Name: 신생아 마우스의 뇌실 영역에 플라스미드 DNA의 트랜스포존 중재 통합 아교 모세포종의 소설 모델을 생성합니다 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: 배우세요 신생아 마우스 뇌실에 트랜스포존 플라스미드 DNA를 주입하여 유전자 변이를 가진 교모세포종을 유도하는 방법입니다. 이 기술은 종양 진행을 생체 발광으로 모니터링하고 조직학적 분석을 통해 뇌종양 연구에 활용됩니다.

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우리는 플라스미드를 후하게 선물하고 이 방법을 숙달하기 위해 제공된 교육에 대해 John Ohlfest 박사와 Stacey Decker13 박사에게 감사드립니다. 파라핀 함유 절편의 Hematoxylin-Eosin 염색 절차를 표준화하는 데 도움을 주신 Marta Dzaman에게 감사드립니다. 또한 이 원고를 정독하고 유용한 제안을 해 준 Molly Dahlgren에게도 감사드립니다. 이 작업은 MGC 및 PRL에 대한 NIH/NINDS 보조금, MCG 및 PRL에 대한 Leah's Happy Hearts Foundation 보조금의 지원을 받습니다. Alex's Lemonade Foundation young Investigator Award 및 CK에 대한 St. Baldrick's Foundation Fellowship.

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이 글에서, 우리는 세부 사항 신생아 마우스의 뇌실 영역을 주변 세포에 종양 플라스미드 DNA의 SB의 transposase- 매개 통합을 사용하여 GBM의 새로운 모델을 생성하기위한 다양하고 재현하는 방법. 우리가 관심있는 새로운 유전자 트랜스포존 플라스미드를 생성하는 프로토콜을 제시, 살아있는 동물에서 종양의 진행을 모니터링하는 방법, 및 이들의 종양 histo 병리학 및 면역 조직 화학적 특징을 특성화하는 방법을 예시한다. 우리의 실험실로 (그림 3) 등 13 보여,이 모델은 안정적 (1) 의사 palisading 괴사, (2) 혈관 증식, (3) 핵 비정 형성, (4) 이상 유사 분열 등 인간의 GBM의 두드러진 특성을 가진 종양 (작성 5) 혈관 주위 및 확산 침공. 신생아 마우스의 사용은 최소의 장비 및 SE에서 비교적 용이 기술적 절차를 제공하는 관점에서 최적 물류 인특정 유전 적...

