도구로 아데노 관련 바이러스를 사용하여 질병 망막 장벽을 연구하는

본 절차의 전체적인 목적은 망막 질환 동물 모델에서 혈액-망막 장벽의 투과성과 내경계막의 무결성을 조사하는 것입니다. 이는 먼저 GFP 트랜스진을 포함하는 AAV 입자를 유리체 또는 혈류에 주입함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 주입 후 서로 다른 시점에서 혈액 샘플을 채취하는 것입니다.

혈액 샘플링은 매주 수행하는 생체 내 안저 영상 촬영으로 보완됩니다. 마지막 단계로 망막 평면 표본 및 망막 냉동 절편에 대해 면역조직화학 염색을 수행합니다. 최종적으로, 공초점 현미경 관찰과 PCR을 통해 ILM 무결성을 나타내는 형질전환 패턴을 보여주고 혈류 내 AAV 입자를 검출하여 혈액-망막 장벽의 투과성을 입증합니다.

기존 방법인 본 기술의 주요 장점은 AAV 페이스트법(paste method)이 다른 세포들이 제공하지 않는 혈액-망막 장벽 투과성에 관한 정보를 제공한다는 점입니다. 이 기술의 함의는 AAV 매개 유전자 치료로 확장되는데, 이는 AAV 입자에 대한 혈액-망막 장벽의 투과성을 확인하여 바람직하지 않은 부작용을 방지하는 데 도움을 주기 때문입니다. 또한, 이 방법은 당뇨병 쥐와 같은 다른 망막 질환 동물 모델에서 내경계막의 무결성에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다.

혈액-망막 장벽(blood retina barrier)의 붕괴를 보이는 DP 71 결핍 마우스 모델의 망막이 야생형 망막보다 더 효율적으로 형질전환되는 것을 확인했을 때, 이 방법에 대한 첫 아이디어를 얻었습니다.

C-57 black-six J 마우스를 마취하는 것으로 시작하십시오. 정위 반사, 회피 반사 및 꼬리 꼬집기 반응의 세 가지 반사가 소실되었는지 확인하십시오.

이러한 반사 반응의 소실은 마취가 완료되었음을 확인시켜 줍니다. 다음으로 드롭퍼를 사용하여 각막에 5% neosynephrine과 0.5% mydriaticum을 도포하여 동공을 확장시킵니다. 그런 다음 안구가 너무 건조해지지 않도록 수의학용 연고를 사용하여 눈을 윤활합니다. 이제 1~4 × 10¹¹ particles의 AAV-GFP가 포함된 스톡 솔루션을 30 gauge 초미세 일회용 바늘에 충전합니다.

일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 사람들은 수정체나 망막을 건드리지 않고 가장 안전하게 유리체 내 주사를 시행해야 하므로 어려움을 겪을 수 있습니다. 그 다음, 30 gauge 일회용 초미세 바늘을 적도부와 각막연 근처를 통해 유리체강 내로 삽입합니다. 바늘을 안구에 삽입한 후, 바늘이 유리체강 중심에 위치한 것을 확인하면서 1 µL의 용액을 주입합니다.

내경계막 실험의 경우 한쪽 눈을 대조군으로 사용하고, 혈액-망막 장벽 실험의 경우 양쪽 눈 모두에 주입합니다. 주입 후, 주입된 각 눈에 항염증제 및 항균성 국소 치료제를 도포합니다. 일주일 후, 네오시네프린(neosynephrine)과 산동제(mydriaticum)로 동공을 확장시키고 안저 카메라를 사용하여 안저 검사를 수행합니다.

주사 후 1주, 2주, 1개월 및 2개월 시점에 관찰하여 GFP 발현을 추적합니다. 안락사시킨 주사 투여 동물의 안구를 적출한 후, 안구를 해부하여 수정체와 각막을 제거합니다. 그다음 해부된 안구를 4% paraformaldehyde에 1시간 동안 침지 고정합니다. 1시간 후, 실온에서 10% sucrose로 1시간 동안 안구를 동결 보호합니다. 이어서 실온에서 20% sucrose에 20분 동안 안구를 담급니다.

마지막으로, 안구를 30% sucrose 용액에 넣고 4°C에서 하룻밤 동안 둡니다. 다음 날, 안구 컵을 cryo-matrix와 같은 임베딩 레진에 넣어 동결 임베딩합니다. 그 다음 cryostat을 사용하여 10 µm 두께로 절편을 제작하고, 이를 동결 조직용 슬라이드에 부착합니다.

