전기장에 의한 해제 및 측정 (EFIRM)에 의해 Exosomal 바이오 마커의 검출

본 절차의 전반적인 목표는 생체 유체로부터 엑소좀을 효율적으로 추출하고, 엑소좀 내 화물을 방출시켜 신속하게 분석하는 것입니다. 이는 먼저 엑소좀 마커 타겟팅 항체가 부착된 자성 미세입자를 사용하여 생체 유체에서 엑소좀을 추출한 후, 추출된 엑소좀을 전극 표면에 로딩함으로써 달성됩니다. 다음으로, 전기장을 이용하여 엑소좀을 용해하며, 방출된 엑소좀 화물을 전극 표면의 프로브에 하이브리드화합니다.

리포터 분자 또한 시스템에 하이브리드화됩니다. 마지막 단계는 전극 표면에 기질 용액을 첨가한 후 전류를 측정하여 판독값을 얻는 것입니다. 최종적으로, 전류의 전기화학적 측정을 통해 엑소좀 샘플 내의 핵산 또는 단백질 함량을 확인합니다.

초원심분리와 라이신 완충액을 이용한 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 엑소좀 함량을 추출하고 테스트하는 방법이 간단하고 신속하다는 점입니다. 우리는 이 기술에 대해 매우 기대하고 있는데, 이 efim 기술을 통해 질환 상태나 정상 상태의 장기에서 혈관을 통해 배출되어 구강으로 들어오는 정보를 최초로 활용할 수 있게 되었기 때문입니다. 이 기술을 통해 이러한 정보를 포착하고 분자 함량을 방출시켜 유연한 방식으로 동시에 검출할 수 있습니다.

이 질병 식별 정보와 관련하여, 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 사용자는 주의를 기울이지 않을 경우 자성 미립자 사용에 어려움을 겪을 수 있습니다. 또한, 생물학적 시료 분석에 전기화학적 방법을 사용하는 것이 일부 사용자에게는 새로운 패러다임일 수 있습니다. 자성 미립자의 사용과 전극 로딩 과정을 습득하기 어렵기 때문에 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 자성 미립자를 취급하고 전극에 로딩할 때 특별한 주의가 필요합니다.

먼저 strept adin이 코팅된 자성 마이크로입자가 10 µg/mL 농도로 포함된 스톡 용액을 재현탁하고 5 µL를 취합니다. 비드 세척을 위해 PBS 495 µL가 담긴 마이크로 원심분리 튜브에 해당 용액을 첨가합니다. 우선 튜브를 자성 랙에 1분 동안 세워두고, 비드가 흐트러지지 않도록 주의하며 버퍼를 제거합니다.

그런 다음 튜브를 비자성 랙으로 옮깁니다. 비즈를 세척하기 위해 500 µL의 PBS와 PET를 추가합니다. 마지막 세척 후 재사용할 때까지 이 과정을 총 3회 반복하십시오.

비즈를 490 µL의 PBS에 현탁시킨 후, 1 mg/mL 스탁 용액에서 Biotinylated mouse anti-human CD 63 항체 5 µL를 첨가합니다. 피펫팅으로 용액을 혼합하고, 샘플 로테이터를 90도로 5초간 왕복 회전 및 5도로 1초간 진동하도록 설정합니다. 튜브를 로테이터에 넣고 실온에서 30분 동안 프로그램을 실행합니다.

다음으로, 튜브를 자석 랙으로 옮겨 5분 동안 둡니다. 500 µL의 PBS로 비즈를 세 번 세척한 후, Caine이 포함된 490 µL의 PBS에 다시 부유시킵니다. 튜브에 시료 식별 번호를 표시한 다음, 시료 10 µL를 넣고 여러 번 피펫팅하여 시료를 항체 결합 비즈와 혼합합니다.

다음으로, 튜브를 샘플 회전기에 옮기고 상온에서 동일한 프로그램을 2시간 동안 실행합니다. 그런 다음 1 M tris hydrochloride 완충액 500 µL로 비드를 3회 세척합니다. 자성 랙을 사용하여, 이제 엑소좀이 자성 비드에 결합되어 전극에 사전 코팅됩니다.

먼저 프로브, 염화칼륨, 그리고 올리고 뉴클레오타이드 단량체의 스톡 시약을 증류수에 희석합니다. 5' 말단이 비오틴화된 DNA 프로브는 GAPDH mRNA에 특이적입니다. 단량체 프로브 용액을 볼텍싱하여 섞어줍니다.