수술, 방사선 요법, 화학 요법으로 치료 한 경우 다형성 교 모세포종 (GBM)는 15~21개월의 평균 생존 기간으로, 성인에서 가장 흔한 (60 %) 차 뇌종양이다. GBM에 대한 소설 치료는 필수적이다. 실험 요법 적절히 인간 질병의 두드러진 특징을 재현 동물 모델에서 시험을 요구한다. 설치류 교종 세포주를 사용하여 화학이 알킬화제와 돌연변이 유발, 또는 배아 체세포 유전자 변형, 또는 이식을 포함 GBM의 전략을 유도한다. 가장 일반적으로 사용되는 모델은 뇌 내로 또는 피하로 동일한 유전자형의 동물 세포를 이용하여 동계 어느 동소, 신경 교종 세포주 주입을 채용; 또는 이종 세포는 면역에 이식 가장 일반적으로 인간 GBM 세포주, 마우스 3 손상. 이종 이식은 두개 내 종양의 연구에 많은 장점을 제공합니다 재현성의 편의를 위해, standardized 성장률, 죽음과 종양 현지화의 시간. 의사 pallisading 괴사, 핵 atypias, 미만성 침윤, 미세 혈관의 증식 : 착상하고 정확하게 조직 학적을 재현하는 능력의 한계에 사용되는 인공, 침습 수술 방법으로 인간의 GBM (WHO 4 등급)의 특성을 특징으로 인해 그러나 이러한 모델은 한계를 가지고 및 glomeruloid 혈관의 형성은 4-7 나 비정상. 종양 DNA와, 중 바이러스 벡터 8-12, 또는 트랜스포존 매개 통합 13과 체세포의 게놈을 변경하여 GBM의 유도는 더 밀접하게 인간의 질병의 원인을 재현하고 인간의 GBM의 histo-병리학 적 특징을 되풀이. 역사적으로, 중추 신경계의 종양 분류가 관찰되었다 기원의 인식 셀을 기반으로 한, 생존 (14)에 대한 예측 요인이 될 것입니다. GBMs 기본 및 보조로 분류된다. 신흥 증거 TOD님이 차 아교 모세포종 (15)의 매우 이질적인 성격을 가리키는. 보조 GBM (15 %), 낮은 등급의 성상 세포종 (WHO 등급 I)과 anaplasic 성상 세포종의 악성 변환 결과 (WHO 등급 II), 질병의 초기 발병, 더 나은 예후 및 유전자 발현의 &quot;proneural&quot;패턴과 연관된 차 GBM (85 ​​%) 반면, 발성, 불량한 예후와 아교 (클래식), 신경 또는 중간 엽 발현 패턴을 보여줍니다. 유전자 발현의 이러한 패턴의 유래 종양의 실제 셀과 상관 여부 여전히 활발히 연구되고있다. 데이터를 축적하면 GBMs와 연관된 유전 적 돌연변이의 조합이 생존 예측 것을 보여준다. 예를 들어, 염색체 1P / 19q, IDH1 돌연변이, PDGFRα의 증폭의 heterozygocity의 손실 (LOH)는 EGFR 과발현, 노치와 소닉 고슴도치 경로 활성화 NF-반면, 보조 GBMs, proneural 표현 패턴과 더 나은 예후와 연관된1 PTEN 손실과 p53의 변이는 신경, 클래식, 또는 중간 엽 차 GBM과 나쁜 예후 16, 17과 관련되어있다. 대규모 시퀀싱 프로젝트의 출현 및 테스트에 사용할 수 많은 환자 검체의 축적은 GBM의 발병과 진행 및 치료 특별히 맞출 수있는 개인화 된 의학의 가능성에 연루 유전자 돌연변이 및 경로에 대한 새로운 풍부한 정보를 제공합니다 환자의 유전 적 비정상. 궁극적으로, 이러한 체계적인 방법 및 돌연변이 경로의 예측값을 평가하고, 각각의 경우에 가능한 치료법을 테스트 소정 유전자 변형 동물과 GBM의 모델을 필요로한다. 게놈 DNA의 트랜스포존 매개 통합은 실현 가능한 접근 방식을 제공합니다. 