Name: 아프리칸 유럽 꿀 꿀벌에 의해 만들어 Beebread의 영양소를 비교하는 방법과하는 Hemolymph 단백질 역가에 미치는 영향 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: 학습하세요 유럽 및 아프리카 꿀벌 아종이 만든 꽃가루와 벌빵의 영양소 정량화 방법을 알아보세요. 이 기술은 벌빵 소비량과 혈림프 단백질 농도를 측정하여 꿀벌 영양학 연구에 활용됩니다.

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저자는 Mona Chambers, Geoffrey Hidalgo, Maurissa Two Two의 기술 지원에 감사를 표합니다. 또한 아미노산을 분석해 주신 얼 화이트 박사님께, 꽃가루를 살충제로 분석해 주신 로저 시몬즈 박사님께, 그리고 원고의 초기 버전에 대한 검토와 토론을 해주신 스탠리 S. 슈나이더(Stanley S. Schneider) 박사님, 바네사 코비-해리스(Vanessa Corby-Harris) 박사님, 커크 앤더슨(Kirk Anderson) 박사님께도 감사의 말씀을 전합니다.

1. AHB와 EHB 식민지에서 Beebread 구하기 <ol><li> 꿀벌 식민지에서 꽃가루 트랩을 배치하고 꽃가루를 수집합니다. 커피 분쇄기를 사용하여 (꽃밥 창고 꽃가루와 유사) 미세 분말로 꽃가루를 갈기. </li><li> 꿀벌 만 제공 꽃가루에 꼴 있도록 밀폐 된 비행 영역 (EFA)에서 5 식민지 AHB와 EHB의 각을 설정합니다. 꿀벌이 그들 사이에 교차하지 수 있도록 EHB와 AHB 식민지 사이에 표류 근로자를 방지하기 위해 별도의 섹션으로 EFA를 나눕니다. 3,500-4,000 일벌, EFA의 각 섹션에 꿀, 꿀, 미숙 한 종족 빈 빗 왁스 빗 개인 EHB 또는 AHB 식민지를 놓습니다. 참고 : 설립 한 식민지는 꽃가루를 저장하지 않습니다. 즉 꽃가루가 저장되는 속도는 콜로니에 누워 퀸을 포함하지 않음으로써 증가 될 수있다. </li><li> EFA의 각 섹션에있는 화분 트레이를 배치하여 식민지 지상 꽃가루를 공급. 그 foragin 각각의 트레이에 꽃가루 약 60g을 확산g 꿀벌은 그것으로 corbicular 부하를 수집하고 beebread 그들의 식민지에서 꽃가루를 저장할 수 있습니다. 삼주 동안 매일 각 트레이에 신선한 꽃가루를 계속 제공. </li><li> 유럽​​ beebread (EBB)로하고, 아프리칸 beebread (ABB) 등의 아프리칸 식민지에서 유럽의 식민지에서 beebread을 참조하십시오. </li></ol> 케이지 2. 먹이 꿀벌 <ol><li> 환경 방에 별도의 출현 케이지에서 AHB와 EHB 식민지에서 밀봉 된 작업자 종족의 장소 프레임은 32 ~ 34 ° C 및 상대 습도 40 %로 설정 .. </li><li> 노동자가 등장 약 24 시간 이전 인 경우, 12 플렉시 생물 검정 케이지 (치수 = 11.5 X 7.5 X 16.5 cm 3)을 설정하고 100 새로 등장 EHB 각 케이지 (100) 새로 등장 AHB의 일벌 하나를 추가 할 수 있습니다. AHB 공급 ABB, EHB 공급 ABB, AHB 공급 EBB와 EHB 공급 EBB 다음 처리 조합을 생성하기 위해 각 장에 EBB 또는 ABB 중 세포의 알려진 번호 (케이지 당 24-30 세포)와 빗의 섹션을 놓습니다. (4 치료 6치료 당 케이지; 총 24 케이지). </li><li> 각 케이지에 볼륨 공식화 물 튜브 및 50 %의 꿀과 물 솔루션을 추가합니다. 11 일간의 연구 기간 동안 매일 꿀, 물 유리 병 리필. </li></ol> 3. 샘플링 일벌과 Beebread 및 예측 소비 <ol><li> 샘플 (10)는 새로 이전 케이지에 배치에 EHB와 AHB 노동자 나타났다. 일 0 꿀벌 이러한 참조하고는 체액의 단백질 농도에 대한 기준 역할을합니다. </li><li> 그들은 4, 7, 11 일 동안 EBB 또는 ABB에 공급 한 후 각 케이지에서 10 벌을 제거합니다. </li><li> 개별 마이크로 원심 튜브에 라이브 꿀벌을 놓고 얼음 팩에 설정합니다. 체액의 단백질 농도 분석을위한 네 벌의 표본을 선택합니다. </li><li> 데이 11 꿀벌 샘플링 후 여전히 beebread 포함될 콤 셀의 개수를 카운트. 이 beebread 소비의 상대적 척도이다. </li><li> 각 케이지의 셀에 남아있는 beebread를 제거하고 separ에 저장케이지에 따라 마이크로 원심 튜브를 먹었다. pH 나 가용성 단백질 농도 및 아미노산 함량을 분석 할 때까지 -80 ° C에서 beebread 샘플들을 유지. </li></ol> 4. 