각 단위 전극이 베어 골드(bare gold)로 구성된 작업 전극, 상대 전극 및 참조 전극으로 이루어진 16 센서 전극 어레이를 사용하십시오. 전극 간의 교차 오염을 방지하기 위해 전극 어레이 위에 플라스틱 웰을 배치하십시오. 모노머 프로브 용액 60 µL를 골드 전극 표면으로 옮겨 작업 전극, 상대 전극 및 참조 전극이 액체로 덮이도록 하십시오.

단량체 프로브를 전기 중합하기 위해 A-C-S-W-E 필드로 알려진 주기적 사각파 전기장 프로파일을 적용합니다. 이를 통해 전극 표면에 전도성 고분자 층이 형성됩니다. 센서를 증류수로 3회 헹군 다음, 질소 가스로 건조하여 전극 표면의 액체를 제거합니다.

포획 프로브(capture probe)로 전극을 사전 코팅한 후, 1 µM 농도의 검출 프로브(detector probe) 솔루션 5 µL를 비드-엑소좀 복합체 솔루션 495 µL에 첨가하고 피펫팅하여 혼합합니다. 여기서 프로브는 GA dh에 특이적인 3' 말단 플루오레세인(fluorescein) 접합 DNA 프라이머입니다. 사전 코팅된 전극 어레이를 센서의 작업 전극에 맞춰 정렬된 16개의 자석으로 구성된 자석 어레이 위에 배치합니다.

그 다음, 비드 엑소좀 용액 60 µL를 전극 표면에 옮깁니다. A-C-S-W-E 필드를 20 사이클 동안 적용합니다. 방출된 엑소좀 화물이 전극 표면의 프로브와 하이브리드화됩니다.

결합되지 않은 분석물을 제거하기 위해 증류수로 전극 표면을 세 번 헹군 다음, 질소 가스로 전극을 건조합니다. 다음으로, Casein이 포함된 PBS 내에서 anti-fluorescein HRP 접합 항체를 1:1000 비율로 희석합니다. 그다음 항체 희석액 60 µL를 전극 표면에 첨가합니다.

검출 프로브에 anti fluorescein HRP 항체를 접합시키기 위해 전극 표면에 A-C-S-W-E 전장을 가합니다. 증류수로 센서 표면을 3회 세척하여 과량의 항체를 제거한 후, 질소 가스로 전극을 건조합니다. 다음으로, 멀티채널 파이펫을 사용하여 각 센서 표면에 TMB 기질 60 µL를 분주하고, 전기화학 포텐쇼스탯을 이용해 -200 mV에서 60초 동안 전극 전류를 측정합니다.

tric 리드아웃을 얻기 위해 투과 전자 현미경을 사용하여 엑소좀이 자기 비드에 결합되었는지 확인하였습니다. 비드에 부착된 70~100 nm 크기의 과립은 전기장 또는 세제에 의해 용해되었을 때의 엑소좀 기지의 크기와 일치합니다. 비드 주변에서 엑소좀은 관찰되지 않습니다.

엑소좀 내의 GA DH mRNA는 atric 리드아웃으로 검출되었습니다. 전기장 또는 계면활성제에 의한 엑소좀 용해 시, GA DH의 양이 시간이 지남에 따라 예상대로 감소하며, 이는 타액의 엑소좀 외부 환경에 노출되었음을 나타냅니다. 인간 CD 63 GFP 엑소좀 마커를 생성하는 인간 폐암 세포를 주입한 마우스의 혈청 및 타액 내 엑소좀 함량을 측정하기 위해 Efim이 사용되었습니다.

20일 후, 암세포를 주입한 생쥐의 혈청과 타액 모두에서 CD 63 GFP 수치가 높게 나타났으나, 식염수를 주입한 생쥐에서는 그렇지 않았습니다. 이 절차를 수행할 때 주의할 점은, 비드 표면을 균일하게 세척하기 위해 비드를 세척하여 적절한 양의 액체를 추출할 때 비드를 건드리지 않도록 하는 것과, 전극 위에 해당 영역을 적절하게 로딩하는 것입니다. 이 efim 기술은 전신 질환이 있는 원격 장기가 어떻게 정보를 방출하며, 엑소좀이라고 불리는 개체 내에서 이를 계산할 수 있는지에 대한 결정적이고 미충족된 능력을 제공하였습니다.

이들이 어떻게 타액과 구강 내로 유입되어 엑소좀을 포획하고, 분자 표적을 방출하며, 당뇨병, 췌장암 또는 기타 생명을 위협하는 질환들을 동시에 검출할 수 있게 하는지에 대해 설명합니다. 이 영상을 시청한 후에는 생체 시료에서 엑소좀을 신속하게 추출하는 방법, 엑소좀의 화물을 방출하는 방법, 그리고 통합 전극 시스템을 사용하여 엑소좀의 함량을 신속하게 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.