신생아 마우스의 뇌실 영역에 플라스미드 DNA의 트랜스포존 중재 통합 아교 ​​모세포종의 소설 모델을 생성합니다

이 절차의 목표는 교모세포종에 대한 새로운 모델을 만들고 궁극적으로 마우스에서 특정 유전적 돌연변이를 가진 교모세포종의 형성을 유도하여 새로운 치료 접근법을 개발하는 것입니다. 이는 먼저 transposon plasmid를 생성하여 관심 있는 특정 유전자를 암호화함으로써 수행됩니다. 다음 단계는 transfection 시약으로 플라스미드를 준비하고 신생아 마우스의 외측심실에 주입

그런 다음 발광으로 종양 진행의 흡수를 모니터링합니다. 동물이 더 많아지면 조직학적 및 면역조직화학적 분석을 위해 희생됩니다. 따라서, 특이적 유전적 변형을 가진 새로운 교모세포종은 야생형 또는 표적 유전적 배경에서 유도됩니다.

이러한 종양은 in vivo 또는 in vitro를 사용하여 화학요법제를 사용하여 생화학적 분석 및 세포 독성 실험에 적합한 새로운 세포주를 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 교모세포종 세포주의 정소성 주사와 같은 다른 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 매우 특이하게 선택된 유전적 변형을 사용하여 하나의 면역 능력이 있는 동물로 내인성 세포의 악성 변형에 의해 종양이 유도된다는 것입니다. 이 과정은 인간 질병의 병인을 보다 면밀히 재현하고 인간 교모세포종의 두드러진 조직병리학적 특징을 요약합니다.

이 방법은 성인 또는 소아 종양에서 다양한 유형의 교모세포종, 고전적, 전신경성, 신경성 chy를 유발하는 드라이버 돌연변이가 무엇인지와 같은 신경 종양학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 의미는 새로운 화학 요법 이후 GPM 치료로 확장됩니다. 방사선 면역 요법 또는 이들의 조합은 이 모델을 사용하여 생체 내 또는 체외에서 비교적 빠르게 테스트할 수 있습니다.

이 방법에 대한 아이디어는 종양 억제 유전자를 숙주 게놈 DNA에 넣는 억제제인 종양 유전자의 매개적 통합을 사용하여 초기 뇌종양 모델을 개발한 미네소타 대학의 동료 John 박사와 논의했을 때 처음 떠올랐습니다. 실험 3-4주 전에 새로운 돌연변이가 종양 진행에 미치는 영향을 연구하고 뇌종양 표적 치료법을 개발하는 데 도움이 될 것이라고 생각했습니다. 실험 3-4주 전에 수컷 1마리와 암컷 1마리로 구성된 쥐 사육장을 설치하고 환경을 풍요롭게 하고 짝짓기 기회를 늘리기 위해 유색 플라스틱 이글루를 포함시켰습니다. 임신이 확인되면 수컷을 제거하고 짝짓기일 18일 후에 암컷의 출산 모니터링을 시작합니다.

출산 전후에 대리모가 있는지 확인하십시오. 출산 후 첫 날에는 뇌실 주사를 시행합니다. 첫 번째 Ali에 의해 주입 용액을 준비하고, 마이크로리터당 0.5마이크로그램의 DNA의 최종 농도에서 플라스미드에 전치를 포함하는 DNA 믹스 20

다음으로, 20 마이크로 리터의 PEI 용액을 DNA 용액에 분취하고 실온에서 20 분에서 1 시간 동안 배양 한 후 혼합물을 얼음에 보관해야합니다. 주사 바늘의 경우 10 마이크로 리터 주사기를 30 게이지 피하 주사 바늘에 12.5도에서 비스듬히 부착합니다. 그런 다음 자동 주입으로 주사기를 마이크로 펌프에 부착합니다.

10마이크로리터의 물로 설정을 테스트하고 주사기를 비우십시오. 이제 드라이 아이스와 알코올 슬러리로 신생아 입위 무대를 식히십시오. 섭씨 2도에서 8도 사이로 냉각되면 주사를 진행하십시오.

먼저 강아지를 얼음 위에 2분 동안 올려 마취합니다. 강아지가 얼음 위에 있는 동안 주사기에 주사 용액을 넣으십시오. 마취가 끝나면 강아지를 프레임으로 옮기고 거즈로 덮인 이어바 사이에 머리를 고정시킵니다.

두개골의 등쪽이 수평이고 프레임 표면과 평행한지 확인하십시오. 또한 두개골 봉합사가 명확하게 보여야 합니다. 강아지의 머리가 충분히 단단히 고정되지 않으면 주사 중에 움직입니다.

프레임의 이어바 사이에 너무 세게 끼우면 람다가 보이지 않고 머리 내부의 압력으로 인해 주입된 용액이 누출됩니다.강아지가 프레임을 단단히 잡은 상태에서 70% 에탄올로 머리를 닦아낸 다음 바늘을 내리고 람다와 접촉하도록 위치를 조정합니다. 다음으로 바늘을 들어 올려 측면으로 0.8mm, 1.5mm 움직입니다. 그런 다음 피부가 약간 움푹 들어갈 때까지 다시 내립니다.

이 위치의 좌표를 기록합니다. 그런 다음 바늘을 피부와 두개골을 통해 1.5mm 내려 외측 심실의 피질로 넣습니다. 90초 동안 0.75마이크로리터를 주입하고 기다리는 동안 용액이 분산될 때까지 1분 동안 기다립니다.