꽃가루와 Beebread의 pH를 추정 <ol><li> EFA 꿀벌에 공급되는 꽃가루의 여섯 무작위 0.3 g 샘플을 가지고 증류수 300 μL에 용해. +0.01의 정밀도로 방수 이중 접합의 pH 스피어를 사용하여 pH를 측정한다. </li><li> 각 장에 11 일 수유 기간 후에 남아 beebread 0.3 g 샘플을 가져 가라. 꽃가루 (4.1)에 기재 한 바와 같이 증류수와 측정 pH를 300 μL의 beebread을 녹여. </li></ol> 5. 단백질 분석 <ol><li> 여섯 꽃가루의 샘플 및 각 케이지에서 EBB와 ABB의 샘플을 가져 가라. -20 ° C에서 보관 샘플 가용성 단백질 농도에 대해 분석 할 때까지. </li><li> 0.1 M 인산 완충 용액 (PBS) 1000 μL 꽃가루 나 beebread 중 20mg을 섞는다. </li><li> Vo에1 분 동안 571.2 XG에 10 초 원심 분리기의 혼합물을 rtex. </li><li> 96 웰 평평한 바닥 EIA / RIA 폴리스티렌 플레이트의 우물에서 뜨는 장소 10 μL 샘플을 제거합니다. 세 개의 우물에 각각의 샘플을 복제합니다. </li><li> (가열 바늘 날카로운 포인트로 뽑아했다) 날개의 부착 점 근처 흉부의 오른쪽 측면 부분에 20 μL 모세관 튜브를 삽입하여 각 케이지에서 수집 꿀벌에서 체액을 그립니다. 복부 tergites 막 사이에 동일한 관을 삽입하여, 필요한 경우, 추가의 체액 수집. </li><li> 0.1 M PBS의 9 μL에 체액 1 μl를 추가합니다. 수용성 단백질을 분석 할 때까지 -20 ° C에서 체액 솔루션을 저장합니다. </li><li> 상업용 브래드 포드 단백질 분석 키트를 사용하여 총 꽃가루 beebread에서 가용성 단백질의 농도 및 샘플 체액을 결정한다. 제조업체의 지침을 따르십시오. </li><li> 가용성 단백질 C를 추정 표준 곡선을 수립oncentration 소 혈청 알부민 (BSA)에 공지 된 단백질의 단백질 농도를 측정함으로써 흡광도 샘플. 분광 광도계를 사용하여 595 nm에서 흡광도 단백질을 측정한다. </li></ol> 6. 아미노산 분석 <ol><li> 각 식민지의 빗 세포에서 풀 개별 샘플 분석을 위해 EBB와 ABB의 대표 샘플을 만들 수 있습니다. </li><li> 50 mg의 화분을 가지고 가거나 beebread 샘플 오토 샘플러 바이알에 칭량하고, D 4 알라닌 이루어진 50 NG / μL 내부 표준 용액 100 ㎕와 함께 바이알에 1 ㎖ 증류수를 추가하고, (D) 23 -lauric 산, (13) C (6) - 글루코스와 D (39) -arachidiac 산. </li><li> 5 분에 대한 샘플 및 초음파 처리를 모자. </li><li> 1 ml의 메탄올을 첨가하여 HLB 카트리지 상태 나 꽃가루 beebread 시료 1ml를 첨가 한 후, 1 ㎖ 증류수를 첨가하여 평형화. 5.0 %의 메탄올 / H 2 O와 ELU 1 mL로 카트리지를 세척80 % 메탄올 / H 2 O 1 ㎖와 TE </li><li> 질소 기류하에 건조시키는 샘플을 증발시켰다. 피리딘 50 μL 및 N, O 비스 (트리메틸 실릴) 트리 플루오 + 트리메틸 클로로 실란 (TMCS BSTFA +) 100 ㎕로 재구성 샘플. </li><li> 캡을 30 분 동안 70 ° C에서 샘플을 부화. </li><li> 샘플을 냉각하고 깨끗한 오토 샘플러 바이알로 전송할 수 있습니다. </li><li> 질량 선택적 검출기로 캡과 샘플을 배치 휘발성 화합물 및 유기산 모두 샘플을 분석하는 가스 크로마토 그래피에 인터페이스. BSTFA + TMCS는 1.0 μm의 필름 두께의 열 (30 MX 0.25 mm ID)를 사용하여와 TMS 유도체 화 다음 설탕과 유기산을 분리합니다. </li><li> 2 분 동안 50 ℃에서 열 오븐을 설정 한 다음 5 C / 분으로 290 ℃까지 선형으로 온도를 증가시킨다. 7 분 동안 누르고 있습니다. 각각 250 ° C와 290 ° C로 GC 인젝터 및 GC / MS 인터페이스를 설정합니다. <ol><li> 플로에서 캐리어로 헬륨을 사용하여1.0 ml / 분의 속도 w. 230 ° C까지 MS 소스의 온도를 설정합니다. </li></ol></li><li> 조정 및 루오 (PFTBA) 매일 질량 분석기를 교정. 존재에 데이터 및 아미노산의 농도를 얻기 위해 전체 스캔 (35-700 AMU) 양이온 모드 PFTBA 1 μL의 분사를 사용한다. </li></ol>