잠자는 숲속의 미녀의 트랜스포존 시스템, 트랜스포존의에 T / 선원 클래스의 멤버는, 다단계 proce을에서 (건설) &quot;깨어&quot;했다휴면보다 10 만 년 전 (18, 19)가 된 salmonoid 트랜스 유전자에서 특정 사이트 돌연변이의 SS. 본질적으로, 특정 시퀀스 (반전 반복 / 직접 반복 : IR / DR)에 의해 측면 DNA 트랜스포존은 잠자는 숲속의 미녀의 트랜스의 활동에 의해 &quot;잘라 내기 및 붙여 넣기&quot;방식으로 게놈에 통합 할 수 있습니다. 트랜스는, IR 사이트의 끝을 인식하는 트랜스포존을 소비세 및 기지 T와 A, 전위 (그림 1a) 동안 트랜스포존의 각 끝 부분에 중복 기지 사이에 다른 DNA 사이트에 무작위로를 통합합니다. 잠자는 숲속의 미녀의 트랜스은 세 가지 영역, 트랜스포존 결합 도메인, 핵 이행 순서와 촉매 도메인으로 구성되어 있습니다. 트랜스 포 분자 함께 트랜스포존의 양단을 가져다 전치 있도록, 트랜스의 너무 많은 분자가 존재하는 경우, 그들은 이량하고 억제하는 데 필요한 tetramerize전위 반응 (20). 효율적인 전위 반응은 트랜스포존에 트랜스의 최적 비율을 필요로한다. 트랜스를 코딩하는 DNA는 (시스)에서 트랜스포존과 같은 플라스미드 또는 (트랜스)에서 상이한 플라스미드 상에 전달 될 수있다. 트랜스와 트랜스포존 간의 최적 비를 확보하기 위해, 충분한 활성을 갖는 프로모터에 대해 (( &quot;CIS&quot;모델) 트랜스의 발현 또는 최적화 될 수 주사액에서 플라스미드의 비율에 대해 선택 될 수있다 &quot;트랜스&quot;모델). 잠자는 숲속의 미녀 transposon의 시스템은 기능 유전체학,에서 삽입 돌연변이 유발, transgenesis 및 체세포 유전자 치료 (21) 성공적으로 사용할 수 있습니다. 합성 구조는 휴면 salmonoid 변형에서 기능성 분자를 재 설계이기 때문에, 잠자는 숲속의 미녀의 트랜스는 사람이나 다른 포유 동물 (20)의 다른 트랜스포존에 결합하지 않습니다. 그 발견 이후, 분자 공학 enhanc있다ED IR 시퀀스 및 TATA 디 ​​뉴클레오티드는, 트랜스포존 측부 PT2 트랜스포존 결과의 변화를 통해 부가 SB 트랜스포존 시스템의 전치 효능. 이러한 트랜스포존 IR 사이트 SB의 결합을 최적화 절개 효능을 증가했다. SB의 트랜스도 상당한 개선을 받았다; 본원에 제시된 실험에 사용은 트랜스 SB100X, 포유 동물 세포에서 22 대규모 유전자 스크린 뒤에 DNA 셔플 전략에 의해 생성 하이퍼 트랜스이다. 이보고에서는 신생 생쥐 (23)의 서브 영역의 심실 세포로의 플라스미드 DNA의 비 바이러스, 트랜스포존 매개 통합 마우스에서 극한 GBM을 유도하는, 급속 다용도 재현 방법을 제시한다. 우리는 잠자는 숲속의 미녀의 트랜스를 사용하여 게놈 통합을위한 의무가 새로운 유전자 트랜스포존을 만들고 플라스미드 흡수를 모니터링하는 방법을 설명하는 간단한 방법을 제시하고생물 발광을 사용하여 질병의 진행. 우리는 또한이 모델 재현 GBM의 조직 학적 및 면역 조직 화학적 기능을 특징. 또, 이들 원발성 종양 GBM 세포주를 생성하는 빠른 방법을 제시한다. 종양 동물에게 원래 세포로부터 유도되는 슬리핑 뷰티 모델은 유도 및 종양 진행에 GBM 후보 유전자의 기능적 역할의 평가를 허용한다. 이 시스템은 또한 잘 로컬 미세 환경을 변경할 수 침습적 염증 수술의 필요없이, 면역 능력이 생쥐의 면역 요법을 포함한 새로운 GBM 치료의 테스트에 적합합니다.

