선충을 사용하여 생식선 화학 독성의 종합 평가 예쁜 꼬마 선충

이 절차의 전반적인 목표는 선충 C No Haitis elgan을 사용하여 생식계열 화학적 독성을 종합적으로 평가하는 것입니다. 이는 먼저 C Elgan PXOL one GFP 균주의 혼합 단계 웜 집단에 희석된 표백제 용액을 첨가하여 웜을 동기화함으로써 수행됩니다. 이 단계는 난자 껍질에 의해 표백제로부터 보호되는 많은 수의 배아를 생성합니다.

두 번째 단계는 배아가 먹이 없이 액체에서 부화하도록 하여 동기화된 L-one 유충 개체군을 생성하는 것입니다. 다음으로, 기생충은 네 번째 유충 단계 또는 L 네 번째 유충 단계로 성장하며, 이 시점에서 65시간 동안 액체의 관심 화학 물질에 노출됩니다. 마지막 단계는 벌레의 자궁 안쪽에 있는 배아에 있는 GFP 기자의 표정의 형광 현미경 검사법을 통해서 구상하는 것입니다.

궁극적으로, DMSO 대조군과 비교한 GFP 양성 배아의 비율은 테스트된 화합물의 항원성을 반영합니다. 로댕 모델 또는 세포 배양 분석과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 전체 동물 모델에서 화학 물질의 genicity 및 germline 독성을 평가하는 동시에 절차를 수행하는 고처리량 분석을 수행할 수 있다는 것입니다. 오늘은 박사후 연구원 다니엘라 페로티 박사(Dr. Daniella Perotti)입니다.

이 절차를 위한 그래픽 웜은 동반된 프로토콜 텍스트에 설명된 대로 미리 준비되었으며, 선충 성장 배지 또는 NGM 플레이트에서 GR 웜을 1-2ml의 M nine으로 세척하고 15ml 원뿔형 튜브로 옮겨 수집합니다. GR 웜이 15ml 원뿔형 튜브의 바닥으로 약 5-10분 동안 침전되도록 합니다. 다음으로, 웜 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 제거합니다.

웜 펠릿을 2-4개의 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 각 튜브에 1ml의 희석된 표백제 용액을 추가합니다. 실온에서 2-3분 동안 배양합니다. 실체 현미경으로 반응 진행 상황을 모니터링하여 모든 벌레가 죽었는지 확인합니다.

배아가 죽을 수 있으므로 5분 이상 표백제를 사용하지 마십시오. 1분 동안 원심력으로 벌레를 수집합니다. 3000RPM에서.

supernat를 제거하고 1ml의 멸균 M nine을 첨가하여 반응을 중화합니다. 표백제 처리 후 벌레와 접촉하는 모든 물질이 멸균되었는지 확인하십시오. M nine 미디어로 웜을 두 번 세척합니다.

상층액을 제거하고 M 9 - 100 - 200 마이크로리터를 추가합니다. 유리 목초지 피펫을 사용하여 지렁이 M nine 믹스 한 방울을 넣어 NGM 플레이트를 비우고 섭씨 20도에서 최소 24시간 동안 배아를 배양하여 배아가 음식 없이 부화할 수 있도록 합니다. 유충의 성장은 L 1단계 2개의 동기화 단계에서 중단됩니다.

백화(bleaching)와 L word starvation(L 단어 굶주림)이 사용되고 있는데, 그 이유는 노출에 사용될 L 4마리의 유충 수를 최대화하기 위해 고도로 동기화된 따뜻한 개체군을 달성하는 것이 중요하기 때문입니다. 동기화된 L one 유충 개체군이 형성된 지 하루 후, 투명한 NGM 플레이트에서 L one 유충을 수집합니다. 1-2 밀리리터의 M nine으로 플레이트를 세척하고 L one 유충을 15 밀리리터 원추형 튜브로 옮깁니다.

죽은 성충을 약 5분 동안 15ml 원뿔형 튜브의 바닥으로 침전시킵니다. L one 웜이 있는 곳에 상등액을 새로운 15ml 원추형 튜브에 수집합니다. 2, 600 RPM에서 2 분 동안 원심 주입으로 벌레를 침전시킵니다.

약 500 마이크로 리터를 남기고 상등액을 제거합니다. 10마이크로리터 방울에서 벌레의 수를 세어 M nine 용액의 벌레 농도를 결정합니다. 실체 현미경을 사용하여 최소 5방울을 세십시오.

M nine에서 마이크로 리터 당 20-25 개의 웜으로 웜의 농도를 조정 한 다음 50 마이크로 리터의 웜 M nine 믹스를 NGM 플레이트에 첨가합니다. OP 50을 장착한 섭식 박테리아는 섭씨 15도에서 65시간 동안 배양하여 L 1 동기화 개체군이 L 4단계에 도달할 때까지 성장할 수 있도록 합니다. 이 스크리닝은 형광 전사 리포터를 포함하는 균주에 대한 CL을 사용하여 생식세포 파괴 및 배아 이수성의 유도를 감지합니다.