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전술 한 방법을 사용하여, 우리는 AHB 의해 beebread는 AHB 및 EHB 모두에서 큰 양으로 소비 된 것으로 나타났다. AHB 및 EHB가 beebread 각 유형의 유사한 양을 소비하지만, AHB 높은 체액 단백질 역가를 가졌다. AHB의 체액 단백질 수준이 모두 같은 다이어트 (26)을 투입하고 있지만 EHB보다 더 높은 어디 우리의 방법에 따라 연구 결과는 이전 보고서와 유사 하였다. 모두 EHB AHB 및 의해 다른 속도 및 소비 하였다 EBB ABB 소비를 측정함으로써, 각 종의 체액의 단백질 농도가 증가하고 음식 소비에 의해 발생 될 수없는 것으로 판정 하였다. 간호사 꿀벌 시대의 노동자 체액의 단백질 농도 및 고원의 세트 포인트가 EHB보다 AHB 높다 그 고원이있는 것 같습니다. 꽃가루 저장의 속도를 최적화 beebread 생산을위한 식민지를 구축하기위한 몇 가지 중요한 조건이있다. 먼저, COlonies 오픈 종족과 프레임이 필요합니다. 먹이를 열고 가만히하지 않고, 노동자들은 많은 꽃가루를 수집하지 않습니다. 추가 종족이 생성되지 않도록 둘째, 식민지 queenless해야합니다. 브루드 사육 꽃가루 많은 양을 필요로하고, 과량의 꽃가루에만 저장된다. EFA 년에 설립 된 작은 식민지에서 식민지 queenless해야하므로 종족의 영역이 확장 된 경우 beebread로 저장하는 작은 화분이있을 것입니다. beebread가 이루어질 수 있도록 마지막으로, 꽃가루 corbicular 부하로서 수집 빗 셀들에 저장되어야한다. 꽃가루는 꽃가루 트랩에서 수집 한 경우, 그들이 corbicular로드로 수집 할 수 있도록 꿀벌에 보내기 전에 미세 분말로 분쇄해야합니다. 방법은 beebread의 소비가 아니라 절대 평가보다 질적 생성 측정합니다. 세포가 완전히 꿀벌 빵 비울 때 계산 된 만 소비했다. 총 꿀벌 빵 소비보다 정확한 추정은 꿀벌 BR을 제거함으로써 수득 될 수있다셀로부터 EAD 전과 연구 기간 후에 칭량 수 패티로 만드는. 그러나, 우리는 그들이 식민지에서와 아마 연구 기간 동안 그것을 계속 처리로 꿀벌이 먹이로 할 수 있도록 세포에서 꿀벌 빵을 유지하고 싶었다. 중량이 증가 할 수 있으므로 꿀벌 일부 셀에서 그 공급 꿀을 넣어 희석 때문에 전과 후의 연구 빗 부의 무게의 차이가 소비 추정치로서 사용되지 않았다. 노동자들은 또한 꿀벌의 빵에 희석 꿀의 일부를 추가 할 수도 있습니다. 이러한 이유로, 공급 기간 전후 꿀벌 빵 대략 동일한 양을 함유하는 세포를 계수하고 정성 측정을 생성 하였다. 또 11 일 이후 EBB에 비해 계산 빈 ABB 세포의 수 beebread 두 가지 유형의 사이에 현저한 차이가 있었다. 저장 꽃가루 beebread되는 경우를 결정하는 것은 될 수 있습니다 디꿀벌이 지속적으로 세포에 꽃가루를 추가하기 때문에 fficult. 꿀벌이 꽃가루를 수집 할 수 있도록 생산 beebread에 사용되는 식민지가 열려 종족의 프레임으로 설립되었다. 식민지가 설립 된 후 유충은 약 9 일 동안 먹이가 있었다 있도록하지만, 식민지 queenless이었다. 3 주 동안의 나머지 부분 식민지는 EFA, 수집 된 꿀벌이 저장된 및 beebread로 변환되는 꽃가루에있을 때. 우리에 꿀벌에게 먹이를 가지고 11 일 동안 빗 세포에 저장된 꽃가루를 유지 또한 beebread하는 꽃가루의 처리를 계속 할 수 있습니다. 꿀벌 빵에 꽃가루의 변환은 7 일 정도 8 걸립니다. EHB와 AHB에 공급 beebread는 낮은 pH와 꽃가루 공급에 비해 감소 단백질 농도를 가지고 있었다. 변환 beebread 후 꽃가루의 변화 비슷한 연구 결과는 다른 사람 7,10,27에 의해보고되었다. 우리의 결과는 그러나 이전 보고서 달랐다는 점에서 농도의 차이 O가 있었다beebread과 화분 사이에 F 특정 아미노산. 모두 단백질과 아미노산 농도의 변화는 단백질 분해 효소의 활동으로 인해 수, 소스는 꿀벌 자신이나 beebread 7,8,28,29 년에 설립 된 미생물 군집 수 있습니다. 단백질 농도를 측정하는 데 사용하는 방법은 이전에 아프리칸식이 단백질 및 유럽 꿀벌 (26)의 효과를 결정하기 위해 기술 된 것과 유사 하였다. 방법의 확장으로, 우리는 꽃가루와 beebread에 용해 단백질을 추정 할 수 있었다. 그 방법은 이전 보고서 7,10,27과 유사한 결과를 생성합니다. 우리의 연구 결과는 AHB보다 효율적으로 EHB보다식이 단백질을 흡수하는 것이,이 그것을 이민 30-32 설립되었다 대부분의 지역에서 AHB의 생태 지배의 핵심 요소가 될 수 있다는 추가 증거를 제공합니다.

