선충을 사용하여 생식선 화학 독성의 종합 평가

이 실험 절차의 전반적인 목표는 선충 *C. elegans*를 사용하여 생식세포의 화학적 독성을 종합적으로 평가하는 것입니다. 이를 위해 먼저 *C. elegans* PXOL one GFP 균주의 다양한 단계가 섞인 선충 집단에 희석된 표백제 용액을 첨가하여 선충을 동기화합니다. 이 단계를 통해 알껍질에 의해 표백제로부터 보호된 다수의 배아를 얻을 수 있습니다.

두 번째 단계는 먹이가 없는 액체 상태에서 배아를 부화시켜 동기화된 L1 유충 집단을 생성하는 것입니다. 다음으로, 벌레가 4차 유충 단계인 L4까지 성장하면, 액체 상태에서 65시간 동안 대상 화학 물질에 노출시킵니다. 마지막 단계는 벌레의 자궁 내 배아에서 GFP 리포터의 발현을 형광 현미경을 통해 시각화하는 것입니다.

최종적으로, DMSO 대조군과 비교하여 GFP 양성 배아의 비율은 테스트된 화합물의 항원성을 반영합니다. Rodin 모델이나 세포 배양 분석과 같은 기존 방법보다 이 기술이 갖는 주요 장점은, 전신 동물 모델에서 화학 물질의 유전성 및 생식선 독성을 평가하는 동시에 고속 분석법을 통해 해당 절차를 수행할 수 있다는 점입니다. 오늘은 박사후 연구원인 Dr.Daniella Perotti가 진행하겠습니다.

본 절차에 사용된 GR 벌레는 앞서 수반되는 프로토콜 텍스트에 기술된 대로 준비되었습니다. nematode growth medium 또는 NGM 플레이트에서 1~2 mL의 M9으로 세척하여 GR 벌레를 수집한 다음, 15 mL 원심분리관으로 옮깁니다. GR 벌레가 15 mL 원심분리관 바닥에 가라앉을 때까지 약 5~10분 동안 둡니다. 그다음, 벌레 펠릿이 흐트러지지 않게 주의하며 상층액을 제거합니다.

벌레 펠렛을 2~4개의 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고, 각 튜브에 희석된 표백액 1 mL를 추가합니다. 실온에서 2~3분 동안 배양합니다. 실체 현미경으로 반응 과정을 관찰하여 모든 벌레가 죽었는지 확인합니다.

배아가 사멸할 수 있으므로 5분 이상 표백하지 마십시오. 3000 RPM에서 1분 동안 원심분리하여 벌레를 수집하십시오.

상층액을 제거하고 1 mL의 멸균된 M9 용액을 첨가하여 반응을 중화시킵니다. 표백 처리 후 벌레와 접촉하는 모든 재료가 멸균 상태인지 확인하십시오. M9 배지로 벌레를 두 번 세척합니다.

상층액을 제거하고 M9 100~200 µL를 첨가합니다. 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 벌레 M9 혼합액 한 방울을 깨끗한 NGM 플레이트에 접종하고, 배아를 먹이 없이 부화시키기 위해 20 °C에서 최소 24시간 동안 배양합니다. 유충의 성장은 L1 단계에서 중단되며, 이는 두 번의 동기화 단계입니다.

노출 실험에 사용할 L4 유충의 수를 최대화하기 위해서는 고도로 동기화된 충란 집단을 확보하는 것이 매우 중요하므로, 표백 및 L-word 기아 상태를 이용합니다. 동기화된 L1 유충 집단을 구축한 지 하루 후에, 투명한 NGM 플레이트에서 L1 유충을 수집합니다. 1~2 mL의 M9으로 플레이트를 세척하고 L1 유충을 15 mL 원추형 튜브로 옮깁니다.

죽은 성체 웜이 15 mL 원뿔형 튜브 바닥에 가라앉을 때까지 약 5분 동안 방치합니다. L1 웜이 포함된 상층액을 수집하여 새로운 15 mL 원뿔형 튜브에 옮깁니다. 2,600 RPM에서 2분 동안 원심분리하여 웜을 침전시킵니다.

상층액을 제거하여 약 500 µL만 남깁니다. 10 µL 방울 내의 벌레 수를 세어 M9 용액 내의 벌레 농도를 결정합니다. 실체 현미경을 사용하여 최소 5방울을 측정합니다.

M9 용액을 사용하여 벌레의 농도를 µL당 20~25마리로 조정하고, 벌레가 포함된 M9 혼합액 50 µL를 NGM 플레이트에 첨가합니다. 먹이 박테리아인 OP 50이 도말된 플레이트에서 15 °C로 65시간 동안 배양하여, 동기화된 L1 단계의 개체군이 L4 단계에 도달할 때까지 성장하도록 합니다. 이 스크리닝에서는 생식세포주 파괴 및 배아 이배체성 유도를 감지하기 위해 형광 전사 리포터를 포함하는 CL against 균주를 활용합니다.

투명한 NGM 플레이트를 1~2 mL의 M9으로 세척하여 L4 단계의 유충을 수집하고, 이를 15 mL 원심 분리 튜브로 옮깁니다. L4 벌레가 15 mL 원심 분리 튜브 바닥에 가라앉을 때까지 약 5~10분 동안 둡니다. 그 후, 벌레 펠릿이 흐트러지지 않도록 주의하며 상층액을 제거합니다.