<table><tbody><tr><td>쥐와 마우스 어댑터를 사용한 Stoelting's Lab Standard</td><td>Stoelting</td><td>51670</td><td>다른 회사들도 비슷한 프레임을 생산하며, 그 중 작은 마우스 어댑터를 가진 것이 적합합니다&nbsp;</td></tr><tr><td>Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)</td><td>Stoelting</td><td>53311</td><td>주사는 그것 없이도 만들 수 있지만&nbsp; &nbsp; &nbsp; 자동 주입기는 재현성과 편의성을 높입니다</td></tr><tr><td>10 &Mu; l 700 시리즈 핸드 핏 MICROLITER 주사기</td><td>해밀턴</td><td>모델 701</td><td>이 주사기 모델은 0.5에서 500 ul의 용액을 안정적으로 전달합니다. 다른 syrnges (예 5 ul, 모델 75)도 사용될 수 있습니다</td></tr><tr><td>30 게이지 피하 주사 바늘 (1.25", 15o 베벨)&nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>S/O# 197462</td><td>이 바늘은 다른 침습적 절차 없이 신생아 마우스의 피부와 두개골을 관통하는 데 이상적입니다. 무뎌지면(피부에 쉽게 들어가지 않음) 교체해야 합니다.</td></tr><tr><td>in vivo-jetPEI</td><td>Polyplus Transfection</td><td>201-10G</td><td>분취량은 소량으로 -20 oC&nbsp;</td></tr><tr><td>D-Luciferin, 칼륨 염</td><td>Goldbio.com</td><td>LuckK-1g</td><td>반딧불이 루시피라제의 다른 출처는 마찬가지로 적절합니다</td></tr>. <tr><td>헤마톡실린 용액, Harris Modified</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HHS128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>62550-01</td><td>동결 절제 및 면역조직반미법을 위한 뇌 내장용</td></tr><tr><td>고급 DMEM/F-12, 글루타민</td><td>없음 생명 기술</td><td>12634-010</td><td>신경구 배양을 위해</td></tr><tr><td>B-27&uml; 보충제 (50X), 세럼 프리&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>신경구 배양을 위한 무혈청 보충제</td></tr><tr><td>N2 보충제(100x)</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>신경구 배양을 위한 무혈청 보충제</td></tr><tr><td>Normocyn</td><td>InvivoGen</td><td>ant-nr-1</td><td>신경구 배양을 위한 항마이코플라즈마 제제</td></tr><tr><td>재조합 인간 EGF</td><td>PEPROTECH</td><td>AF-100-15</td><td>&nbsp; 신경구체</td></tr><tr><td>재조합 인간 FGF-basic</td><td>PEPROTECH</td><td>100-18B</td><td>성장 인자 보충제 &nbsp; 신경구체</td></tr><tr><td colspan="4">[헤더]</td></tr><tr><td>HyClone HyQTase&nbsp; 세포 분리 시약&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV3003001</td><td>신경구체의 해리를 위해</td></tr><tr><td>Kimble-Chase Kontes Pellet Pestle</td><td>Fisher Scientific</td><td>K749510-0590</td><td>갓 절제된 종양의 해리를 위해</td></tr><tr><td>Falcon Cell Strainers 메쉬 크기 70 um</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td>해리된 신경구의 단세포 현탁액 생성용</td></tr><tr><td>Xylenes 조직학 등급</td><td>Fisher Scientific</td><td>C8H10</td><td></td></tr><tr><td>프로토콜 Harris Hematoxylin 무수은(산성화)</td><td>Fisher Scientific</td><td>245-678</td><td></td></tr><tr><td>프로토콜 Eosyn Y 솔루션(강화)</td><td>Fisher Scientific</td><td>314-631</td><td></td></tr></tbody></table>