영양 꿀벌 식민지의 건강과 활력과 인구 그들의 설립에 근본적인 역할을한다. 음식에서 영양소는 에너지와 종족 양육, 체온 조절에 필요한 생화학 적 구성 요소, 꼴을하고 면역 반응을 제공한다. 꿀벌 식민지를 들어, 영양소는 식민지의 인구를 성장하고 자신의 건강 꿀과 꽃가루에서 온 유지하는 데 필요한. 꿀은 탄수화물을 제공하고 꽃가루는 단백질, 지질, 비타민과 미네랄 1과 나머지식이 요법을 제공합니다. 꿀벌의 아종은 근로자의 근속 기간, 브루 양육, 사회 면역 2-6의 메커니즘으로 영양 기반 식민지 수준의 매개 변수에 차이가 있습니다. 이러한 차이는 음식, 특히 꽃가루가 식민지에 의해 처리와 개인에 소화 방법에 연결 될 수 있습니다. 꽃가루 화학적 변화 빗 세포에서 미생물 및 매개 락트산 산 발효 저장된 <sup&gt; 7-10. 발효 꽃가루는 beebread라고합니다. 이 그들이 수집 꽃가루와 상점에서 양분을 획득 할 수있는 능력의 아종 중 유전자형 차이가있을 수 있습니다 이것은 식민지의 성장과 생존에 영향을 미칠 수 있습니다. 식품 가공 및 영양 인수에 대한 유전자형 효과는 같은 음식을 11 ~ 14을 소비하면서 어떤 사람들은 다른 사람보다 더 많은 영양분과 칼로리를 얻는 원인이 다른 생물에 설명되어있다. 여기에서 우리는 꿀벌의 다른 아종에​​ 의해 조성과 beebread의 소비를 비교하는 데 사용 방법을 설명합니다. 방법은 일벌의 결과 체액 단백질 역가에 대해서도 설명을 측정합니다. beebread의 영양 성분에 대한 이전의 연구는 유럽 꿀벌 (EHB) 10,15,16 수행 하였다. 그러나이 같은 꽃가루에 공급하는 경우에도 다른 종의 꿀벌에 의해 만들어진 beebread의 차이가있을 수 있습니다. EHB와 AHB 비교 하​​였다 이러한 잠수정 때문에pecies은 식품 가공 및 영양 인수 (17)과 관련 될 수 별개의 행동 및 생리 학적 차이가있다. 가장 주목할만한 차이점 중 일부는 AHB 수집하고 EHB보다 더 많은 꽃가루를 소비하고 자식 들아 (18)에 더 쉽게 변환 할 것 점이다. AHB의 식민지 EHB보다 높은 득시글 거리는 속도를 가지고 음식 자원이 제한된 19 ~ 23이 될 때 도주. Absconding는 EHB에 드물다. AHB는 EHB (24)보다 더 높은 신진 대사 속도를 가지고있다. EHB와 AHB의 식민지 수준의 차이에 대한 영양 기준은 또한 그것의 영양 내용이 beebread로 변환 한 후 (예를 들어, 아미노산 및 단백질)에 꽃가루 수집의 비율과 관련이있을 수 있습니다. Beebread 소비하고, 생성 된 단백질은 또한 획득 EHB AHB 및 콜로니 간의 레벨 차이의 역할을 할 수도있다. 개발 된 방법을 사용하여, EHB와 AHB는 같은 꽃가루 소스에서 beebread했다. beebread 후 EAC의 꿀벌에 다시 공급 하였다시간의 종과 꿀벌 자신의 아종 또는 beebread의 소스에 독특한 방식으로 beebread에서 단백질을 취득 여부를 확인 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>방수 이중 접합 pH 스피어&nbsp;</td><td>써모 피셔</td><td></td><td></td></tr><tr><td>커피 그라인더</td><td>Mr. Coffee&nbsp;</td><td>모델 1DS77</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco의 인산염 완충 용액</td><td>Emd-millipore</td><td>BSS-1005-B</td><td></td></tr><tr><td>EIA/RIA 폴리스티렌 플레이트</td><td>Sigma-Aldrich-Corning</td><td>CLS3590-100EA</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 모세관 피펫</td><td>Kimble Glass Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>빠른 시작 Bradford 단백질 분석 키트 2&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>#500-0202</td><td></td></tr><tr><td>분광광도계</td><td>Biotek Synergy HT&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>질량 선택 검출기&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>5973N</td><td></td></tr><tr><td>HLB 카트리지</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>가스 크로마토그래프&nbsp;</td><td>애질런트</td><td>6930</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 가스 크로마토그래피 컬럼&nbsp;</td><td>에이제이앤드; W 사이언티픽&nbsp;</td><td>DB-1701</td><td></td></tr><tr><td>d4-알라닌&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>488917</td><td></td></tr><tr><td>d23-lauric acid</td><td>시그마-알드리치</td><td>451401</td><td></td></tr><tr><td>13C6-glucose</td><td>시그마-알드리치</td><td>389374</td><td></td></tr><tr><td>피리딘&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>270970</td><td></td></tr><tr><td>N,O-Bis (트리메틸실릴)트리플루오로아세트아미드 +&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>트리메틸클로로실란 (BSTFA + TMCS)</td><td>시그마-알드리치</td><td>33148</td><td></td></tr><tr><td>퍼플루오로트리틸아민 (PFTBA)</td><td>시그마-알드리치</td><td>442747-U</td><td></td></tr><tr><td>d39-아라키디악산</td><td>케임브리지 동위원소&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