이제 슬라이드 위의 절편들을 세제로 5분 동안 투과화합니다. 이어서 PBS로 짧게 두 번 세척합니다. 그런 다음 실온에서 1시간 동안 안구를 블로킹합니다.

망막 평면 마운트를 위해, 적출한 안구를 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)에 15~30분 동안 고정하여 해부를 용이하게 합니다. GFP 형광을 보존하는 것이 매우 중요하므로, 이 초기 고정과 해부 후의 고정 과정이 적절히 수행되어야 합니다. 고정 시간이 15~30분 경과하면 안구를 해부하여 각막과 수정체를 제거합니다.

톱니가장자리(ora serrata)와 시신경 주변을 절개하여 망막을 망막색소상피 및 공막으로부터 분리합니다. 박리 후, 망막을 4% Para formaldehyde에 30분 동안 더 침지하여 조직과 형질전환된 망막 세포 내의 형광 단백질을 고정합니다. 고정이 완료되면, pH 7.4의 멸균 PBS로 시료를 5분 동안 세척합니다.

그 다음 PBS를 블로킹 버퍼로 교체하고 망막을 실온에서 4시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 블로킹 버퍼에 희석된 1차 항체와 함께 샘플을 실온에서 4시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 배양하여 라벨링 단계를 시작합니다. 1차 항체를 처리한 후, 조직을 PBS로 3회 세척한 다음 블로킹 버퍼에 1:500 비율로 희석된 Alexa Fluor 접합 항체와 함께 조직을 배양합니다.

냉동 절편의 경우 1시간, 평면 표본(flat mount)의 경우 2시간 동안 배양합니다. 이 과정은 실온에서 진행하며 빛으로부터 보호하십시오. 2차 항체를 처리한 후, 이전과 같이 PBS로 3회 세척하여 제거합니다.

이제 망막에 보조 절개(relieving cuts)를 가하여 광수용기 또는 망막 신경절 세포가 위를 향하도록 유리 슬라이드 위에 평평하게 고정할 수 있게 합니다. 수성 마운팅 매질과 커버 슬립을 덮습니다. 제작된 슬라이드는 공초점 현미경 이미징 전까지 4 °C에서 보관할 수 있습니다.

순환 AAV 입자를 위한 양성 대조군 생성부터 시작합니다. 먼저, AAV를 주입하기 전에 10~20 µL의 혈액 샘플을 채취합니다. 그 후 마취가 되면 100 µL의 스톡 바이러스 용액을 혈류에 주입합니다.

혈류로 물질을 주입하는 더 쉬운 방법은 음경 정맥을 이용하는 것입니다. 본 영상 캡처에서는 주입 확인을 위한 시각적 대조군으로 청색 염료를 주입합니다. 이후 3일 동안 주기적으로 소량의 혈액 샘플을 채취한 다음 마우스를 희생시킵니다. 조직 샘플에서 상용 키트를 사용하여 게놈 DNA를 추출하고, 해당 DNA를 사용하여 GFP 프라이머 쌍으로 PCR 증폭을 수행합니다. 45초의 신장(extension) 단계와 55 °C의 어닐링(annealing) 단계로 30 사이클을 진행합니다. SHH 10 벡터의 형질도입 패턴은 DP 71 null-마우스에서 증가할 것으로 예상되었습니다. 만약 동물 모델이 내부 한계막 구조의 섭동을 보였다면, DP 71 null 마우스는 망막 장벽이 손상되었으므로 유용한 비교 대상이 됩니다. DP 71 null 마우스의 유리체 내 SHH 10 주입은 뮐러 글리아 세포를 더 효율적으로 표적합니다.

이는 야생형 대조군과 비교하여 이 형질전환 마우스 라인에서 내경계막의 불안정화를 나타냅니다. AAV5-GFP를 주입한 결과 내경계막의 투과성 또한 확인되었습니다. AAV5는 야생형 마우스의 유리체 내 주입으로는 효과가 없었으나, DP 71 null 마우스와 같이 망막 장벽이 손상된 마우스에서는 광수용체로의 유전자 전달 효과가 강력하게 나타났습니다.

PCR 분석 결과, 유리체 내 주입 후 혈액 샘플에서 AAV의 흔적이 발견되지 않았으므로 DP 71 결손 마우스의 혈액-망막 장벽은 AAV 입자에 대해 선택성을 유지하는 것으로 나타났습니다. 이 영상을 시청하신 후에는 망막의 형질전환 패턴이나 혈류 내 AAV 입자의 존재 여부를 분석함으로써 내경계막의 무결성 또는 혈액-망막 장벽의 투과성을 테스트하기 위해 아데노 부속 바이러스를 사용하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.