신생아 마우스의 뇌실 영역에 플라스미드 dna의 트랜스포존 중재 통합 아교 ​​모세포종의 소설 모델을 생성합니다

Transposon Mediated Integration of Plasmid DNA into the Subventricular Zone of Neonatal Mice to Generate Novel Models of Glioblastoma

예후가 좋지 않은 성인에서 가장 흔한 원발성 뇌종양인 교모세포종(GBM)의 발병 및 진행에 대한 새로운 유전자의 기여도를 검사하는 것이 시급합니다. 새로운 잠재적 치료법이 빠르게 등장하고 있으며 인간 질병의 두드러진 특징을 밀접하게 재현하는 실험 모델에서 체계적인 테스트가 필요합니다. 본 명세서에서는 신생아 마우스의 심실하 영역의 세포에 플라스미드 DNA의 트랜스포존 매개 통합을 통해 교모세포종의 새로운 모델을 유도하는 방법을 자세히 설명합니다. 잠자는 숲속의 미녀 전이(transposon) 시스템을 사용하여 게놈 통합에 적합한 새로운 전이(transposon)를 복제하는 간단한 방법을 제시하고 생물 발광, 조직학 및 면역 조직화학을 사용하여 플라스미드 흡수 및 질병 진행을 모니터링하는 방법을 설명합니다. 또한 새로운 1차 교모세포종 세포주를 생성하는 방법에 대해서도 설명합니다. 이상적으로, 이 보고서는 뇌종양 연구자들 사이에서 잠자는 숲속의 미녀 트랜스포존 시스템을 더 널리 보급하여 교모세포종 발병 기전 및 진행에 대한 심층적인 이해와 환자를 위한 효과적인 치료법의 적시 설계 및 테스트로 이어질 것입니다.

SB 유도 된 아교 모세포종의 histo 병리학 적 특징을 특성화하기 위해, C57 / BL6 신생아 생쥐 플라스미드 종양 DNA, 즉, NRAS (PT / CAGGS와 트랜스포존을 코딩과 조합 코드하는 플라스미드 루시페라아제 (PT2 / SB100x 뤽)와 P1으로 주입하면서 -NRASV12)와 SV40 LG 텔레콤 (PT / CMVSV40-LGT) (도 3c) 또는 PDGFβ 짧은 머리 핀의 자형으로 p53의와 NRAS (그림 3D와 함께 GFP 기자 (pT2shp53 / GFP4 / mPDGFβ) 암호화하는 플라스미드). 동물 분사 (그림 2a) 다음날 생물 발광을 모니터링하고 주기적으로이 안락사 때 죽어가는 단계에 도달 할 때까지했다. 빈사 단계는 동물이 증상을 보여주는 장애인 이동성, 웅크 리고 자세, 정치 못한 모피와 체중 감량이되는 임상 단계로 정의된다. 때때로, 동물 원과 갑작스러운 점프에서 산책처럼, 발작...