아프리칸 유럽 꿀 꿀벌에 의해 만들어 beebread의 영양소를 비교하는 방법과하는 hemolymph 단백질 역가에 미치는 영향

Methods for Comparing Nutrients in Beebread Made by Africanized and European Honey Bees and the Effects on Hemolymph Protein Titers

꿀벌은 beebread로 하이브가 수집 꽃가루와 저장소에서 영양분을 얻을 수 있습니다. 우리는 꿀벌 수집하고 특별히 제작 된 밀폐 비행 지역에 식민지를 배치하여 beebread로 변환 꽃가루 소스를 제어하는​​ 방법을 개발했다. 방법은 꽃가루 beebread의 단백질과 아미노산 성분을 분석하기 위해 개발되었다. 또한 beebread 소비 및 측정 방법이 출현 한 후 4, 7, 11 일 동안 먹이 beebread 후 성인 작업자 꿀벌 체액 단백질 역가를 결정하는 데 사용하는 방법을 설명 하였다. 방법은 유전자형이 beebread 꽃가루의 변환 및 꿀벌 소비하고 그것에서 단백질을 획득 속도에 영향을 미치는지 확인하기 위해 적용되었다. 두 아종 (유럽과 아프리칸 꿀벌 각각 EHB 및 AHB)이 같은 꽃가루 소스와 함께 제공되었다. 개발 된 방법에 따라, 두 종에 의해 beebread는 꽃가루 단백질보다 낮은 농도 및 pH 값을 가졌다. 일반적으로, 산 사기꾼 아미노하나 EHB 또는 AHB에 의해 beebread에 centrations은 비슷했다 꽃가루보다 beebread 높은 수준에서 발생했습니다. AHB와 EHB 모두 EHB보다는 AHB에 의해 beebread의 훨씬 더 많은 소비. EHB와 AHB는 beebread의 각 유형의 비슷한 금액을 소비하지만, AHB의 체액 단백질 농도는 EHB에 비해 높았다. AHB와 EHB 사이의 단백질 수집의 차이는 각 종에서 진화 지리적 영역과 관련된 환경 적응을 반영 할 수 있습니다. 이러한 차이 때문에 종족 양육과 식민지의 성장에 미치는 영향의 새로운 세계 AHB 인구의 성공적인 구축에 기여할 수있다.

<html> Beebread 단백질은 pH 및 농도에 대해 분석되기 전에 이하 개월 -80 ° C에 저장하고, 아미노산 분석 전에 약 4 개월간 하였다. Beebread는 pH와 단백질 농도 (그림 1)에서 꽃가루 달랐다. 단백질 농도이었던 것에 beebread의 pH는 꽃가루보다 낮았다. EHB와 AHB 모두 EBB (그림 2)보다 더 많은 ABB 소비. AHB의 체액에 용해 단백질의 수준에 관계없이 소비 beebread의 유형 (그림 3)의 EHB보다 유의하게 높았다. EHB와 AHB는 beebread의 각 유형의 비슷한 양의 소비에도 불구하고 체액의 단백질 수준에서 이러한 차이가 발생했습니다. 샘플링시의 꿀벌의 나이 크게 체액에서 가용성 단백질의 농도에 영향을 미쳤다. 단백질 농도는 차이가 없었다 일-7 또는 11에 비해 하루 4 벌에서 유의하게 낮았다. 꿀벌에 필수적인 10 아미노산 _content는 &quot;&gt; 히스티딘 제외한 모든 화분에서 검출된다. 대부분의 경우, beebread 측정 아미노산 농도 (도 4). 예를 들어, 농도 꽃가루보다 높았다 류신 트레오닌 꽃가루와 비교 beebread 약 60 % 이상이었고, 발린 농도는 약 25 % 높았다. 알라닌, 아스파르트 산, 글루타민, 메티오닌 수준도 꽃가루보다 beebread에서 높았다. 아미노산 농도 사이 크게 다르지 않았다 페닐알라닌과 시스테인을 제외하고 ABB와 EBB. 페닐알라닌 수준이 EBB 또는 화분 하나에 비해 ABB의 두 배 정도 높았다. 시스테인 농도는 ABB 또는 꽃가루에 비해 EBB에서 낮았다. 트립토판은 높은 농도의 유일한 아미노산 존재했다 EBB 또는 꽃가루와 ABB의 프롤린의 ABB. 농도보다 꽃가루 EBB보다 높았다. 그림 1 : 산도 (A)와 꽃가루에 용해 단백질 농도 (B)과 유럽 (EHB) 또는 아프리칸 ​​(AHB) 꿀벌에 의해 만들어진 beebread의 비교. 꽃가루의 pH가 분산 분석에 의해 측정 beebread보다 유의하게 높았다 (F 2,12 = 3725, p &lt;0.0001) Tukeys W- 다중 비교 시험 하였다. 화분의 단백질 농도는 EHB (EBB) 또는 AHB (ABB)에 의해 beebread에 비해 유의하게 높았다 (F 2,27 = 16.49, P &lt;0.0001). 같은 문자 뒤에 수단은 0.05 수준에서 유의 한 차이가 있습니다. <img alt="그림 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52448/52448fig2highres.jpg" width="600" /> 그림 2 : CEL의 평균 비율완전히 갇힌 꿀벌에 의해 11 일 간격으로 소비 된 beebread를 포함한 LS. beebread이 같은 꽃가루 소스를 사용하거나 유럽 (EHB) 또는 아프리칸 ​​(AHB) 꿀벌에 의해 만들어졌다. 수단은 각 치료의 다섯 케이지에서 추정되었다; 분산의 한 방법 분석 (F 3,16 = 7.3, P = 0.003)과 Tukey의 W 시험에 의해 결정과 같은 문자들은 0.05 수준에서 유의 한 차이가 있습니다. 이 그림은 25에서 수정되었습니다. <img alt="그림 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52448/52448fig3highres.jpg" width="600" /> 그림 3 : 4, 7, 11 일 동안 유럽 (EBB) 또는 아프리칸 ​​(ABB) 꿀벌에 의해 만들어진 유럽 (EHB) 또는 아프리칸에서 체액에서 단백질의 평균 농도 (AHB) 꿀벌 공급 beebread의 반복 측정 분석. 분산은 네 누 사이에 유의 한 차이를 나타내tment 그룹 (F 3,20 = 19.7, P &lt;0.001). AHB 공급 ABB에 용해 단백질의 수준은 EHB 공급 ABB (P = 0.008) 또는 EBB (P = 0.018)보다 유의하게 높았다. 샘플링시의 꿀벌의 나이 크게 체액에서 가용성 단백질의 농도에 영향을 미쳤다. 레벨은 하루 7 (P &lt;0.0001) 또는 11 (P = 0.001)에 비해 하루 4 벌에서 유의하게 낮았다. 7 일 및 day11 꿀벌 (P = 0.149) 차이가 없었다. 이 그림은 25에서 수정되었습니다. <img alt="그림 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52448/52448fig4highres.jpg" width="600" /> 그림 4 :. 아미노산의 농도 (꽃가루 그램 당 μg의 또는 beebread) 꽃가루 또는 EBB 만든 beebread 유럽 꿀벌에 의해 만들어 beebread되고 ABB는 아프리칸 ​​꿀벌에 의해 만들어졌다. 트립토판, 시스테인, 페닐알라닌과 프롤린은 사전에 명확성의 목적을 그린다했다자신의 양을 공무 원. 이 그림은 25에서 수정되었습니다.