M9 용액 3~5 mL를 첨가하고, 10 µL 방울 내의 벌레 수를 세어 M9 용액 내 벌레의 농도를 결정합니다. 실체 현미경을 사용하여 각 샘플당 최소 5방울을 측정합니다. M9에서 벌레의 농도가 1 worms/mL가 되도록 재현탁합니다.

미리 준비한 OP 50 박테리아를 M nine으로 10배 희석합니다. 낮은 온도는 벌레의 발달에 영향을 미치므로 재현탁된 박테리아가 실온에 도달했는지 확인하십시오. 먼저 멀티채널 피펫을 사용하여 2mL 딥 라운드 바텀 96웰 플레이트의 각 웰에 worm M nine 혼합물 100 µL를 첨가합니다. 다음으로, 각 웰에 희석된 OP 50 박테리아 400 µL를 마지막으로 첨가합니다.

각 웰에는 500 µL 내에 100마리의 벌레가 들어갑니다. 최종 농도가 100 µM이 되도록 원하는 웰에 테스트 화학 물질 0.5 µL를 추가하십시오. 이는 CL elgan 화학 스크리닝에서 일반적으로 사용되는 농도입니다. 양성 대조군으로서 최종 농도 0.1%의 에탄올 또는 DMSO 용매 대조군에 노출시키십시오.

cosol이 없는 100 µM 농도를 사용하십시오. 접착 필름을 사용하여 플레이트를 밀봉하십시오. 웰 간의 교차 오염을 방지하기 위해 플레이트를 확실하게 밀봉해야 합니다.

플레이트를 알루미늄 호일로 감쌉니다. 플레이트를 적절한 온도의 셰이커로 옮겨 적당한 시간 동안 반응시킵니다. 셰이커에서의 화학 물질 노출이 완료된 후의 온도 조건이 벌레의 성장에 영향을 미치므로, 실온을 20 °C 정도로 유지하십시오.

성체 웜이 플레이트 바닥으로 가라앉을 수 있도록 96-well 플레이트를 10분에서 15분 동안 그대로 둡니다. 멀티채널 파이펫을 사용하여 각 웰에서 350 µL의 M9을 제거하되, 플레이트 바닥에 있는 웜이 흐트러지지 않도록 주의합니다. 1 mL의 M9으로 웜을 세척하고, 성체 웜이 바닥으로 가라앉을 수 있게 플레이트를 다시 10분에서 15분 동안 그대로 둡니다.

플레이트 바닥에 있는 벌레가 흐트러지지 않도록 매우 주의하며, 각 웰에서 M nine 1 mL를 제거합니다. 남은 M nine 내에서 벌레를 재현탁합니다. 96-웰 플레이트에서 벌레와 M nine 혼합액 100 µL를 수집하여 검은색 벽과 투명한 바닥을 가진 384-웰 플레이트의 웰에 분주합니다.

384웰 플레이트의 모든 웰을 채울 때까지 4개의 96웰 플레이트에 담긴 벌레들을 사용하여 이 과정을 반복합니다. 이미지 획득 과정 중 오토포커스의 효율성과 속도를 높이기 위해서는 모든 웰의 부피를 동일하게 유지하는 것이 중요합니다. 그다음, 각 웰에 1 µL의 lale을 첨가하고 벌레들을 약 30분 동안 배양합니다.

Lale는 아세틸콜린 수용체 작용제로 작용하여 벌레를 고정시키며, 플레이트를 자동 이미징이 가능한 광시야 고함량 현미경으로 옮깁니다. 제조사의 지침에 따라 고함량 이미지 획득 및 분석 소프트웨어를 사용하십시오. 4배 대물렌즈를 선택하여 각 샘플당 하나의 이미지를 획득하십시오.

GFP 이미징 파라미터를 노출 시간 45 milliseconds, 이미지 해상도를 2160 by 2160으로 조정합니다. 이미지 획득을 시작하며, 노출된 worm은 384 well plate에서 직접 이미징합니다. 여기에서 보여주는 것과 같이, 각 well에서 적어도 하나 이상의 GFP 양성 배아를 포함하는 worm의 수를 세고, 이를 해당 well 내의 전체 worm 수로 정규화합니다.

미세소관 독성 물질인 no-code AOL과 같은 화학 제제에 노출시키면 DMSO 대조군에 비해 GFP를 발현하는 배아의 비율이 높게 유도됩니다. GFP 양성 배아는 다른 배아에서 관찰되는 약한 배경 형광 및 동물의 장에서 관찰되는 자가 형광보다 훨씬 더 밝게 나타납니다. 빨간색 화살표는 no-code AOL을 처리한 벌레의 자궁 내에서 뚜렷하게 보이는 GFP 양성 배아를 나타냅니다.

이 절차 이후에는 화학 물질이 생식선에 미치는 영향을 더욱 자세히 관찰하기 위해 벌레의 DNA 염색과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 기술을 통해 독성학 분야의 연구자들은 화학 물질의 생식 독성 및 생식선 독성을 신속하게 평가할 수 있습니다.