1-2ml의 M nine으로 플레이트를 세척하고 15ml 원추형 튜브로 옮겨 투명한 NGM 플레이트에서 L 4 유충을 수집합니다. L 4 개의 웜이 15 밀리리터 원추형 튜브의 바닥으로 약 5-10 분 동안 침전되도록합니다. 그런 다음 웜 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 제거합니다.

3-5 밀리리터의 M nine을 첨가하고 10 마이크로 리터 방울의 웜 수를 세어 M nine 용액의 웜 농도를 결정합니다. 실체 현미경을 사용하여 각 샘플에 대해 최소 5방울을 카운트합니다. M nine에서 밀리리터당 1개의 웜 농도로 웜을 재현탁시킵니다.

이전에 제조된 OP 50 박테리아를 M nine으로 10배 희석합니다. 낮은 온도가 기생충 발달에 영향을 미치기 때문에 재현탁 박테리아가 실온에 도달하는지 확인하십시오.먼저 다중 채널 피펫을 사용하여 100마이크로리터의 웜 M nine 믹스를 2ml 깊이의 둥근 바닥 96웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 다음으로, 희석된 OP 50 박테리아 400마이크로리터를 끝에 있는 각 웰에 추가합니다.

각 우물에는 500마이크로리터에 100개의 벌레가 있습니다. 0.5마이크로리터의 테스트 화학 물질을 원하는 웰에 추가하여 100마이크로몰의 최종 농도를 달성합니다. CL elgan의 화학 스크린에 일반적으로 사용되는 농도는 최종 농도 0.1%에서 에탄올 또는 DMSO 용매 대조군을 양성 대조군으로 노출시킵니다.

100 마이크로 몰 노 코솔을 사용하십시오. 접착 필름을 사용하여 플레이트를 밀봉합니다. 웰 사이의 교차 오염을 방지하기 위해 플레이트를 잘 밀봉하십시오.

알루미늄 호일로 접시를 감쌉니다. 플레이트를 적절한 온도의 셰이커로 적절한 시간 동안 옮깁니다. 셰이커에서 화학 물질 노출이 완료될 때 온도가 벌레의 성장에 영향을 미치므로 실내 온도를 섭씨 20도 정도로 유지하십시오.

96개의 웰 플레이트를 10-15분 동안 그대로 두어 성충이 다중 채널 피펫을 사용하여 플레이트 바닥으로 침전되도록 합니다. 플레이트 바닥의 벌레를 방해하지 않도록 주의하면서 각 웰에서 M nine 350마이크로리터를 제거합니다. M nine 1ml로 지렁이를 씻고 접시를 다시 10-15분 동안 그대로 두어 성충이 바닥으로 침전되도록 합니다.

각 웰에서 M nine 1ml를 제거하고 플레이트 바닥의 벌레를 방해하지 않도록 매우 주의하십시오. Resus, 나머지 M nine에 있는 벌레를 매달아 놓으십시오. 96웰 플레이트에서 100마이크로리터의 웜 M nine 믹스를 모아 검은색 벽이 투명한 바닥 384 웰 플레이트의 웰에 넣습니다.

384 웰 플레이트의 모든 웰이 로드될 때까지 4,96웰 플레이트의 웜을 사용하여 프로세스를 반복합니다. 이미지 획득 과정에서 자동 초점의 효율성과 속도를 높이기 위해 모든 웰이 동일한 부피를 갖는 것이 중요합니다. 다음으로, 각 웰에 1마이크로리터의 랄레를 넣고 약 30분 동안 벌레를 배양합니다.

Lale은 아세틸콜린 수용체 작용제 역할을 하며 웜을 고정시키고 플레이트를 자동 이미징을 제공할 수 있는 광시야 고함량 현미경으로 전달합니다. 제조업체의 지침에 따라 고함량 이미지 획득 및 분석 소프트웨어를 사용하십시오. 4개의 x 대물렌즈를 선택하여 1개당 하나의 이미지를 획득합니다.

GFP 이미징 매개변수를 45밀리초의 노출로 조정하고 이미지 해상도를 2160 x 2160으로 조정합니다. 이미지 획득 시작: 노출된 벌레는 384개의 웰 플레이트에서 직접 이미징됩니다. 하나 이상의 GFP 양성 배아를 함유하는 웜의 수는 각 웰에 대해 계산되고 여기에 도시된 바와 같이 해당 웰 내의 웜의 총 수에 의해 정규화됩니다.

미세소관 독 no-code AOL과 같은 화학 작용제에 노출되면 DMSO 대조군에 비해 배아를 발현하는 높은 비율의 GFP가 유도됩니다. GFP 양성 배아는 다른 배아에서 관찰된 약한 배경 형광보다 훨씬 밝았을 뿐만 아니라 동물의 장에서 관찰된 자가형광보다 훨씬 밝았습니다. 빨간색 화살표는 코드가 없는 AOL 처리된 기생충의 자궁 내에서 명확하게 볼 수 있는 GFP 양성 배아를 나타냅니다.

이 절차에 따라 생식계에 대한 화학 물질의 영향을 보다 자세히 살펴보기 위해 기생충의 DNA 염색과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 이 기술을 통해 독성학 분야의 연구자들은 화학 물질의 생식 독성 및 생식 세포 독성을 신속하게 평가할 수 있습니다.