다음은 꿀벌의 두 아종에 의해 꽃가루가 양봉가로 전환되기 전과 후의 꽃가루의 영양분을 정량화하는 방법입니다. 우리는 두 아종 모두에서 꿀벌빵 섭취와 그에 따른 단백질 역가를 측정하는 기술을 설명합니다.

아프리칸 유럽 꿀 꿀벌에 의해 만들어 Beebread의 영양소를 비교하는 방법과하는 Hemolymph 단백질 역가에 미치는 영향

Honey bees obtain nutrients from pollen they collect and store in the hive as beebread. We developed methods to control the pollen source that bees ...

다음 실험의 전반적인 목표는 두 가지 꿀벌 아종이 생성한 화분과 비 브레드(bee bread) 내의 영양소를 정량화하고, 단백질 역가의 소비량을 측정하는 것입니다. 이를 위해 한정된 구역에서 유럽꿀벌과 아프리카꿀벌에게 동일한 화분원을 제공하여 벌들이 화분을 군집 내에 비 브레드 형태로 저장하도록 합니다. 그다음, 케이지에 있는 갓 부화한 유럽꿀벌과 아프리카꿀벌에게 이 비 브레드를 급여합니다.그 후 케이지 내의 벌들을 급이 4일, 7일, 11일 후에 샘플링하고, 각 케이지에 남은 비브레드(bee bread)의 양을 측정하여 소비량을 추정합니다. 마지막으로, 유럽꿀벌과 아프리카화꿀벌이 만든 화분 및 비브레드 내의 단백질과 아미노산을 포함한 영양소 농도를 측정하고 벌 품종 간에 비교합니다. 결과에 따르면 비브레드는 단백질 및 일부 아미노산 농도뿐만 아니라 혈림프 단백질 역가에서도 화분과 차이를 보입니다.이 방법은 화분 공급원이 비브레드(bee bread) 내 영양소에 미치는 영향과 서로 다른 아종 및 유전형의 벌들이 이러한 영양소를 어떻게 획득하는지와 같이 꿀벌 영양 연구의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 기술 시연은 본 연구실의 학생 기술자인 Emily Watkins de Young이 맡았습니다. 시작 단계로, 꿀벌 군집에 화분 트랩을 설치하여 화분을 수집하고, 커피 그라인더를 사용하여 화분을 고운 가루로 분쇄합니다. 이후 폐쇄형 비행 구역(EFA) 내에 아프리카 꿀벌(AHB) 또는 유럽 꿀벌(EHB)로 구성된 5개의 군집을 각각 조성하여, 일벌이 EHB 군집과 AHB 군집 사이를 이동하는 것을 방지하고 벌들이 제공된 화분만 채집하도록 합니다. EFA를 별도의 구역으로 나누어 벌들이 서로 교차하지 못하게 하며, EFA의 각 구역에 3,500~4,000마리의 일벌, 넥타 꿀이 포함된 밀랍 빗집, 미성숙 유충 및 빈 빗집이 있는 개별 EHB 또는 AHB 군집을 배치합니다. EFA의 각 구역에 트레이를 놓고 약 60 g의 분쇄된 화분을 트레이 위에 펼쳐 놓아 군집에 공급합니다.이러한 방식으로, 채집벌은 화분을 화분단으로 수집하여 벌집에 비브레드로 저장함으로써 케이지 내의 벌들에게 먹이를 제공할 수 있습니다. HB 및 EHB 군집에서 채취한 봉인된 일벌 유충 소광을 32~24°C의 온도와 40% 상대 습도로 설정된 환경실 내의 개별 우화 케이지에 배치합니다. 일벌이 우화한 후 약 24시간이 지나면, 12개의 플렉시글라스 생물 분석 케이지를 설치하고 각 케이지에 새로 우화한 EHB 또는 HB 일벌 100마리를 추가합니다. 그 후, 다음과 같은 처리 조건을 생성하기 위해 알려진 수의 European Bbr 또는 EBB 또는 Africanized B bread 또는 A B, B 세포가 포함된 벌집 섹션을 각 케이지에 배치합니다.HB 사육군, A-B-B-E-H-B 사육군, A B 사육군, BAHB 사육군, EBB 사육군 및 EHB 사육군에 대해 각각 급여하였습니다. EBB 군의 각 케이지에 물과 부피 기준으로 조제된 30% sucrose 용액 바이알을 추가합니다. 