다음으로 주사할 강아지는 마취할 수 있습니다. 체중을 싣고 나서 바늘을 천천히 올린 다음 강아지를 난방 램프 아래의 회복 위치로 옮깁니다. 마취에서 보온까지의 시간은 10분 미만이어야 합니다.

빠를수록 호흡을 더 잘 모니터링하고 필요한 경우 팔다리를 부드럽게 문질러 호흡을 자극합니다. 강아지가 워밍업되고 장밋빛 색과 안정적인 호흡을 갖게되면 어미에게 돌려줍니다. 이것은 보통 주사 후 5-7분 정도 걸립니다.

여러 마리의 새끼를 주사한 경우 어미에게 돌려주기 전에 모두 회복해야 합니다. 30 분 후에도 모든 새끼가 준비되지 않으면 절반을 그녀에게 돌려주고 나중에 절차가 끝나면 나머지를 반환하고 댐을 모니터링하십시오. 강아지를 돌려보낸 후.

새끼에게 반응하지 않으면 대리모를 케이지에 추가하십시오.주사 후 24-72시간 후에 플라스미드 흡수를 모니터링하고 모든 새끼를 웰당 한 마리의 새끼를 6개의 웰 조직 배양 접시로 옮깁니다. 그런 다음 1밀리리터 주사기에 1밀리리터당 30밀리그램의 루시퍼를 식염수 또는 PBS에 넣고 30게이지 피하 주사 바늘을 부착합니다.

치지 않도록 각 강아지의 견갑골 사이에 30마이크로리터의 용액을 피하로 주입하고 작은 피부 주름 아래에 용액을 주입합니다. 새끼를 즉시 생체 내 생물 발광 이미징 시스템으로 옮깁니다. 시퀀스를 설정하여 1분 간격으로 자동 노출, 큰 베닝 및 1의 조리개로 4개의 연속 이미지를 획득할 수 있습니다. 나중에.

약 17일이 지나면, 동물들은 생물 발광(bioluminescence)과 조직학(histology)으로 감지할 수 있는 거시적 종양을 형성하기 시작할 수 있다. 또한 종양을 모니터링하는 데 최대 6주가 걸릴 수 있습니다. 복강내 100마이크로리터의 루시퍼 용액을 26게이지 바늘로 주입합니다.

3분 후, ISO 불소 산소 마취실에서 동물을 마취하고 원뿔이 장착된 이미징 챔버에 동물을 넣어 ISO 불소를 분산시킵니다. 자동 노출 시간, 중간 비닝, 개방 조리개 F-스톱 1로 2분 간격으로 6개의 이미지 시리즈를 획득할 수 있습니다. 관심 영역은 일반적으로 머리 위의 타원형이며, SB 유도 교모세포종의 조직병리학적 특징을 특성화하기 위해 동일한 설정을 사용하여 각 동물의 발광 강도를 측정했습니다.

C 57 블랙 6 신생아 마우스를 P 1에 플라스미드 및 코팅 루시페라아제를 NRA S 및 SV 40 대형 T 플라스미드 Inod 트랜스포손과 함께 발암성 DNA와 함께 주입했습니다. 대안적으로, PDGF 베타로 짧은 헤어핀 P 53을 인코딩하는 플라스미드 및 GFP 리포터를 NRAS와 함께 주입하였다. 가성 팔리스 괴사(pseudo palis necrosis)가 혈관 주위와 뇌로 확산되는 것과 마찬가지로 분명했습니다.

실질(Parenchyma glioblastomas)도 생물 발광으로 모니터링했습니다. 동물은 일반적으로 종양 부담에 굴복합니다. 발광이 10의 강도에 도달했을 때 7 번째에서 10 9 번째까지 보정 된 단위.

동물의 평균 생존율은 예상대로 신생아 뇌에 주입된 발암성 트랜스포손의 조합에 의존했다. 가장 공격적인 종양은 NRS로 유도되었으며 SV 40 대형 T 항원 de novo 종양은 특징적인 분자의 발현을 특징으로 합니다. SHP 53 및 nras로 유도된 GFP를 발현하기 위해 만들어진 초기 종양은 신경 줄기 세포 마커 neston을 발현했으며 일부는 glio fibrillary acidic protein도 발현했습니다.

56일 후, 수많은 GFAP 양성 성상세포로 둘러싸인 종양이 발견되었습니다. 이러한 종양 세포는 네인(nein)을 발현하지만 GFAP는 발현하지 않았습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 신생아 마우스에 대한 뇌실 주사를 통해 특정 유전적 돌연변이를 품고 있는 교모세포종의 형성을 유도하는 방법과 생물 발광으로 질병의 진행을 모니터링하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이 기사에서는 새로운 트랜스 프로 플라스미드를 쉽게 복제하고, 관심 유전자를 인코딩하는 방법, 종양을 모니터링하고 조직학 및 면역조직화학을 통해 분석하는 방법에 대한 세부 정보를 찾을 수 있습니다. 또한 유전자 조작 종양을 가진 동물에서 새로운 교모세포종 세포주를 생성하는 방법에 대한 자세한 방법을 찾을 수 있습니다. 우리는 이 기사가 이 파괴적인 인간 질병에 대한 새로운 치료법을 발견하는 데 도움이 되기를 바랍니다.