여기에서는 신생아 마우스의 심실에 주입된 트랜스포존 DNA를 사용하여 새로운 교모세포종(GBM)을 유도, 모니터링 및 분석하는 효율적이고 다재다능한 프로토콜에 대해 설명합니다. 플라스미드를 흡수하는 뇌실하부의 세포는 인간 교모세포종의 조직병리학적 특성을 가진 종양을 변형, 증식 및 생성합니다.

신생아 마우스의 뇌실 영역에 플라스미드 DNA의 트랜스포존 중재 통합 아교 ​​모세포종의 소설 모델을 생성합니다

An urgent need exists to test the contribution of new genes to the pathogenesis and progression of human glioblastomas (GBM), the most common primary ...

본 절차의 목적은 마우스에서 특정 유전자 변이를 보유한 교모세포종의 형성을 유도함으로써, 교모세포종의 새로운 모델을 구축하고 궁극적으로 새로운 치료 접근법을 개발하는 것입니다. 이는 먼저 관심 있는 특정 유전자를 인코딩하는 트랜스포존 플라스미드를 제작함으로써 수행됩니다. 다음 단계로는 트랜스펙션 시약으로 플라스미드를 준비하고, 이를 신생 마우스의 외측 뇌실에 주입하는 과정이 이어집니다.종양 진행 과정에서의 섭취는 루미네선스로 모니터링합니다. 동물의 수가 충분해지면, 조직학적 및 면역조직화학적 분석을 위해 희생시킵니다. 이와 같은 방식으로, 야생형 또는 표적 유전자 배경에서 특정 유전적 변이가 있는 새로운 교모세포종을 유도합니다.이러한 종양은 in vivo에서 연구하거나, 화학요법 제제를 이용한 생화학적 분석 및 세포독성 실험에 적합한 새로운 세포주를 생성하기 위해 in vitro에서 사용할 수 있습니다. 교모세포종 세포주를 정위 주입하는 것과 같은 다른 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 매우 구체적으로 선택된 유전자 변형을 사용하여 면역 능력이 있는 한 마리의 동물 내에 존재하는 내인성 세포의 악성 변환을 통해 종양을 유도한다는 점입니다. 이 과정은 인간 질병의 병인을 더 밀접하게 재현하며, 인간 GBM의 두드러진 조직병리학적 특징을 그대로 보여줍니다.이 방법은 성인의 고전적(classical), 전신경(pre-neural), 신경성(neural) 교모세포종 또는 소아 종양에서 서로 다른 유형의 교모세포종을 유발하는 원인 돌연변이가 무엇인지와 같은 신경종양학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 응용 범위는 새로운 화학요법 제제, 방사선 면역 요법 또는 이들의 병용 요법을 이 모델을 사용하여 in vivo 또는 in vitro에서 비교적 빠르게 테스트할 수 있다는 점에서 GBM 치료까지 확장됩니다.저는 처음에 이 방법의 아이디어를 미네소타 대학교의 동료인 Dr.John과 논의하면서 얻게 되었습니다. 그는 sleeping beauty 트랜스포스 매개 통합을 통해 종양 억제 유전자의 억제제인 온코진을 숙주 게놈 DNA에 삽입하여 초기 뇌종양 모델을 개발한 바 있습니다. 저는 이 방법론이 종양 진행 과정에서 새로운 돌연변이의 영향을 연구하고 뇌암의 표적 치료제 개발을 돕는 데 매우 강력한 도구가 될 것이라고 생각했습니다. 실험 3~4주 전에 수컷 한 마리와 암컷 한 마리를 마우스 번식 케이지에 배치하고, 환경을 풍부하게 하여 교배 확률을 높이기 위해 색상이 있는 플라스틱 이글루를 넣어줍니다. 임신이 확인되면 수컷을 제거하고, 교배일로부터 18일 후에 암컷의 분만 여부를 모니터링하기 시작합니다.출산 시기에 맞춰 대리모를 준비하십시오. 출생 후 첫째 날에 뇌실 내 주사를 수행합니다. 플라스미드 상의 transpose가 포함된 DNA 혼합액 20 µL를 분주하여 최종 농도가 0.5 µg/µL가 되도록 주사액을 준비합니다.다음으로, PEI 용액 20 µL 분량을 DNA 용액에 추가하고 실온에서 20분에서 1시간 동안 배양한 후, 혼합물을 얼음에 보관합니다. 주입 바늘의 경우, 10 µL 시린지를 12.5도 경사면을 가진 30게이지 피하 주사 바늘에 부착합니다. 그런 다음 시린지를 자동 주입 기능이 있는 마이크로 펌프에 연결합니다.10 µL의 물로 설정을 테스트하고 시린지를 반드시 비우십시오. 이제 드라이아이스와 알코올 슬러리를 사용하여 신생아용 정위 고정대(stereotaxic stage)를 냉각하십시오. 온도가 2~8 °C 사이로 낮아지면 주입을 진행하십시오.먼저 새끼 쥐를 얼음 위에 2분 동안 두어 마취시킵니다. 새끼 쥐가 얼음 위에 있는 동안 주사기에 주입액을 채웁니다. 마취가 되면 새끼 쥐를 프레임으로 옮기고 거즈로 감싼 이어바 사이에 머리를 고정합니다.두개골의 등쪽 면이 프레임 표면과 수평 및 평행한지 확인하십시오. 또한, 두개골 봉합선이 명확하게 보여야 합니다. 새끼 쥐의 머리가 충분히 단단하게 고정되지 않으면 주입 중에 움직일 수 있습니다.반면 프레임의 이어바(ear bar) 사이에서 너무 세게 조여지면 람다(lambda)가 보이지 않게 되며, 머리 내부의 압력으로 인해 주입된 용액이 밖으로 샐 수 있습니다. 프레임으로 새끼 쥐를 단단히 고정한 상태에서 머리 부분을 70% ethanol로 닦아낸 다음, 바늘을 내려 람다에 닿도록 위치를 조정합니다. 그다음 바늘을 들어 올려 측면으로 0.8 millimeter, 정중선에서 1.5 millimeter 이동시킵니다. 