11일의 연구 기간 동안 설탕 시럽과 물 바이알을 매일 교체하십시오.케이지에 넣기 전, 갓 우화한 EHB 및 A HB 일벌에서 각각 10마리의 샘플을 채취하십시오. 이를 0일차 B로 지정하고 혈림프 단백질 농도의 기준선으로 사용하십시오. EBB 또는 B, B를 4일, 7일, 11일 동안 섭식시킨 후 각 케이지에서 벌 10마리를 제거하십시오.살아있는 벌들을 각각의 팔콘 튜브에 넣고 아이스팩 위에 올려둡니다. 11일 차에 벌을 샘플링한 후, 혈림프 단백질 농도 분석을 위해 벌 4마리를 부표본으로 선택하고, 벌 빵이 여전히 들어있는 소방의 수를 셉니다. 각 케이지의 소방에 남아있는 벌 빵을 제거하여 케이지별로 각각의 마이크로 원심분리 튜브에 보관합니다.pH 가용성 단백질 농도 및 아미노산 함량을 분석할 때까지 BBR 시료를 -80 °C에서 보관하십시오. 단백질 분석을 수행하려면, 각 케이지에서 화분 시료 6개와 EBB 및 A BB 시료를 각각 1개씩 채취합니다. 화분 또는 BBR 20 mg을 0.1 M PBS 1 mL와 혼합한 후, 10초 동안 볼텍싱하고 571.2 ×g에서 1분간 원심 분리합니다.S 상층액 샘플 25 µL를 취하여 96-웰 평저 polystyrene ELISA 플레이트의 웰에 넣습니다. 각 샘플을 세 개의 웰에 반복 측정합니다. 20 µL 모세관의 끝부분을 가열한 후, 가열된 부분이 바늘처럼 뾰족해질 때까지 잡아당깁니다.그 다음, 각 케이지에서 수집한 벌의 흉부 우측 외측 날개 부착 부위 근처에 모세관을 삽입하여 혈림프를 채취합니다. 필요한 경우, 동일한 관을 복부 사이의 막에 삽입하여 추가 림프를 수집하십시오. 1 µL의 혈림프를 9 µL의 0.1 M PBS에 추가합니다.Bradford 단백질 분석 키트를 사용하여 제조사의 지침에 따라 총 수용성 단백질 농도를 측정하십시오. 텍스트 프로토콜에 따라 아미노산 분석을 수행하십시오. 이 그래프들에 나타난 바와 같이, pH 값과 단백질 농도 모두 pollen보다 bbr에서 더 낮았습니다. 여기서 입증된 것처럼, EHB와 A HB 모두 EBB보다 더 많은 A BB를 소비했습니다.소모한 bbr의 종류와 관계없이 A HB의 혈림프 내 수용성 단백질 수치는 EHB보다 유의하게 높았습니다. 이러한 혈림프 단백질 수치의 차이는 EHB와 A HB가 각 bbr 종류를 유사한 양으로 섭취했음에도 불구하고 나타났습니다. 꿀벌에게 필수적인 10가지 아미노산 중 histamine을 제외한 모든 아미노산이 화분에서 검출되었습니다.대부분의 경우, 비브레드(bee bread)에서 측정된 아미노산 농도가 화분보다 높았습니다. 예를 들어, leucine과 thionine의 농도는 화분과 비교하여 비브레드에서 약 60% 더 높았으며, valine 농도는 약 25% 더 높았습니다. Alanine, aspartic acid, glutamine의 수준 또한 화분보다 비브레드에서 더 높게 나타났습니다.페닐알라닌과 시스틴을 제외하면, A B, B 및 EBB 간의 아미노산 농도는 큰 차이가 없었습니다. 페닐알라닌 수치는 EBB 또는 화분과 비교했을 때 A BB에서 약 2배 더 높았습니다. 시스틴 농도는 A, B, B 또는 화분과 비교하여 EBB에서 더 낮았습니다.이 영상을 시청하신 후에는 비브레드(bee bread), 화분, 그리고 꿀벌 혈림프의 단백질 농도를 평가하는 방법을 충분히 이해하시게 될 것입니다. 이러한 기술을 통해 먹이의 저장 및 소비와 혈림프 단백질 농도가 유전적 또는 환경적 요인에 의해 영향을 받는지 확인할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 프로토콜에서는, 우리는 동시에 꿀벌 두 개의 유전자 (더블 유전자 최저를) 억제 두 가지 전략에 대해 설명합니다. 그럼 우리는 꿀벌 미각 지각을 두 번 유전자 최저의 효과를 연구하는 코 확장 응답 (PER) 분석을 사용하는 방법을 제시한다.

