조건을 식별하기 위한 접근 방식이 개발되었습니다. 여기에 설명된 기법은 다른 바이러스 표적에 대한 농도 매개변수를 식별하는 데 사용되며 대규모 바이러스 농도 실험에 적용됩니다.

물에서 바이러스 농도에 대한 작은 볼륨 절차

이 원고를 동시에 엔테로 종을 정량화하는 데 사용할 수있는 이중 디지털 PCR 분석. 레크리에이션 바다에서 일반과 인간의 관련 분변 오염의 지표로 HF183 유전자 마커를 설명합니다.

동시 정량을위한 이중 디지털 PCR 분석<em&gt; 엔테로 종.</em&gt;과 바다에서 인간 방패 관련 HF183 마커

우리는 깨끗하고 정확한 물 샘플링을 위한 간단하고 비침습적이며 신뢰할 수 있는 방법인 VacuSIP를 소개합니다. 이 시스템은 미립자 및 용해된 화합물의 제거 및 배설을 깨끗하게 측정하기 위해 저서 현탁액 공급기가 현장에서 흡입 및 내쉬는 물을 동시에 수집하기 위해 개발 및 평가되었습니다.

VacuSIP, 개선 INEX 방법에 대한<em&gt; 현장에서</em&gt; 미립자의 측정 및 용존 화합물은 액티브 서스펜션 피더에 의해 처리

이 문서는 Bemisia tabaci 루프 중재 등온 증폭 (램프) 기술 기반에 대 한 빠른 식별 분석 결과 대 한 프로토콜을 보고 합니다. 프로토콜은 최소한의 실험실 훈련이 필요 하 고 따라서, 항구, 공항 등 식물 수입에 대 한 항목의 지점에서 현장 구현 될 수 있습니다.

루프-중재 등온 증폭 (램프) 분석 결과 Bemisia tabaci 의 빠른 식별

이 프로토콜 tilapia 조직 RT PCR 방법론을 사용 하 여에 Tilapia 호수 바이러스 (TiLV)를 진단 한다. 전체 메서드 총 RNA 추출, cDNA 합성 및 기존의 PCR 또는 양이 많은 PCR dsDNA 염료를 형광 바인딩 바인딩을 사용 하 여 TiLV의 탐지를 조직 해 부에서 설명 되어 있습니다.

Tilapia 호수 바이러스를 사용 하 여 기존의 RT-PCR 및 SYBR의 탐지 RT 정량 그린

15N 추적기 연구를 위한 마이크로플롯 설계는 여러 계절식물 및 토양 샘플링 이벤트를 수용하기 위해 설명된다. 15N분석을 위해 연삭 및 계량 프로토콜을 포함한 토양 및 식물 샘플 수집 및 처리 절차가 제시됩니다.

15개의질소 분석을 위한 마이크로플롯 설계 및 식물 및 토양 샘플 준비

학습하세요 물 샘플에서 감염성 바이러스 입자를 측정하는 EPA 방법 1615의 총 배양 가능한 바이러스 분석 기법을 Buffalo Green Monkey 신장 세포를 이용하여 바이러스 복제를 검출하고 MPN 계산기로 정량화하는 방법입니다.

엔테로 바이러스 및 문화 RT-qPCR에 의해 물에서 노로 바이러스의 발생의 EPA 방법 1615 측정. II. 총 배양 가능한 바이러스 분석

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