그런 다음 피부가 살짝 들어갈 때까지 바늘을 다시 내립니다.이 위치의 좌표를 기록하십시오. 그런 다음 바늘을 피부와 두개골을 통과해 1.5 millimeters 깊이로 내려, 해당 부위의 외측 뇌실에 있는 피질까지 삽입하십시오. 90초에 걸쳐 0.75 microliters를 주입하고, 용액이 확산될 수 있도록 1분 동안 기다리십시오.다음으로 주사할 새끼 쥐를 마취할 수 있습니다. 체중 측정 후 바늘을 천천히 들어 올린 다음, 새끼 쥐를 가열 램프 아래의 회복 장소로 옮깁니다. 마취부터 보온까지 걸리는 시간은 10분 미만이어야 합니다.호흡 상태를 신속하게 모니터링하고, 필요한 경우 사지를 부드럽게 문질러 호흡을 촉진하십시오. 새끼가 몸을 데우고 혈색이 돌아오며 호흡이 안정되면 어미에게 돌려보냅니다. 이 과정은 보통 주사 후 5~7분 정도 소요됩니다.여러 마리의 새끼에게 주사하는 경우, 어미에게 돌려보내기 전에 모든 새끼가 완전히 회복되어야 합니다. 30분 후에도 모든 새끼가 준비되지 않았다면, 먼저 절반을 어미에게 돌려보낸 뒤 나머지 새끼들은 실험 절차가 모두 끝난 후에 돌려보내고 어미의 상태를 관찰하십시오. 새끼들을 돌려보낸 후입니다.어미 쥐가 새끼들에게 반응하지 않는 경우, 대리모를 케이지에 추가하십시오. 주입 후 24~72시간 후에 플라스미드 섭취 상태를 모니터링하고, 모든 새끼 쥐를 6-well 조직 배양 접시에 웰당 한 마리씩 옮기십시오. 그다음, 1 mL 주사기에 식염수 또는 PBS에 희석한 30 mg/mL의 Lucifer를 채우고 30 gauge 피하 주사 바늘을 부착하십시오.강아지에게 상처를 입히지 않도록 각 강아지의 견갑골 사이 피부를 살짝 집어 올린 후, 그 아래에 용액 30 µL를 피하 주사합니다. 주사 후 즉시 강아지들을 생체 내 생물 발광 이미징 시스템으로 옮깁니다. 자동 노출, 큰 binning 및 조리개 값 1로 설정하여 1분 간격으로 4장의 이미지를 연속적으로 획득하도록 시퀀스를 설정합니다.약 17일 후, 동물에게 생물 발광 및 조직학적으로 검출 가능한 거시적 종양이 형성되기 시작할 수 있습니다. 종양 모니터링에는 최대 6주가 소요될 수 있습니다. 26게이지 바늘을 사용하여 100 µL의 Luciferin 용액을 복강 내로 주입하십시오.3분 후, ISO 플루오린 마취 챔버에서 동물을 마취하고, ISO 플루오린을 분산시키기 위한 원뿔형 장치가 장착된 이미징 챔버에 동물을 배치합니다. 자동 노출 시간, 중간 비닝(medium binning), 조리개 값 F-stop 1의 개방 상태로 2분 간격으로 6장의 이미지를 연속적으로 획득합니다. 관심 영역(ROI)은 일반적으로 머리 위의 타원형으로 설정하며, SB로 유도된 교모세포종의 조직병리학적 특징을 규명하기 위해 동일한 설정을 사용하여 각 동물의 발광 강도를 측정합니다.C 57 black six 신생 마우스의 P 1 단계에 luciferase를 코팅한 플라스미드를 NRAS 및 SV 40 large T 플라스미드와 함께 주입하여 oncogenic DNA가 포함된 Inod transposon을 도입하였습니다. 또는, short hairpin P 53을 인코딩하는 플라스미드를 PDGF beta 및 A GFP 리포터와 함께 NRAS와 병용하여 주입하였습니다. 가성 책상상 괴사(Pseudo palisaded necrosis)가 뚜렷하게 나타났으며, 뇌 내에서 혈관 주위 및 확산성 괴사가 관찰되었습니다.실질 신경교모세포종 또한 생체 발광으로 모니터링하였습니다. 동물들은 보통 종양 부담으로 인해 사망합니다. 발광 강도가 10 to the seventh에서 10 to the ninth calibrated units에 도달했을 때입니다.동물의 중앙 생존 기간은 신생 뇌에 주입된 발암성 트랜스포존의 조합에 따라 예측 가능하게 달라졌습니다. 가장 공격적인 종양은 NRS와 SV 40 large T antigen으로 유도되었으며, de novo 종양은 특징적인 분자의 발현으로 정의되었습니다. SHP 53 및 nras로 유도되어 GFP를 발현하도록 만들어진 초기 종양은 신경 줄기세포 마커인 neston을 발현하였으며, 일부는 glio fibrillary acidic protein 또한 발현하였습니다.56일 후, 수많은 GFAP 양성 성상교세포로 둘러싸인 종양이 발견되었습니다. 이 종양 세포들은 nein을 발현했으나 GFAP는 발현하지 않았습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 신생 생쥐의 뇌실 내 주입을 통해 특정 유전자 돌연변이를 가진 교모세포종의 형성을 유도하는 방법과 생물 발광을 이용하여 질병의 진행 상황을 모니터링하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.본 논문에서는 관심 유전자를 인코딩하는 새로운 trans pro 플라스미드를 쉽게 클로닝하는 방법과 종양을 모니터링하고 조직학 및 면역조직화학법으로 분석하는 방법에 대한 자세한 내용을 확인하실 수 있습니다. 또한, 유전공학적으로 생성된 종양을 가진 동물로부터 새로운 교모세포종 세포주를 구축하는 상세한 방법도 함께 제시되어 있습니다. 본 논문이 이 치명적인 인간 질환에 대한 새로운 치료법 발견을 가속화하는 데 도움이 되기를 바랍니다.