꿀벌의 RNAi를 매개로 두 유전자 넉다운과 미각 지각 측정 (<em&gt; 아피스 mellifera</em&gt;)

단백질은 분산 연구를 위해 절지동물을 표시하는 데 자주 사용됩니다. 절지동물에 내부 및 외부 단백질 표시를 관리하는 방법이 입증됩니다. 간접 또는 샌드위치 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)을 통한 단백질 마크 검출 기술도 설명되어 있습니다.

관리 및 분산 연구를위한 절지 동물에 단백질 마크를 검출

용액의 영양분과 독소에 대해 자유롭게 움직이는 호박벌(Bombus terrestris)의 입 부분의 단기 미각 반응을 조사하기 위한 새로운 행동 분석법이 설명되어 있습니다.

소설 행동 분석은 (엉망으로 꿀벌을 자유롭게 이동 개인의 미각 응답을 조사하기<em&gt; 뒤의 terrestris</em&gt;)

여기에서 우리는 단일 코호트 꿀벌 식민지의 제조를위한 우리의 상세한 프로토콜을 설명 - 롤 관련 근로자의 생리를 분석하기위한 유용한 도구입니다. 우리는 또한 작업자의 행동 및 / 또는 생리 조절에 이러한 호르몬의 참여를 평가하기 위해 청소년 호르몬과 에크 디손과 근로자를 치료하기위한 상세한 프로토콜을 설명합니다.

단일 코호트 식민지와 노동자 꿀벌의 호르몬 치료의 준비 역할 및 / 또는 내분비 시스템과 생리학 관련 분석하기

범블 비 하이브 내 미생물 컨소시엄 풍부 하 고 꽃가루 꿀벌 애벌레에 대 한 유지. 살 균 제 잔류물 꽃가루 미생물, 및 궁극적으로 식민지로 이어지는 식민지 인구 통계를 변경 하는 가설을 테스트 하는 데 사용 하는 프로토콜을 설명 합니다이 원고 실험실 및 필드 기반 실험 다음 세대 시퀀싱을 사용 하 여 손실입니다.

실험, Metagenomic, 및 계산 기법 밝히는 어떤 균 타협 꿀벌 건강 메커니즘

여기에서 우리는 제시   방법은 개별 꿀벌과 벌집 콜로니 모두 농약 오염 된 식품을 공급한다. 절차는 기본 유생 다이어트 생체 공급함으로써, 또한 벌집 콜로니의 자연 상태에서 개별 꿀벌의 살충제 효과를 평가한다.

식민지 수준에 개인에서 꿀 꿀벌 개발에 대한 환경 화학 물질의 효과를 평가

꿀벌 두뇌의 다른 지역에서 phospholipase C (PLC)에 pharmacologic 에이전트의 억제 효과 테스트 하려면 우리는 그 지역에서 PLC 활동을 측정 하는 생 화 확 적인 분석 결과 제시. 이 분석 결과 PLC 활동 조직 들 뿐만 아니라 다른 행동을 전시 하는 꿀벌 들을 비교 하는 데 유용 수 있습니다.

꿀벌에서 두뇌 Homogenate에서 Phospholipase C 활동의 탐지

Hypopharyngeal 선 acinus 크기 간호사 꿀 꿀벌 영양의 강력한 척도 이다. 여기, 우리는 해 부, 얼룩, 이미징, 및 간호사 꿀벌 hypopharyngeal 선 acini 측정에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다.

꿀 꿀벌 (Apis mellifera) 노동자의 Hypopharyngeal 동맥 Acinus 크기 측정

이 프로토콜은 농약이 꿀벌(아피스 멜라이프라)재생에 미치는 이해를 향상시키기 위해 개발되었으며, 꿀벌 여왕과 그 노동자 관리인을 통제 된 실험실 환경에서 농약에 노출시키는 방법을 확립하고 관련 반응을 주의 깊게 모니터링합니다.

꿀벌 여왕을 짝짓기하는 농약적 위험 평가

우리는 후속 분석을 위해 작은 절지동물에서 정량화 가능한 혈림프를 효율적으로 수집하는 방법을 설명합니다.

작은 절지동물에서 체림프를 수집하기 위한 정확하고 정량화 가능한 방법

학습하세요 유럽 및 아프리카 꿀벌 아종이 만든 꽃가루와 벌빵의 영양소 정량화 방법을 알아보세요. 이 기술은 벌빵 소비량과 혈림프 단백질 농도를 측정하여 꿀벌 영양학 연구에 활용됩니다.

아프리칸 유럽 꿀 꿀벌에 의해 만들어 Beebread의 영양소를 비교하는 방법과하는 Hemolymph 단백질 역가에 미치는 영향

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