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이 비디오는 신생아 마우스의 심실에 주입된 트랜스포손 DNA를 사용하여 교모세포종(GBM)을 유도하는 효율적인 기술을 설명합니다. 플라스미드를 흡수하는 뇌실하 영역의 세포는 인간 교모세포종의 조직병리학적 특성을 가진 종양을 변형, 증식 및 생성합니다.

SB 매개 전치를 사용한 교모세포종 유도: 신생아 마우스 뇌에 SB 플라스미드의 전이(Transposon) 매개 통합을 사용하여 새로운 마우스 모델을 생성하는 기술

Neuroblast 이주는 출생 후 신경에 근본적인 이벤트입니다. 우리는 급성 뇌 조각의 시간 경과 영상을 사용하여 생체 내 출생의 일렉트로 그들의 이주 이후의 시각화하여 neuroblasts를 효율적으로 표시하기위한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 비디오 추적하여 neuroblast 역학의 정량 분석​​에 대한 설명을 포함한다.

마우스 급성 뇌 조각의 Neuroblast 마이그레이션의 생체 내 출생 일렉트로 및 시간 경과 영상

우리는 종양의 성장하는 동안 재생에 일반적으로 생물 물리학 적 제약 조건을 되풀이되었습니다의 intravital 두 광자 현미경을위한 마우스에서 대뇌 피질의 소성을 glioblastoma의 모델을 설립했다. 종양 위의 두개골을 대체 만성 유리 창에는 두 개의 광자 현미경에 의해 시간이 지남에 따라 종양의 진행을 추적 할 수 있습니다.

소성을 Glioblastoma의 마우스 모델은 뇌 실질 물리적 제약 조건을 유지하고의 intravital 두 광자 현미경에 적합

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두피의 interneurons의 하위 유형 선택적 일렉트로

여기서 우리는 신생아 마우스 뇌에 아데노 관련 바이러스를 뇌실 내 주입하여 광범위한 신경 세포 전달을 위한 기술을 보여줍니다.  이 방법은 바이러스로 전달된 transgenes의 평생 발현을 달성하는 빠르고 쉬운 방법을 제공합니다.

영구와 광범위한 신경 세포의 형질 도입에 대한 신생아 마우스 뇌의 뇌실 바이러스 감염

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분리 및 신경 교종-침투 말초 혈액 단핵 세포의 유세포 분석

두뇌에 있는 유전자의 세포 자치 기능 손실을 유도 하 여 공부 될 수 있다 또는 셀의 스파스 인구에 있는 기능을 얻을. 여기, Cre recombinase 함수 비보의 손실에 floxed 유전자와 대뇌 피 질의 뉴런 개발의 부족 인구에 제공 electroporation utero에서 설명 합니다.

Cre lox 재결합 Electroporation Utero에 통해 마우스 대뇌 피 질에서 유도

레이저 미세 해부 (LMD)는 신경교종 이질성과 침략을 중재하는 통로를 밝히기 위하여 이용될 수 있는 민감하고 높게 재현가능한 기술입니다. 여기에서, 우리는 전사성 분석에 선행된 레이저 LMD를 사용하여 신경교종 조직에서 이산 지역을 격리하기 위하여 최적화된 프로토콜을 기술합니다.

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전임상 테스트를 위해 일반적인 환자 돌연변이에 의해 유도되는 면역 능력이 있는 자가종양 모델을 활용하는 것은 면역 치료 테스트에 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 일반적인 환자 돌연변이를 나타내는 플라스미드 DNA의 전기천공법 기반 전달을 사용하여 뇌종양 마우스 모델을 생성하는 방법을 설명하므로 정확하고 재현 가능하며 일관된 마우스 모델을 제공합니다.

Modeling Brain Tumors In Vivo Using Electroporation-Based Delivery of Plasmid DNA Representing Patient Mutation Signatures(환자 돌연변이 시그니처를 나타내는 플라스미드 DNA의 전기천공법 기반 전달을 사용한 생체 내 뇌종양 모델링)

패혈증은 미생물 감염으로 인한 전신 염증 반응 증후군을 참조하고, cecal 내고 주사 (CLP)을 되나 수술 기법에 의한 시뮬레이션이 될 수 있습니다. 여기 치료 대리인을위한 약초를 구분할 CLP 유발 동물 모델을 사용하는 방법을 설명합니다.

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배우세요 신생아 마우스 뇌실에 트랜스포존 플라스미드 DNA를 주입하여 유전자 변이를 가진 교모세포종을 유도하는 방법입니다. 이 기술은 종양 진행을 생체 발광으로 모니터링하고 조직학적 분석을 통해 뇌종양 연구에 활용됩니다.

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